本發(fā)明涉及藥物化學領域，具體而言涉及一種雙哌嗪類化合物及其應用。
背景技術(shù)：
流行性感冒(流感)是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染疾病，一直以來都嚴重影響人類的生命健康，并帶來巨大的經(jīng)濟和社會負擔。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，季節(jié)性流感的流行每年都會造成300-500萬例嚴重病例，并導致25-50萬人死亡，流感世界范圍的大流行更是會帶來災難性的后果。此外，禽流感是由禽流感病毒引起的一種鳥類病毒性傳染病，一般情況下被感染的宿主沒有明顯的癥狀，禽流感病毒也可以感染家禽、人和一些哺乳動物。
目前，流感疫苗是預防和控制流感傳播的最有效手段，接種疫苗主要是通過誘導產(chǎn)生血凝素抗體來起到保護作用。雖然滅活疫苗和減毒活疫苗都能有效的預防流感和其相關(guān)并發(fā)癥，但其保護作用取決于疫苗病毒株和流行的病毒株之間的抗原匹配程度，以及接種者的年齡和身體健康狀況。在現(xiàn)有條件下，要準確預測即將流行的流感病毒株是非常困難的。
由于病毒的抗原漂移，流感疫苗的成分每年都要根據(jù)世界衛(wèi)生組織和美國疾病防治中心的流感監(jiān)測數(shù)據(jù)進行調(diào)整，這給疫苗的生產(chǎn)帶來很大的困難。而臨床目前用于治療流感病毒感染的藥物主要為m2離子通道抑制劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑這兩類。臨床上應用的m2離子通道抑制劑包括兩種藥物：金剛烷胺和金剛乙烷。該類藥物很早就用來預防和治療流感，m2離子通道抑制劑只對a型流感病毒有效，對b型流感病毒無效。目前，該類藥物的耐藥性問題已經(jīng)非常嚴重，該類藥物已不再作為流感防治的一線藥物使用。神經(jīng)氨酸酶抑制劑是根據(jù)流感病毒神經(jīng)氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)信息，通過合理藥物設計開發(fā)出抗流感病毒藥物，與m2離子通道抑制劑只對a型流感有效不同，神經(jīng)氨酸酶對a型流感病毒和b型流感病毒感染都有效，但是隨著流感病毒的變異以及藥物濫用，使得神經(jīng)氨酸酶的耐藥性問題日益嚴重。
針對流感病毒日益嚴重的耐藥性威脅以及目前僅有少數(shù)幾種治療藥物的狀況，開發(fā)新型抗流感病毒藥物變得十分迫切和必要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明通過測定雙哌嗪類化合物對流感病毒的細胞水平抑制活性及細胞毒性表明，該類化合物對流感病毒具有一定的抑制作用，其可以用于制備抗流感病毒藥物。
本發(fā)明提供了一種雙哌嗪類化合物，具有如下通式(i)結(jié)構(gòu)：
其中，x選自c1-5的烷基、c1-5的?；?、c1-5的炔基、c1-5的烯基或氧原子；
u選自c1-5的烷基、氧原子、硫原子、c3-6的環(huán)烷基、c5-6的雜環(huán)或芳環(huán)；
y選自c1-3的烷基、氫原子、氧原子、氨基、c1-3的烷氨基、c1-3的酰胺基、羥基、c1-3的烷氧基或芳環(huán)；
z選自c1-5的烷基、氧原子、c1-5的?；?、c1-5的炔基或c1-5的烯基；以及
r1和r2選自c1-5的烷基、c1-5的酰基、c1-5的炔基、c1-5的烯基、含鹵素取代的苯基、含炔基取代的苯基或含各種吸電子基/供電子基取代的苯基。
在上述雙哌嗪類化合物中，
x選自c1-5的烷基、c1-5的?；騝1-5的炔基；
u選自c1-5的烷基或c1-5的?；?；
y選自氫原子、氧原子、氨基、c1-3的烷氨基、羥基或c1-3的烷氧基；
z選自c1-5的烷基或c1-5的?；?；以及
r1和r2選自含鹵素取代的苯基、含炔基取代的苯基或含各種吸電子基/供電子基取代的苯基。
在上述雙哌嗪類化合物中，r1和/或r2與哌嗪直接相連。
