本發(fā)明涉及一種快速篩選、鑒定及定量發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌的方法，屬于生物技術(shù)及發(fā)酵食品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

耐酸乳桿菌廣泛存在于各種發(fā)酵食品釀造體系中，包括白酒、黃酒、食醋、泡菜、醬油、酸奶、干酪、酒釀、豆豉、乳腐、黃酒、啤酒、葡萄酒等，并且是發(fā)酵食品釀造體系中的優(yōu)勢微生物。通過高通量測序結(jié)果表明，在白酒酒醅發(fā)酵中后期細(xì)菌中有90％以上為耐酸乳桿菌，其優(yōu)勢階段占據(jù)整個(gè)發(fā)酵階段2/3的時(shí)間，這是由于耐酸乳桿菌能夠耐受或適應(yīng)于高酸度、高乙醇濃度、低含氧量等不利條件的特性所決定的。有研究發(fā)現(xiàn)，白酒發(fā)酵中后期是乙酸、乳酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯等重要風(fēng)味物質(zhì)形成的階段，而耐酸乳桿菌被認(rèn)為是生成這些風(fēng)味物質(zhì)的重要菌株，因此該菌對(duì)白酒的風(fēng)味具有巨大的貢獻(xiàn)。故而對(duì)于耐酸乳桿菌的分離鑒定非常重要。但是耐酸乳桿菌為兼性厭氧微生物，營養(yǎng)條件十分苛刻，且耐酸乳桿菌在菌落形態(tài)與理化性質(zhì)上與多數(shù)乳酸菌間差異不顯著，這給耐酸乳桿菌的篩選、鑒定及定量工作帶來了極大的困難，也是目前對(duì)于耐酸乳桿菌研究較少的主要原因。

由于常規(guī)培養(yǎng)基缺乏耐酸乳桿菌菌生長所需的獨(dú)特生長因子，耐酸乳桿菌在常規(guī)MRS、番茄汁瓊脂(TJA)等培養(yǎng)基上幾乎不能生長；此外，目前對(duì)于耐酸乳桿菌的篩選鑒定，主要通過菌株的理化性質(zhì)或16srDNA的方法。這種鑒定方法存在周期長、費(fèi)用高、成功率低等問題。因此，在耐酸乳桿菌篩選鑒定方面存在很多亟待解決的問題，建立一種快速篩選、鑒定及定量發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌的方法是十分必要并且具有重要意義的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，彌補(bǔ)現(xiàn)有乳酸菌篩選、鑒定及定量技術(shù)的不足，首先，本發(fā)明提供了一種有效提高乳酸菌篩選、鑒定及定量效率的特異性引物。其次，本發(fā)明改良了傳統(tǒng)的MRS培養(yǎng)，添加多種營養(yǎng)因子提高了乳酸菌的存活率，添加制霉素抑制雜菌的生長，添加溴甲酚綠能快速識(shí)別產(chǎn)酸乳酸菌。最后，利用特異性引物能夠快速、準(zhǔn)確地從產(chǎn)酸乳酸菌中篩選出耐酸乳桿菌。

本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供了一種發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌的篩選、鑒定及其特異性定量方法，所述方法是以上述耐酸乳桿菌中糖基水解酶的編碼基因的核苷酸序列作為模板設(shè)計(jì)引物對(duì)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述糖基水解酶編碼基因的核苷酸序列為SEQIDNO.1。

本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供了一對(duì)特異性引物，以提高耐酸乳桿菌的篩選、鑒定及定量效率，所述特異性引物對(duì)序列為LaF1:5′-AACATCCCCAGAGCGTCAAG-3′；LaR1:5′-GGCACTACCCCAAGCATCTT-3′。

