本發(fā)明涉及提取蛋白質(zhì)的技術(shù)領(lǐng)域，是一種提取兔毛纖維中角蛋白的方法。

背景技術(shù)：

角蛋白材料是天然蛋白質(zhì)，具有優(yōu)良的生物的親和性，親膚性以及無(wú)毒性，其內(nèi)含大量的親水性基團(tuán)。在生物醫(yī)藥、紡織業(yè)、工程領(lǐng)域和美容等的應(yīng)用表現(xiàn)出良好的前景。角蛋白廣泛存在于動(dòng)物的羽毛、毛發(fā)、指甲等的角蛋白質(zhì)屬于外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，而且角蛋白資源含量相當(dāng)豐富。角蛋白在正常條件下都不溶于水、稀酸、稀堿或鹽溶液。這些角蛋白通常情況下不能被動(dòng)物所利用，要角蛋白在高溫、高壓以及酸堿酶處理后水解為游離的氨基酸，短肽才能被動(dòng)物所用。角蛋白含有較多的胱氨酸，其含二硫鍵也隨之增多。由于這些二硫鍵在蛋白質(zhì)肽鏈中起交聯(lián)作用，因此角蛋白的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，并有高機(jī)械強(qiáng)度，被認(rèn)為具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量穩(wěn)定的潛在優(yōu)質(zhì)蛋白源。

兔毛是一種性能優(yōu)良的動(dòng)物纖維，具有質(zhì)地柔軟，光滑輕薄，潔白鮮亮，保暖性，透氣性和吸濕性較好等優(yōu)點(diǎn)，是非常好的紡織原料。但是在紡織加工過(guò)程中，由于兔毛纖維本身的特性，出現(xiàn)了許多的落毛，如果廢棄，不僅污染環(huán)境，而且浪費(fèi)了寶貴的蛋白中的氨基酸資源。兔毛纖維作為一種動(dòng)物纖維，蛋白質(zhì)含量在90％以上，是提取角蛋白的良好材料。然而，目前提取角蛋白的方法有多種，其中還原法是效果較好，最為廣泛使用的，常用的還原劑有巰基乙醇、tcep、和亞硫酸氫鈉等，前兩種為具有毒性的還原劑，而亞硫酸氫鈉提溶解率較低，都存在著各種各樣的問(wèn)題。因此，尋找一種新的提取角蛋白方法是迫切需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述存在的問(wèn)題提供一種采用半胱氨酸作為還原劑法從兔毛中提取角蛋白的方法。通過(guò)本發(fā)明的制備方法，兔毛溶解率高達(dá)74.12％，最后提取的兔毛角蛋白純度高達(dá)91.75％。

附圖說(shuō)明

圖1兔毛角蛋白的雙縮脲反應(yīng)顯色反應(yīng)

圖2兔毛角蛋白的紅外光譜圖

提取工藝

本發(fā)明是采用半胱氨酸作為還原劑從兔毛纖維中提取角蛋白，具體操作工藝

如下：

預(yù)處理取5g兔毛泡在溫水中反復(fù)清洗除去纖維中含有的少量雜質(zhì)，洗凈后70℃恒溫烘箱中干燥，并剪成1cm長(zhǎng)的小片段；

提取工藝：將5g預(yù)處理后的兔毛置于浴比為1∶5的40％尿素溶液中，使用naoh溶液將其ph值調(diào)至10，75℃下水解5h。取出過(guò)濾未溶解的兔毛纖維，將兔毛角蛋白液溶液注入透析袋(截留分子量8000-14000)在蒸餾水中透析3天除雜，每隔4h換一次水，再置于18％聚乙二醇溶液1d出去過(guò)多的水分，冷凍干燥得到角蛋白粉末。

1.溶解率的測(cè)定

將未溶解的兔毛用蒸餾水多次清洗，70℃下烘干稱量質(zhì)量。其溶解率如下：

其中，m兔毛溶解前質(zhì)量g；m1未溶解兔毛質(zhì)量g。

經(jīng)測(cè)定5g兔毛纖維經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)上述水解后，其溶解率為74.12％。

2.雙縮脲顯色反應(yīng)

雙縮脲試劑(以1.5g硫酸銅(cuso4·h2o)和6.0g酒石酸鉀納(knac4h4o6·4h2o)，用500ml蒸餾水溶解，在攪拌下緩慢加入300ml10％naoh溶液，用水稀釋到1l。