在上述雙哌嗪類化合物中，雙哌嗪類化合物為：
在上述雙哌嗪類化合物中，雙哌嗪類化合物為：
本發(fā)明還提供了雙哌嗪類化合物及其鹽在制備抗流感病毒藥物中的應用。
在上述應用中，其中，所述雙哌嗪類化合物的鹽為可藥用鹽。
在上述應用中，其中，所述可藥用鹽為有機鹽。
在上述應用中，其中，所述可藥用鹽為無機鹽。
在上述應用中，其中，所述有機鹽為甲磺酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、苯磺酸鹽、對甲基苯磺酸鹽、萘磺酸鹽、乳酸鹽和苯甲酸鹽。
在上述應用中，其中，所述無機鹽為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽。該類化合物對流感病毒活性存在較好的抑制作用，在制備抗流感病毒藥物中有著很好的應用前景。
附圖說明
圖1是測定的化合物26的ec50圖。
圖2是測定的化合物26的cc50圖。
圖3是化合物26的質(zhì)譜圖。
圖4是化合物26的氫譜圖。
圖5是化合物26的碳譜圖。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種雙哌嗪類化合物，具有如下通式(i)結(jié)構(gòu)：
其中，x選自c1-5的烷基、c1-5的?；1-5的炔基、c1-5的烯基或氧原子；u選自c1-5的烷基、氧原子、硫原子、c3-6的環(huán)烷基、c5-6的雜環(huán)或芳環(huán)；y選自c1-3的烷基、氫原子、氧原子、氨基、c1-3的烷氨基、c1-3的酰胺基、羥基、c1-3的烷氧基或芳環(huán)；z選自c1-5的烷基、氧原子、c1-5的?；?、c1-5的炔基或c1-5的烯基；以及r1和r2選自c1-5的烷基、c1-5的?；?、c1-5的炔基、c1-5的烯基、含鹵素取代的苯基、含炔基取代的苯基或含各種吸電子基/供電子基取代的苯基。其中，r1和r2也可以與哌嗪直接相連。特別地，本發(fā)明的雙哌嗪類化合物優(yōu)選以下化合物：
下列實施例選擇化合物26用于舉例說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
化合物26的合成過程如下所示：
具體合成過程為：
(1)將原料草酰氯b(0.29ml，0.0034mol)溶于4ml二惡烷中配成a溶液，將原料芐基哌嗪a(1.48ml，0.0085mol)溶于6ml二惡烷中配成b溶液。將a溶液緩慢滴加到b溶液中，過程中有白煙放出，加料完成后體系呈乳白色懸濁狀，攪拌過程中，體系會變得更加粘稠，有大量固體析出。tlc(薄層色譜(點板))監(jiān)測反應完全后，在體系中加入乙酸乙酯進行萃取，保留乙酸乙酯相，再用飽和氯化鈉水溶液(10ml)水洗有機相兩遍，用無水硫酸鈉(5.6g)干燥有機相。減壓旋干乙酸乙酯得黃色油狀物c。
(2)將中間體c(0.3g，0.74mmol)溶于10ml干燥的四氫呋喃(thf)中，緩慢加入氫化鋁鋰(0.14g，3.7mmol)，反應劇烈，有氣泡冒出。要確保體系處于無水的狀態(tài)。加料完成后，將體系在油浴鍋中加熱至70℃回流反應6h。tlc監(jiān)測反應完成后，將其體系降至室溫，緩慢加入稀鹽酸溶液(質(zhì)量分數(shù)為15％，10ml)淬滅反應。加入飽和氯化鈉溶液(5ml)，用乙酸乙酯萃取兩遍，無水硫酸鈉(5.6g)干燥有機相。減壓濃縮后，硅膠柱純化后得化合物26。
采用brukerav-400型核磁共振儀測定的化合物結(jié)果如下：
化合物26：ms-esi(+)：c24h34n4計算值378.56，實測值378.44；
1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.33(d,j＝4.4hz,8h),7.24–7.28(m,2h),3.53(s,4h),2.54(d,j＝19.0hz,20h)；
13cnmr(151mhz,cdcl3)δ129.29,129.22,128.29,127.24,62.78,53.27,52.38,29.71.