本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是該特異性引物對(duì)在耐酸乳桿菌篩選鑒定方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述樣品為任意來源含有耐酸乳桿菌的菌體、菌落、菌液以及基因組樣品。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述篩選是在每升MRS培養(yǎng)基主溶液的基礎(chǔ)上，添加1～5mL副溶液混勻使用；副溶液的組成：指示劑溴甲酚綠0.01～0.02g/mL，營養(yǎng)因子D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽、甲瓦龍酸內(nèi)脂和維生素B11，其中，D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽0.01～0.02g/mL、甲瓦龍酸內(nèi)脂0.005～0.015g/mL、維生素B11 0.01～0.015g/mL，制霉素0.04～0.06g/mL，溶劑為二甲基亞砜，使用無菌濾膜過濾滅菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述MRS培養(yǎng)基的組分包括：胰蛋白胨8.0～15.0g/L、牛肉浸膏5.0～10.0g/L、酵母提取物2.0～6.0g/L、葡萄糖18.0～25.0g/L、無水山梨醇油酸酯0.5～1.5mL/L、K₂HPO₄1.0～5.0g/L、三水合乙酸鈉1.0～10.0g/L、檸檬酸三銨1.0～5.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.1～0.5g/L、MnSO₄·4H₂O0.01～0.1g/L、瓊脂15.0～25.0g/L(液體培養(yǎng)基不添加)調(diào)節(jié)pH為6.8±0.3，添加1000mL蒸餾水配制成主溶液，121℃滅菌15min；溴甲酚綠0.01～0.02g/mL、D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽0.01～0.02g/mL、甲瓦龍酸內(nèi)脂0.005～0.015g/mL、維生素B110.01～0.015g/mL和制霉素0.04～0.06g/mL，添加二甲基亞砜配制成副溶液，使用0.2μm無菌濾膜過濾滅菌；主溶液冷卻至40～60℃時(shí)，添加1～5mL副溶液混勻使用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施例中，所挑選的目的菌落為平板上單菌落周圍培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色的菌落。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述特異性引物PCR，是指利用特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR，如果PCR產(chǎn)物檢測，顯示具有100～250bp之間的片段，則代表該菌落為耐酸乳桿菌。如果PCR產(chǎn)物不在100～250bp之間或者沒有條帶，則代表該菌落不含耐酸乳桿菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PCR反應(yīng)體系為：總體系25～50μL：Prime STAR12.5～25μL，上下游引物各0.5～1.0μL，菌液1～2μL，超純水11～22μL。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性90～98℃2～10min，變性95～98℃5～15s，退火50～60℃0.5～1.5min，延伸68～75℃1～5min，共20～45個(gè)循環(huán)，68～75℃8～15min。

本發(fā)明的第四個(gè)內(nèi)容是該引物對(duì)在利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTFQ PCR)對(duì)耐酸乳桿菌特異性定量方面的應(yīng)用

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述樣品為任意來源含有耐酸乳桿菌的菌體、菌落、菌液以及基因組樣品。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述RTFQ PCR反應(yīng)體系為，總體系10～40μL：2×FastqPCR Master Mix(with loading dye)5～20μL，上下游引物各0.2～0.8μL，基因組0.5～1.5μL，超純水4.1～16.4μL。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述RTFQ PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性92～98℃3～8min，變性90～98℃5～15s，退火40～60℃15～40s，延伸65～75℃0.5～1.5min，共30～50個(gè)循環(huán)，65～75℃8～12min。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明所改良的MRS培養(yǎng)基能夠提高發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌的存活率、抑制雜菌的生長、便于識(shí)別產(chǎn)酸乳酸菌；

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)通過特異性引物PCR技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地從發(fā)酵食品中篩選鑒定出耐酸乳桿菌；

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)通過RTFQ PCR技術(shù)能夠用于發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌的快速、準(zhǔn)確定量；

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)，用于耐酸乳桿菌的定性、定量時(shí)，具有速度快、準(zhǔn)確度高和適用范圍廣的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1：特異性引物對(duì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳驗(yàn)證；

圖2：目的菌株的特異性篩選PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析；

圖3：目的菌株16sr DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析；

圖4：循環(huán)閾值與耐酸乳桿菌菌濃的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5：耐酸乳桿菌熒光定量PCR的反應(yīng)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)特異性引物對(duì)的設(shè)計(jì)

特異性引物對(duì)的設(shè)計(jì)方法：

(1)汾酒發(fā)酵過程中主要的乳酸菌種屬為耐酸乳桿菌(L.acetotolerans)、短乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.casei)、干酵母乳桿菌(L.diolivorans)、香腸乳桿菌(L.farciminis)和清酒乳桿菌(L.sakei)(乳酸菌在酒醅中的存在率＞1％)；

(2)通過京都基因與基因組百科全書代謝通路(KEGG Pathway)尋找耐酸乳桿菌與其余6株乳酸菌之間的特異性酶—糖基水解酶(glycosyl hydrolase)，獲取該特異性酶的2328bp 的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.1；