量取5ml的雙縮脲顯色劑加入試管中，再加入1ml的兔毛蛋白水解液，以未加入兔毛角蛋白的雙縮脲溶液為空白對(duì)照組，如圖1所示，通過(guò)顏色比較，溶液由藍(lán)色變?yōu)樽仙?，說(shuō)明溶液中蛋白類物質(zhì)含有的肽鍵與雙縮脲試劑發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成紫紅色的絡(luò)合物。

3.兔毛角蛋白樣品的紅外光譜分析

由上圖可以分析在特征頻率區(qū)內(nèi)，在3200cm^-1～3400cm^-1附近有明顯的吸收帶，峰形寬大，此處屬于蛋白質(zhì)中的酸性基團(tuán)中成氫鍵的羥基與堿性基團(tuán)中的氨基的伸縮振動(dòng)吸收。重要的是，在1650cm^-1處出現(xiàn)極為強(qiáng)烈的吸收峰為酰胺i帶，由c＝o鍵振動(dòng)伸縮導(dǎo)致的；而在1546cm^-1處同樣有較為明顯的振動(dòng)吸收峰， 由c-n鍵的伸縮振動(dòng)以及n-h的彎曲振動(dòng)引起的，屬于酰胺ii帶；另外在1250cm^-1處也有微弱的振動(dòng)吸收峰，屬于酰胺iii帶的特征吸收，分別是來(lái)自c-n、c-o的伸縮振動(dòng)和o＝c-n的彎曲振動(dòng)。以上的特征吸收峰均為蛋白質(zhì)的特征官能團(tuán)引起的。

4.克達(dá)爾定氮

量取0.1994g的提取的兔毛角蛋白粉置于凱氏燒瓶中，加入0.5g的硫酸銅和硫酸鉀(質(zhì)量比3∶1)混合物及10ml濃硫酸，加4～5顆玻璃珠，酒精燈緩慢加熱，直至溶液溶解，并由黑色轉(zhuǎn)置無(wú)色透明，并繼續(xù)加熱約1h，取出冷卻至室溫。往燒瓶中緩慢加入50ml蒸餾水，溶解未溶的鹽，冷卻轉(zhuǎn)入100ml的容量瓶中，多次用蒸餾水沖洗燒瓶并入容量瓶，加水配置刻度，搖勻。

量取20ml的煮解液加入蒸汽發(fā)生器中，加入20ml40％的naoh溶液中和過(guò)多的濃硫酸，直至溶液變黑。冷凝管下端放置裝入30ml5％的硼酸溶液的錐形瓶并滴入4滴溴甲酚綠甲基紅指示劑。加熱使得反應(yīng)器反應(yīng)生成氨氣并通過(guò)冷凝管流入錐形瓶中，使得溶液由粉紅色變成綠色，測(cè)定流出液的ph值為中性后并繼續(xù)反應(yīng)0.5h即可停止。

取出溶液用0.11285mol/l鹽酸溶液滴定，使得溶液由綠色變成紫紅色，讀取鹽酸用量。

式中，c：滴定鹽酸濃度mol/l；v1，v2：鹽酸溶液前后讀數(shù)ml；m：兔毛角蛋白粉的質(zhì)量g；

經(jīng)過(guò)計(jì)算測(cè)得含氮量為14.68％，根據(jù)蛋白質(zhì)含量的計(jì)算

蛋白質(zhì)％＝總含氮量％*k，

其中k為換算因素，毛發(fā)中k值為6.25。

經(jīng)過(guò)計(jì)算測(cè)得含蛋白質(zhì)含量91.75％。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公布了一種從兔毛纖維中提取蛋白質(zhì)的方法，它涉及兔毛資源的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。該方法是主要將兔毛在8mol/l尿素和0.15mol/l半胱氨酸混合液中75℃水解5h，過(guò)濾掉未溶兔毛，得到兔毛蛋白水解液。將兔毛蛋白液注入透析袋并在蒸餾水中透析3d，換入18％聚乙二醇20000溶液透析1d，取出冷凍干燥即可得到兔毛蛋白粉。本發(fā)明提供了一種提取率高、無(wú)污染、綠色環(huán)保的角蛋白提取方法，最后得到兔毛角蛋白含量高達(dá)91.75％。

技術(shù)研發(fā)人員：張毅;黎淑婷;張轉(zhuǎn)玲;張睿;張昊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2016.01.13
技術(shù)公布日：2017.07.21