此外，測得的其他化合物的參數(shù)如下：
化合物1：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.247.36(m,10h),3.53(s,4h),2.332.63(m,20h),1.661.76(m,2h).
化合物2：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.257.35(m,9h),3.89(s,2h),3.55(d,j＝5.8hz,4h),3.45(d,j＝2.4hz,2h),2.432.74(m,16h),2.27(d,j＝2.5hz,1h),1.78(q,j＝7.6hz,2h),1.28(s,3h),0.840.93(m,2h).
化合物3：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.207.34(m,10h),2.792.87(m,4h),2.452.76(m,20h),2.372.44(m,4h),1.701.78(m,2h).
化合物6：1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ8.24(d,j＝2.7hz,2h),8.17(d,j＝2.7hz,1h),8.16(d,j＝2.7hz,1h),7.30(d,j＝9.0hz,2h),3.21(t,j＝4.9hz,8h),2.542.61(m,8h),2.41(t,j＝7.3hz,4h),1.67(p,j＝7.5hz,2h).
化合物16：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.17(d,j＝8.7hz,4h),7.51(d,j＝8.3hz,4h),3.60(s,4h),2.342.65(m,20h),1.72(p,j＝7.6hz,2h).
化合物17：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.23(d,j＝8.6hz,4h),6.86(d,j＝8.6hz,4h),3.81(s,6h),3.47(s,4h),2.272.72(m,20h),1.701.76(m,2h).
化合物18：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.17(d,j＝7.7hz,4h),7.11(d,j＝7.7hz,4h),3.63(s,4h),2.562.93(m,20h),2.30(s,6h),1.83(t,j＝7.4hz,2h).
化合物19：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.56(d,j＝8.0hz,4h),7.43(d,j＝7.9hz,4h),3.57(s,4h),2.512.83(m,20h),1.86(t,j＝7.5hz,2h).
化合物20：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.267.31(m,4h),7.02(t,j＝8.6hz,4h),3.58(s,4h),2.612.88(m,20h),1.91(t,j＝7.4hz,2h).
化合物21：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.30(d,j＝8.4hz,4h),7.25(d,j＝8.4hz,4h),3.54(s,4h),2.492.96(m,20h),1.91(t,j＝7.6hz,2h).
化合物24：1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.257.36(m,10h),3.53(s,4h),2.192.62(m,20h),1.411.58(m,4h).
化合物25：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.257.32(m,2h),7.057.10(m,4h),6.946.99(m,2h),3.54(s,4h),2.67(d,j＝60.7hz,20h),1.87(t,j＝7.8hz,2h).
化合物27：1hnmr(600mhz,chloroform-d)δ7.58(d,j＝8.0hz,3h),7.407.48(m,5h),3.56(s,4h),2.53(d,j＝30.6hz,20h).
抗流感病毒化合物細胞水平抑制活性以及細胞毒性測定：
(1)抗流感化合物細胞水平的抗流感病毒活性檢測
a)mdck細胞的復蘇
將在液氮中凍存的mdck細胞在37℃水浴鍋中解凍后，加入到盛有12ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基成分為dmem+10％胎牛血清+1％青霉素和鏈霉素，37℃，5％co2培養(yǎng)。
b)influenza(h1n1)-gluc病毒的擴增