(3)將該核苷酸序列通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)使用局部序列排比檢索基本工具(BLAST)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果僅與耐酸乳桿菌(NBRC13120)的基因組序列具有100％的相似度，表明糖基水解酶所對(duì)應(yīng)的2328bp氨基酸序列是L.acetotolerans的高度特異性序列；

(4)利用NCBI Primer-BLAST工具，設(shè)定引物參數(shù)(Primer Parameters)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物長度(PCR product size)80～300；設(shè)定引物對(duì)特異性驗(yàn)證參數(shù)(Primer Pair Specificity Checking Parameters)：數(shù)據(jù)庫(Database)nr；其余參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)定；

(5)從所獲得的對(duì)引物對(duì)中，利用DNAMAN軟件挑選不能夠自身成環(huán)(self-complementarity)序列號(hào)為SEQ ID NO.2的上游引物L(fēng)aF1：5’-AACATCCCCAGAGCGTCAAG-3’和序列號(hào)為SEQ ID NO.3下游引物L(fēng)aR1：5’-GGCACTACCCCAAGCATCTT-3’作為可能性目的引物對(duì)，PCR產(chǎn)物長度151bp，Tm為60℃，GC％為55％；

(6)以可能性目的引物對(duì)為上下游引物在NCBI中進(jìn)行BLAST，比對(duì)結(jié)果只與耐酸乳桿菌具有100％相似度，這表明所選LaF1/LaR1引物對(duì)可能性目的引物對(duì)為適于此環(huán)境下的特異性引物對(duì)。

實(shí)施例2：耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)特異性引物對(duì)的驗(yàn)證

特異性引物對(duì)的驗(yàn)證：

(1)選擇兩株目的耐酸乳桿菌(LA1、LA2)進(jìn)行菌落PCR，陰性對(duì)照為白酒酒醅發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物：短乳桿菌(LB)、干酪乳桿菌(LC)、戊糖乳桿菌(LP)、Lactobacillus diolivorans(LD)、Lactobacillus farciminis(LF)、Lactobacillus sakei(LS)、Pediococcus parvulus(PP)、Pseudomonas hunanensis(PH)、Pichia kudriavzevii(PK)、Geotrichum candidum(GC)、Naumovozyma castellii(NC)以及重蒸水(dd H₂O)；

(3)PCR反應(yīng)體系為25μL：Prime STAR12.5μL，上下游引物各0.5μL，菌液1mL；

(4)PCR的反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃4min，變性98℃10s，退火55℃1min，延伸72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，72℃10min；

(5)瓊脂糖凝膠電泳：2％的瓊脂糖凝膠，2μL染液，4μL PCR產(chǎn)物，Mark為DL2000，160V，20min；

(6)通過凝膠成像儀觀察引物的特異性，LA1、LA2在151bp附近具有明顯的目的條帶，而其余陰性對(duì)照沒有條帶(如圖1所示)，則表明所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)具有對(duì)L.acetotolerans的特異性。

實(shí)施例3：耐酸乳桿菌Lactobacillus acetotolerans的篩選

在耐酸乳桿菌培養(yǎng)過程中，通過多次嘗試發(fā)現(xiàn)添加一定比例的3種營養(yǎng)因子—D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽、甲瓦龍酸內(nèi)脂和維生素B11能夠極大地提高耐酸乳桿菌的存活率。此外，根據(jù)耐酸乳桿菌的產(chǎn)酸時(shí)間早于其它乳酸菌，且產(chǎn)酸能力要強(qiáng)于其他乳酸菌，針對(duì)乳酸菌的產(chǎn)酸特性設(shè)計(jì)有效的指示培養(yǎng)基非常重要。

培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、無水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K₂HPO₄2.5g/L、三水合乙酸鈉6.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L、MnSO₄·4H₂O0.08g/L、瓊脂20.0g/L調(diào)節(jié)pH為6.8±0.3，添加1000mL蒸餾水配制成主溶液，121℃滅菌15min；溴甲酚綠0.015g/mL、D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽0.01g/mL、甲瓦龍酸內(nèi)脂0.01g/mL、維生素B110.01g/mL和制霉素0.05g/mL，添加二甲基亞砜配制成副溶液，使用0.2μm無菌濾膜過濾滅菌；使用時(shí)，主溶液冷卻至50℃，添加2mL副溶液混勻使用。

樣品前處理：稱取10g發(fā)酵食品于已滅菌裝有100mL無菌PBS緩沖液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min搖床振蕩混勻30min，靜置5min獲得菌懸液。

