本發(fā)明涉及一種高效篩選魏斯氏菌的標記物及其應用，屬于微生物發(fā)酵技術領域。

背景技術：

魏斯氏菌是革蘭氏陽性菌，屬兼性厭氧、在有氧條件下生長迅速。不具備細胞色素、過氧化氫酶陰性?？赏ㄟ^磷酸戊糖和磷酸轉酮酶途徑異型發(fā)酵葡萄糖產D-和/或L-乳酸所，異型發(fā)酵葡萄糖還產CO₂、乙醇和(或)乙酸。魏斯氏菌在15℃能生長，一般最適生長溫度在30-37℃，有些菌株在42～45℃能生長。大部分魏斯氏菌來源于營養(yǎng)豐富的食品，食品來源的魏斯氏菌發(fā)酵產乳酸、乙酸、乙醇可增加發(fā)酵食品的風味及營養(yǎng)，其中產細菌素的W.cibaria應用于食物，可起到防腐的作用；W.confusa合成葡聚糖、果聚糖，能有效地促進體內有益菌生長，抑制腐敗菌生長；泡菜中W.koreensis菌株通過合成纖維素，具有抗肥胖效果。

目前分離鑒定魏斯氏菌的技術有通過菌落形態(tài)特征觀察、革蘭氏染色鏡鑒、接觸酶試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗等生理生化試驗對菌株進行分離鑒定；通過糖發(fā)酵試驗、菌株在4％NaCl、6.5％NaCl下是否生長，菌株在溫度為10、40、45℃下是否生長的試驗，初步進行魏斯氏菌種間鑒定。但是篩選周期通常需要一周左右，且需測定的參數(shù)多、步驟繁瑣、工作量大。利用生理生化指標分離篩選鑒定魏斯氏菌，準確性不高，需進一步的擴增菌株的16S rDNA序列進行驗證。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種魏斯氏菌的標記物，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種篩選魏斯氏菌的方法，根據SEQ ID NO.1所示序列設計引物，對待篩選的微生物進行菌落PCR，再將PCR產物進行凝膠核酸電泳分析和/或測序驗證，擴增獲得與SEQ ID NO,1所示序列存在≥75bp連續(xù)相同的核苷酸序列的菌株，或能夠擴增出片段大小為120～180bp的菌株即為魏斯氏屬的菌株。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述引物序列包括(1)～(5)任一對，其中，

(1)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA；

(2)上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC；

(3)上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG；

(4)上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC；

(5)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述PCR是按照以下程序進行的：94℃30s，94℃3min，55℃30s，72℃1min，72℃10min，12℃保持，循環(huán)數(shù)32。

在本發(fā)明的一種實施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為魏斯氏屬(Weissella)的微生物。

在本發(fā)明的一種實施方式中，采用上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為融合魏斯氏菌(Weissella confusa)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，采用上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為竇氏魏斯氏菌(Weissella cibaria)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，采用上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為綠色魏斯氏菌(Weissella viridescens)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為類腸膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將待分離的混合菌在含萬古霉素的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得單菌落，再進行菌落PCR。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述萬古霉素的含量為2.0～3.0g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述選擇性培養(yǎng)基含有：蛋白胨8.0～12.0g/L、牛肉粉4.0～6.0g/L、酵母粉3.0～5.0g/L、葡萄糖20.0～30.0g/L、吐溫80 1.0～2.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0～3.0g/L、乙酸鈉4.0～6.0g/L、檸檬酸三銨2.0～3.0g/L、硫酸鎂0.2～0.5g/L、硫酸錳0.05～0.1g/L，L-半胱氨酸0.5～1g/L，那他霉素1.0～1.5g/L，萬古霉素2.0～3.0g/L，初始pH為7.0～7.2。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述選擇性培養(yǎng)基含有：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐溫80 1.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，萬古霉素2.0g/L，初始pH為7.0～7.2。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述魏斯氏菌是魏斯氏屬的菌株，包括但不限于類腸膜魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、竇氏魏斯氏菌、綠色魏斯氏菌、微小魏斯氏菌、赫倫魏斯氏菌、坎氏魏斯氏菌、土壤魏斯氏菌。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述培養(yǎng)是按下述操作進行：將待分離的樣品接種至選擇性培養(yǎng)基，在37℃靜置富集培養(yǎng)12～24h，將上述培養(yǎng)液稀釋涂布至固體選擇性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～36h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法的具體步驟如下：

1)將樣品接種于選擇性培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h得培養(yǎng)液，所述的選擇性培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐溫80 1.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，萬古霉素20g/L，調節(jié)初始pH為7.0，；

2)將上述培養(yǎng)液稀釋涂布至固體選擇性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36h；所述的固體選擇性培養(yǎng)基是含20g/L瓊脂的步驟(1)所述的選擇性培養(yǎng)基；

3)根據SEQ ID NO.1設計引物，挑選步驟2)獲得的單菌落進行特異性引物菌落PCR，PCR產物用2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳成像，能夠得到大小為100～200bp的條帶的菌株為魏斯氏菌。

本發(fā)明還提供一種魏斯氏菌選擇性培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐溫80 1.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，萬古霉素2g/L，瓊脂20g/L調節(jié)初始pH為7.0。