購買發(fā)育良好的9-11日齡雞胚，于尿囊腔接種，33℃-35℃孵卵箱中培養(yǎng)，孵育24h后檢視，棄去死胎，48h后收獲。收獲前，將雞胚置于4℃冰箱中過夜。收獲的病毒放置于-80℃冰箱中。
c)病毒滴度測定
mdck細胞按照3x105個/ml接種于96孔板中，37℃，5％co2培養(yǎng)18h后，第一列3孔加入10倍稀釋的病毒100ul，第二列3孔加入20倍稀釋的病毒100ul，直到第九列3孔，第十列作為空白對照，培養(yǎng)24小時后取上清，加入腔腸素進行數(shù)據(jù)測定，gluciferase讀值在100000-200000之間最為合適。
d)化合物的配制
將抗流感化合物26溶解在95％二甲基亞砜中，配制10mm儲液，用培養(yǎng)基dmem+10％fbs(胎牛血清)+1％ps(青霉素鏈霉素)將上述化合物配制成100um，40um，4um進行初步篩選。
e)將mdck細胞按照3x105個/ml接種于96孔板中，為防止培養(yǎng)基蒸發(fā)引起的邊緣效應，96孔板外圍加入200ulpbs緩沖液，37℃，5％co2培養(yǎng)18h后，每板可以測定6種化合物，將100ul細胞中的培養(yǎng)基吸走，在96孔板的第2列bcd行3孔細胞中加入50ul100um的第一種化合物，第三列bcd行3孔中加入50ul40um的化合物，第四列bcd行3個孔加入50ul4um的化合物，第五列bcd行3孔加入50ul100um第二種化合物，以此類推加到96孔板的第9列的3個孔，efg3行9列加入另3種化合物，第11列6個孔設為病毒對照和細胞對照。
f)抑制劑處理2h后，用培養(yǎng)基將influenza(h1n1)-gluc病毒稀釋30倍，然后每孔加入50ul病毒，總體積變?yōu)?00ul，因此，抑制劑的濃度變?yōu)榕渲茲舛鹊?/2，37℃，5％co2培養(yǎng)24小時。
g)細胞培養(yǎng)24h后，取細胞上清30微升于白色酶標板中，加入30ul腔腸素，于微孔板檢測儀中讀取數(shù)值。
g)對20um條件下抑制率50％以上的抑制劑進行確切的ec50測定，其方法如下：
將100ulmdck細胞按3x105個/ml接種于96孔板中，外圍用200ulpbs封閉，防止邊緣效應，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
將篩選出的化合物10mm儲液用培養(yǎng)基2倍梯度稀釋成200um-0.78um9個濃度。
將96孔板中的細胞上清吸走后，加入50ul上述濃度的抑制劑，同時設置病毒對照和細胞對照。
加入抑制劑2h后，將influenza-(h1n1)-gluc病毒稀釋30倍，加入50ul于96孔板中，37℃，5％co2培養(yǎng)24h。
取細胞上清30ul于白色酶標板中，加入30ul腔腸素，立刻于微孔板檢測儀中讀取數(shù)值，并用graphpadprism中作圖計算ec50值?；衔?6的ec50值見圖1。
(2)抗流感化合物細胞水平的抗流感病毒毒性檢測
a)將抗流感化合物溶解在95％二甲基亞砜中，配制10mm儲液，用培養(yǎng)基dmem+10％fbs+1％ps將上述化合物配制成100um進行cc50細胞毒性測定。
b)將mdck細胞按照3x105個/ml接種于96孔板中，為防止培養(yǎng)基蒸發(fā)引起的邊緣效應，96孔板外圍加入200ulpbs緩沖液，37℃，5％co2培養(yǎng)18h后，每板可以測定兩種化合物。將第一列100ul細胞中的培養(yǎng)基吸走，在96孔板的第2列bcd行3孔細胞中加入50ul100um的第一種化合物，第三列bcd行3孔中同樣加入50ul100um的化合物，第四列bcd行3個孔同樣加入50ul100um的化合物，以此類推加到96孔板的第9列的3個孔，efg3行9列加入另一種化合物，第11列6個孔設為細胞對照。
c)細胞培養(yǎng)24h后，將孔內(nèi)的培養(yǎng)液和藥倒出，用pbs清洗2遍。每孔加入mtt溶液100ul。37℃，5％co2中孵育4h。加入100uldmso(100％)溶解結(jié)晶。10min后，結(jié)晶藥物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀(jk-mr-5033a，上海精學科學儀器有限公司)在492nm處測量各孔吸光值。并用graphpadprism作圖計算cc50值?；衔?6的cc50值見圖2。
由上可知，雙哌嗪類化合物對流感病毒活性有較好的抑制作用，能顯著降低抗流感病毒的毒性，從而可以將這類化合物用于制備抗流感病毒藥物。
為了清楚和易于理解的目的，通過舉例說明和實施例詳細地描述了上述發(fā)明?？梢栽诟诫S的權(quán)利要求的范圍內(nèi)進行改變和修改，這對本領域的技術(shù)人員來說是很明顯的。因此，可以理解，上面的說明書旨在用于說明而不是用于限制。因此，本發(fā)明的范圍不應參考上述說明書來確定，而應當參照下面所附權(quán)利要求以及這些權(quán)利要求所享有的等同原則所確定的全部范圍確定。