微生物培養(yǎng)：取10^-3、10^-4和10^-53個(gè)樣品菌懸液稀釋度涂布于上述MRS培養(yǎng)基平板中于37℃厭氧箱中培養(yǎng)84h，挑選挑取平板上周圍培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色的單菌落并編號(hào)，使用特異性引物進(jìn)行菌落PCR。PCR反應(yīng)條件和瓊脂糖凝膠電泳同“特異性引物驗(yàn)證”。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性篩選PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。菌落編號(hào)D6、F1和F6具有目的條帶。

實(shí)施例4：耐酸乳桿菌Lactobacillus acetotolerans篩選驗(yàn)證

通過凝膠成像儀，選擇實(shí)施例3中所有進(jìn)行編號(hào)的單菌落，使用細(xì)菌通用引物對(duì)1492R/F27進(jìn)行16srDNA菌落PCR(如圖3所示)，陽性對(duì)照(CK+)為目的菌株，陰性對(duì)照(CK-)為重蒸水。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸測序，將核苷酸序列使用NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果結(jié)果顯示具有目的條帶的菌落編號(hào)D6、F1和F6對(duì)應(yīng)的的16srDNA菌落PCR結(jié)果與耐酸乳桿菌(LC202658.1)具有100％的相似度，從而快速得知D6、F1和F6所對(duì)應(yīng)編號(hào)的菌落為目的乳酸菌。

實(shí)施例5：耐酸乳桿菌Lactobacillus acetotolerans的篩選

培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨15.0g/L、牛肉浸膏10.0g/L、酵母提取物6.0g/L、葡萄糖25.0g/L、無水山梨醇油酸酯1.5mL/L、K₂HPO₄5.0g/L、三水合乙酸鈉10.0g/L、檸檬酸三銨5.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L、MnSO₄·4H₂O0.1g/L、瓊脂25.0g/L調(diào)節(jié)pH為6.8±0.3，添加1000mL 蒸餾水配制成主溶液，121℃滅菌15min；溴甲酚綠0.02g/mL、D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽0.02g/mL、甲瓦龍酸內(nèi)脂0.015g/mL、維生素B11 0.015g/mL和制霉素0.06g/mL，添加二甲基亞砜配制成副溶液，使用0.2μm無菌濾膜過濾滅菌；使用時(shí)，主溶液冷卻至60℃，添加5mL副溶液混勻使用。

樣品前處理：稱取10g發(fā)酵食品于已滅菌裝有100mL無菌PBS緩沖液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min搖床振蕩混勻30min，靜置5min獲得菌懸液。

微生物培養(yǎng)：取10^-3、10^-4和10^-53個(gè)樣品菌懸液稀釋度涂布于上述MRS培養(yǎng)基平板中于37℃厭氧箱中培養(yǎng)84h，挑選挑取平板上周圍培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色的單菌落并編號(hào)，使用特異性引物進(jìn)行菌落PCR。

PCR反應(yīng)條件和瓊脂糖凝膠電泳同“特異性引物驗(yàn)證”。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例3，三株菌落的PCR產(chǎn)物在100～250bp之間有條帶。

實(shí)施例6：耐酸乳桿菌Lactobacillus acetotolerans的篩選

培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨8.0g/L、牛肉浸膏5.0g/L、酵母提取物2.0g/L、葡萄糖18.0g/L、無水山梨醇油酸酯0.5mL/L、K₂HPO₄1.0g/L、三水合乙酸鈉1.0g/L、檸檬酸三銨1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.1g/L、MnSO₄·4H₂O0.01g/L、瓊脂15.0g/L調(diào)節(jié)pH為6.8±0.3，添加1000mL蒸餾水配制成主溶液，121℃滅菌15min；溴甲酚綠0.01g/mL、D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽0.01g/mL、甲瓦龍酸內(nèi)脂0.005g/mL、維生素B110.01g/mL和制霉素0.04g/mL，添加二甲基亞砜配制成副溶液，使用0.2μm無菌濾膜過濾滅菌；使用時(shí)，主溶液冷卻至40℃，添加1mL副溶液混勻使用。

樣品前處理：稱取10g發(fā)酵食品于已滅菌裝有100mL無菌PBS緩沖液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min搖床振蕩混勻30min，靜置5min獲得菌懸液。

