本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因治療成為現(xiàn)在臨床應(yīng)用的一種方法，即將特定的基因材料轉(zhuǎn)入到特定的細(xì)胞進(jìn)而治療各種慢性疾病和遺傳病。常用于基因治療的載體有兩種，病毒性載體和非病毒性載體。目前，由于病毒性載體具有低免疫原性，潛在的傳染性及致瘤性等一系列的嚴(yán)重缺陷，在應(yīng)用上存在一定的局限性。因此，非病毒基因轉(zhuǎn)染載體的研究成為熱點，在這些非病毒基因轉(zhuǎn)染載體中，人工合成的聚陽離子高分子由于其較低的免疫原性，可修飾性，高負(fù)載量，易規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。但是陽離子高分子的轉(zhuǎn)染效率和分子量成正比，毒性和分子量成反比。也就是說高分子載體的分子量越高，電荷密度就越大，其相應(yīng)的細(xì)胞毒性顯著增加，因此限制了高分子量載體的使用，以及轉(zhuǎn)染效率的進(jìn)一步提高。

現(xiàn)有技術(shù)中急需一種新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑其制備方法及應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，和降低各種新型陽離子高分子基因載體的成本，提供一種新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑其制備方法及應(yīng)用。對現(xiàn)有的低成本的基因載體進(jìn)行改性，合成出一種新型的中性基因轉(zhuǎn)染試劑，在大幅度提高基因轉(zhuǎn)染效率的同時，細(xì)胞毒性得以顯著降低。

其具體技術(shù)方案為：

一種新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑，其分子式為：((c2h4nco(c6r1r2r3r4)m(c6r5r6r7r8r9))n。

一種本發(fā)明所述新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑的制備方法，包括以下步驟：

分子量為25kda的枝狀聚乙烯亞胺與芳香類含氟酸酐在摩爾比為1∶1的情況下，于甲醇溶液中反應(yīng)48小時之后；分別在室溫條件下，于pbs緩沖溶液和蒸餾水中透析48小時，經(jīng)過-80℃過夜，冷凍干燥后，即獲得白色絮狀的新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑。

進(jìn)一步，所述獲得白色絮狀的新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑包括pa1(polyamide1)和pa2(polyamide2)，pa1與pa2的差別在于后者芳香族基團(tuán)的替代度高于前者。

本發(fā)明所述新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑在體外的原代細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞也能得到比較好的效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明采用中性高分子來避免陽離子聚合物的細(xì)胞毒性，這是因為中性高分子由于不帶電荷，在體內(nèi)和體外實驗中，都不會和帶負(fù)電荷的大部分生物分子產(chǎn)生靜電結(jié)合而發(fā)生聚集，從而保持其結(jié)構(gòu)和負(fù)載蛋白的穩(wěn)定性。而陽離子高分子在基因傳遞過程中體積會逐漸增大，當(dāng)達(dá)到微米級的時候，相對于納米尺寸的載體，更難以通過各種生理屏障到達(dá)細(xì)胞核進(jìn)行基因傳遞，這是其基因轉(zhuǎn)染效率較低的一個主要原因。本發(fā)明設(shè)計的這些中性高分子在酸度較低的細(xì)胞溶酶體或者內(nèi)涵體中可以自發(fā)水解，形成母體聚乙烯亞胺，同時實施海綿質(zhì)子效應(yīng)，幫助負(fù)載的蛋白逃逸和避免被降解，從而增加了基因轉(zhuǎn)染效率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑的結(jié)構(gòu)式；

圖2為聚酰胺(a)和聚乙烯亞胺的(b)紅外光譜分析；

圖3為聚酰胺/蛋白質(zhì)尺寸隨兩者摩爾比的變化關(guān)系；

圖4為在聚酰胺/pbs中逐滴加入0.1m的hcl，溶液酸度的變化；

圖5為在聚酰胺的pbs溶液中逐滴加入0.1m的hcl后電位的變化；

圖6為基因載體的轉(zhuǎn)染效率對比，其中圖6a為樹枝狀的pei，圖6b為pa1，圖6c為pa2；

圖7為基因載體的轉(zhuǎn)染效率比較；

圖8為基因載體的毒性分析。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

新型氟化的芳香類聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

實施例1新型轉(zhuǎn)染試劑的理化表征

物理和化學(xué)性能分析：經(jīng)過對合成的高分子納米材料進(jìn)行紅外光譜分析，聚乙烯亞胺經(jīng)過和芳香族酸酐的縮合反應(yīng)，生成的酰胺官能團(tuán)在1699和1607cm^-1出現(xiàn)特征吸收峰(圖2)。

聚酰胺和蛋白絡(luò)合之后，尺寸從10-20納米增加到200-250納米左右，隨著聚酰胺比例的增加，復(fù)合物的大小有逐漸變小，提示了聚合物和蛋白絡(luò)合過程中構(gòu)型發(fā)生了變化(圖3)。

由于在基因轉(zhuǎn)染實驗中，聚酰胺/蛋白復(fù)合物是溶解在pbs溶液中的，所以如果假設(shè)聚酰胺在低酸度的內(nèi)涵體中會發(fā)生水解，生成聚乙烯亞胺，我們做了一個水解實驗來驗證。首先我們在聚酰胺的pbs溶液中逐滴加入0.1m的鹽酸，測試酸度的變化，發(fā)現(xiàn)由于pbs的緩沖效應(yīng)，酸度變化比較小(圖4)，然而電位出現(xiàn)了比較大的變化，從聚酰胺的接近于零的電位上升到16毫安，顯示了聚酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)很有可能發(fā)生了改變，從中性狀態(tài)水解變成了帶正電荷的聚乙烯亞胺(圖5)。

轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性分析

檢測egfp的表達(dá)：實驗采用帶有綠色熒光標(biāo)簽的egfp質(zhì)粒，將合成的新型轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入hek293細(xì)胞，以樹枝狀聚乙烯亞胺作為對照，檢測其轉(zhuǎn)染效率。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過聚酰胺的轉(zhuǎn)染效率比樹枝狀的pei轉(zhuǎn)染效率要高(圖6)。對其進(jìn)行定量分析，通過luciferase實驗，再次證實聚酰胺相比沒有修飾的pei，其轉(zhuǎn)染效率明顯增加(圖7)。

如圖8所示，通過mtt細(xì)胞毒性分析實驗，對新型轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行毒性檢測，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞毒性相比及商業(yè)上常用的轉(zhuǎn)染試劑pei和質(zhì)粒有輕微程度較低，由此說明聚酰胺的細(xì)胞毒性比較小。

實施例2合成方法

分子量為25kda的樹枝狀聚乙烯亞胺與芳香類含氟酸酐在摩爾比為1∶1的情況下，于甲醇溶液中反應(yīng)48小時之后；分別在室溫條件下，于pbs緩沖溶液和蒸餾水中透析48小時，經(jīng)過-80℃過夜，冷凍干燥后，即獲得白色絮狀的枝狀芳香族聚酰胺化合物pa1(polyamide1)和pa2(polyamide2)。pa1與pa2的差別在于后者芳香族基團(tuán)的替代度高于前者。

實施例3激光散射實驗

檢測轉(zhuǎn)染試劑與dna結(jié)合之后的尺寸與電勢的變化情況。其方法與前面方法一致，分別在n/p值3.8、7.5、15、30的情況下，檢測新型轉(zhuǎn)染載體pa1、pa2與dna在pbs緩沖溶液中結(jié)合30分鐘之后的尺寸和電位如何變化的。

實施例4水解實驗

通過配置一定濃度的枝狀芳香族聚酰胺pa1、pa2的pbs溶液，逐滴加入0.1m的鹽酸，紀(jì)錄產(chǎn)物酸度和電位隨時間的變化曲線。

實施例5透射電鏡

通過配置一定濃度的枝狀芳香族聚酰胺/dna復(fù)合物溶液，滴一滴在電鏡銅網(wǎng)上，在室溫下真空干燥，然后在電鏡下觀察復(fù)合物大小。

實施例6基因轉(zhuǎn)染

設(shè)計不同的濃度梯度，即n/p值分別在3.8、7.5、15、30情況下，檢測轉(zhuǎn)染試劑在不同濃度下的轉(zhuǎn)染效率，從而篩選出每種轉(zhuǎn)染試劑最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件。本實驗是將hek293細(xì)胞平鋪6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)大約為7×10⁴，于37℃和5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，枝狀芳香族聚酰胺與dna的結(jié)合體系含2μg的質(zhì)粒(pegfp)，在將枝狀芳香族聚酰胺/dna復(fù)合物加入到細(xì)胞之前，現(xiàn)將兩者在200μl的dmem中結(jié)合20分鐘，于37℃和5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，在熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率＝綠色熒光的細(xì)胞數(shù)目/總的細(xì)胞數(shù)目×100％。

實施例7熒光報告實驗

通過熒光報告實驗，對基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行定量分析。本實驗是將hek293細(xì)胞平鋪24孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為4×10⁴個，培養(yǎng)24小時，在200μl的dmem中加入0.5μg的pluc熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒及最適劑量的枝狀芳香族聚酰胺，室溫下結(jié)合15-20分鐘，加入細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時后，檢測熒光素酶的相對活性，25kda枝狀pei/dna(pluc)作為對照。

實施例8mtt實驗

通過mtt細(xì)胞增殖實驗，分析新型轉(zhuǎn)染試劑對hek293細(xì)胞的毒性。將hek293細(xì)胞平鋪96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5000個，于37℃和5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，pei/dna復(fù)合物(n/p的摩爾比為3.8、7.5、15、30)于dmem溶液中結(jié)合15-20分鐘之后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，將原培養(yǎng)基棄掉，按培養(yǎng)基/mtt(5mg/ml)10∶1的比例混合均勻加入新的培養(yǎng)基，孵育4小時之后，棄培養(yǎng)基，每孔加入150μl的dmso溶液，振蕩15分鐘，酶標(biāo)儀檢測。細(xì)胞活性率＝樣本檢測的od值/對照樣品的od值×100％。

實施例9細(xì)胞凋亡分析

分別將25kda枝狀pei與枝狀芳香族聚酰胺pa1、pa2在最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下，與pegfp質(zhì)粒dna結(jié)合后轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，24小時后收集、裂解細(xì)胞，提取總蛋白，利用western印跡實驗檢測凋亡標(biāo)志物-parp裂解產(chǎn)物(cleavedparp)的表達(dá)水平。parp裂解產(chǎn)物水平越高反映轉(zhuǎn)染試劑的毒性越高。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。