微生物培養(yǎng)：取10^-3、10^-4和10^-53個(gè)樣品菌懸液稀釋度涂布于上述MRS培養(yǎng)基平板中于37℃厭氧箱中培養(yǎng)84h，挑選挑取平板上周圍培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色的單菌落并編號(hào)，使用特異性引物進(jìn)行菌落PCR。PCR反應(yīng)條件和瓊脂糖凝膠電泳同“特異性引物驗(yàn)證”。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例3，三株菌落的PCR產(chǎn)物在100～250bp之間有條帶。

實(shí)施例7：發(fā)酵酒醅中耐酸乳桿菌Lactobacillus acetotolerans)的RTFQ PCR

建立CT值與耐酸乳桿菌菌濃的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖4所示)。

提取酒醅樣品中的總基因組，基因組濃度為10ng/μL。

使用LaF1/LaR1引物對(duì)對(duì)多提取的基因組進(jìn)行RTFQ PCR

RTFQ PCR反應(yīng)體系為：總體系20μL：2×Fast qPCR Master Mix(with loading dye)10μL，上下游引物各0.4μL，基因組1μL，超純水8.2μL。

所述RTFQ PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5min，變性95℃10s，退火50℃0.5min，延伸70℃1min，共40個(gè)循環(huán)，70℃10min。

根據(jù)反應(yīng)結(jié)束的CT值(如圖5所示)，通過所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算耐酸乳桿菌在樣品中的濃度為C＝8.2×10⁸CFU/mL。

對(duì)照例1：

培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、無水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K₂HPO₄2.5g/L、三水合乙酸鈉6.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L、MnSO₄·4H₂O0.08g/L、瓊脂20.0g/L調(diào)節(jié)pH為6.8±0.3，添加1000mL蒸餾水配制成主溶液，121℃滅菌15min；溴甲酚綠0.015g/mL、D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽0.01g/mL和制霉素0.05g/mL，添加二甲基亞砜配制成副溶液，使用0.2μm無菌濾膜過濾滅菌；使用時(shí)，主溶液冷卻至50℃，添加2mL副溶液混勻使用。

樣品前處理：稱取10g發(fā)酵食品于已滅菌裝有100mL無菌PBS緩沖液(pH7.4，含0.5g/L D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min搖床振蕩混勻30min，靜置5min獲得菌懸液。

微生物培養(yǎng)：取10^-3、10^-4和10^-53個(gè)樣品菌懸液稀釋度涂布于上述MRS培養(yǎng)基平板中于37℃厭氧箱中培養(yǎng)84h，挑選挑取平板上周圍培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色的單菌落并編號(hào)，使用特異性引物進(jìn)行菌落PCR。PCR反應(yīng)條件和瓊脂糖凝膠電泳同“特異性引物驗(yàn)證”。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物不在100～250bp之間或者沒有條帶，說明耐酸乳桿菌在上述MRS培養(yǎng)基中沒有生長。

對(duì)照例2：

培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏8.0g/L、酵母提取物4.0g/L、葡萄糖18.0g/L、無水山梨醇油酸酯0.8mL/L、K₂HPO₄2.5g/L、三水合乙酸鈉6.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L、MnSO₄·4H₂O0.08g/L、瓊脂20.0g/L調(diào)節(jié)pH為6.8±0.3，添加1000mL蒸餾水配制成主溶液，121℃滅菌15min；溴甲酚綠0.015g/mL、甲瓦龍酸內(nèi)脂0.01g/mL和制霉素0.05g/mL，添加二甲基亞砜配制成副溶液，使用0.2μm無菌濾膜過濾滅菌；使用時(shí)，主溶液冷卻至50℃，添加2mL副溶液混勻使用。

樣品前處理：稱取10g發(fā)酵食品于已滅菌裝有100mL無菌PBS緩沖液(pH7.4，含0.5g/LD-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽)及3g玻璃珠的250mL三角瓶中，然后置于37℃、200r/min搖床振蕩混勻30min，靜置5min獲得菌懸液。

微生物培養(yǎng)：取10^-3、10^-4和10^-53個(gè)樣品菌懸液稀釋度涂布于上述MRS培養(yǎng)基平板中于37℃厭氧箱中培養(yǎng)84h，挑選挑取平板上周圍培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色的單菌落并編號(hào)，使用特異性引物進(jìn)行菌落PCR。PCR反應(yīng)條件和瓊脂糖凝膠電泳同“特異性引物驗(yàn)證”。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物不在100～250bp之間或者沒有條帶，說明耐酸乳桿菌在上述MRS培養(yǎng)基中沒有生長。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉次技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種快速篩選、鑒定及定量發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2328

<212> DNA

<213> 耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）

<400> 1

atggcaagtg taaataaaca tgttaattat aaattgatta cttcaattgc tgctgcgaca 60

ttattaggat taattgaatt acaaagtcaa acggtaaaag cagaggtaaa tgctacaccc 120

cttataatac aacaacgggt taaccaagat gataataatg atccgttgtt taacggtgct 180

gatgtttcaa atgggtatac tgataaaggc tatacctatg tagaaccaac tttaacatcc 240

ccagagcgtc aagactcata tcatttaacg actaatcaag gttggtcgaa tgatttgcaa 300

actattaact ataatcaaaa agataataat tataatttat attatcttca tacagagggt 360

ggagctaatg gcaatgcaac cggtggtcaa aactggcagc gtgtaacgac caaagacttt 420

actcacttta gcaaacccaa tactgctatt caggataaag gaaatattaa agatgcttgg 480

ggtagtgcct ggacaggatc aattattact aataaaggta atattaccgg tgtacctaaa 540

ggtgcacaag tagcttattt ttcagggtta agtattaagg ataaacaaca gaatatttgg 600

gcagcctggt cggataatga tggtcaaagt tttgatcata tcctttataa tggctttcca 660

gtaattgatc attattggga ttggacttct aaaaataaat ctgatgaaag agatccttcg 720

gttttttatt ggcataataa actaattatg tatgcggctg aaggtaatga tttaggtgtt 780

tatcaatccg cagatggtct ccattggtca aaagctaatc ccgaaaatga aagtaaggtt 840

tataacgatc agtattttaa agggctaaag tttgaagcac ctgtagaatg tcctgttgtt 900

cgaagcatga aaattgcaaa tggaactgta aaacaagttt tattctttgg tgctaaatcg 960

ccgcaagatg gtcaaactac tggtacctat tatatagttg gtcatttaga taacaatggg 1020

atctttttcc cagaaaacga tgttaagagg ttagatcagg ggacagatta ttacggtgcc 1080

aattttagtg gtagcgatga cctgtcaaaa gcagatgatt cgctgattag catggcttgg 1140

gtaggaaatt ggaattatat taattctggt ataaaaacta atcaagaaga tatgcccgta 1200

acttccaaga gattgggtgc ttatacttta gcaaggaaat tagttctaaa taatgataat 1260

actatttcaa gtacaccgat tactactaat cttgaagaaa aaagtggtaa tgaagttaat 1320

ggcaatgtta gttctaaacg agttgatgaa aatggtaatc acgagttagt taatttgaaa 1380

aagcaaccgg ctaatagtaa atatgttctc catttctcta caaaaaataa tgagaattat 1440

aatggtgctg ttcagataaa atttactcaa ggcaaagata ataattcaat tatttttaat 1500

ccggctaatg gacaatatcg tgtttatgga aatagcagtg aattaacagg tgcagctgca 1560

gattattata aaaatggatt atatagcggg ttaggttatc gtaatgattc tggattgaaa 1620

gataaacaag attttacttt aaccatttat actgataagg attcaattga attatttttc 1680

ccaaatgggg aaacttatac aatggcccgt ttttgtgtaa ataatattca agatgtatct 1740

attttaagtc aggatccgaa taagaataat aaatttaata ttagttttaa tcaggtagga 1800

cctgatttag ttggatatgt ggctaaacct aatgattcaa aggcaagttc tggaaatact 1860

gataacaata atattgactt taacagtaat aatattgtta cacctgataa ttatgtaaag 1920

ccagaaaagg aaccgaataa tatggctgaa attaaaggaa ctgctagtaa tagtcagttg 1980

atgcataatg catatattta tgatcaaaat ggtaagaaga taagtaatat cattttgcag 2040

gcttattcga ttttgaaaac ttacggtact aaaatgatta acggtaagaa gtattttgtt 2100

ttaagcaatg atcattatat tgctgcgggt aatatttctg gtagcaaacg taaacttagc 2160

cataatgctt atatttataa taaatgtggt aaacgtagtg ggaagcgtgt attaaagaaa 2220

aataaaagag ttaatactta tggtagtgct aaaaaaatta atggtaagaa atattatgct 2280

attggcaaaa ataaatttat aaaaaaagct aattttcaaa tcaaataa 2328

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aacatcccca gagcgtcaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggcactaccc caagcatctt 20