本發(fā)明還提供所述標記物在食品、生物、醫(yī)藥領域鑒定魏斯氏菌方面的應用。

本發(fā)明還提供所述篩選方法在高通量領域的應用。

有益效果：本發(fā)明通過特異性標記物進行菌落PCR，來達到高效準確篩選魏斯氏菌的目的，相比于傳統(tǒng)的菌落形態(tài)和生理特性篩選、選擇性培養(yǎng)基篩選、16S rDNA擴增、更加高效準確，篩選過程的周期小于36h，分離、鑒定準確性接近100％，該方法無需鏡檢、提取基因組等繁瑣的步驟，快速且高效，可實現(xiàn)高通量批量處理，極大減少了工作量，降低了成本。

附圖說明

圖1為標記物特異性驗證的凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；A，融合魏斯氏菌(W.confusa)擴增后的標記物條帶；B，竇氏魏斯氏菌(W.cibaria)擴增后的標記物條帶；C，綠色魏斯氏菌(W.viridescens)擴增后的標記物條帶；D，類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)擴增后的標記物條帶；1，陽性對照；空白，陰性對照。

圖2為混菌體系中標記物特異性驗證的凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；

圖3為菌株用序號1的引物擴增所得凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；

圖4為菌株用序號2的引物擴增所得凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；

圖5為菌株用序號3的引物擴增所得凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；

圖6為菌株用標記物4引物擴增所得凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；

圖7為醬醪中魏斯氏菌的凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；

圖8為酒醅中魏斯氏菌的凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；空白，為陰性對照；

圖9為土壤中魏斯氏菌的凝膠電泳圖；M:500bp DNA maker；數(shù)字為菌株編號；空白，為陰性對照。

具體實施方式

以下結合具體的實例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。

選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐溫80 1.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，萬古霉素20g/L，調節(jié)初始pH為7.0(萬古霉素添加時間為滅菌后培養(yǎng)基溫度冷卻至60～70℃時)。

固體選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐溫80 1.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，萬古霉素2g/L，瓊脂20g/L調節(jié)初始pH為7.0(萬古霉素添加時間為滅菌后培養(yǎng)基溫度冷卻至60～70℃時)。

實施例1

(1)將融合魏斯氏菌(W.confusa)、竇氏魏斯氏菌(W.cibaria)、綠色魏斯氏菌(W.viridescens)、類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)分別接種于MRS培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)24h得到菌液，利用試劑盒提取上述菌株的基因組(依次編號為A、B、C、D)。

(2)根據SEQ ID NO.1所示序列進行引物設計，上游引物GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物AACCATGCGGTTGTTGGTA，采用以標記物設計的引物進行PCR擴增(94℃30s，94℃3min，55℃30s，72℃1min，72℃10min，12℃保持，循環(huán)數(shù)32)，以無菌水為陰性對照，以酒醅宏基因組作為陽性對照，結果如圖1所示。均擴增出大小約140bp的目的片段。

(3)采用步驟(1)培養(yǎng)后的菌液直接進行PCR，引物與步驟(2)相同。結果顯示，能夠擴增出與基因組擴增出的相同大小的目的片段。

實施例2

(1)將解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜鹽四聯(lián)球菌、羅伊斯乳桿菌分別接種于MRS培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)24h得到菌液，利用試劑盒提取上述菌株的基因組(依次編號為E、F、G、H)。采用實施例4相同的引物和擴增條件分別對培養(yǎng)后的菌液及E、F、G、H進行PCR擴增，結果顯示，均未擴增出目的片段。

實施例3

(1)將融合魏斯氏菌(W.confusa)、竇氏魏斯氏菌(W.cibaria)、綠色魏斯氏菌(W.viridescens)、類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜鹽四聯(lián)球菌、羅伊斯乳桿菌分別接種于MRS培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)24h得到菌液。將上述菌液混合，梯度稀釋并涂布于固體的選擇性培養(yǎng)基。根據SEQ ID NO.1所示序列設計引物，引物序列為GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA/AACCATGCGGTTGTTGGTA。采用該引物進行菌落PCR，共72個菌落，PCR結果見圖2。

(2)采用表1所示的引物對步驟(1)獲得的菌體分別用引物1～4進行菌落PCR擴增。用序號1的引物擴增后的電泳圖如圖3所示。將圖3中未擴增出條帶的菌株，采用序號2的引物進行PCR擴增，結果如圖3所示。將圖3中未擴增出目的條帶的菌株用序號3的引物進行擴增，結果如圖5所示。將圖5中未擴增出條帶的菌株用序號4的引物進行擴增，結果如圖6所示。

(3)對步驟2擴增成功的條帶進行測序，結果顯示，僅通過序號1的引物擴增獲得目的片段序列如SEQ ID NO,2所示，與SEQ ID NO,1相比從第16到第100位核苷酸序列相同，對應的菌株為融合魏斯氏菌；僅通過序號2的引物擴增獲得目的片段序列如SEQ ID NO,3所示，；與SEQ ID NO,1相比從第24到第102位核苷酸序列相同，對應的菌株為竇氏魏斯氏菌；僅通過序號3的引物擴增獲得目的片段序列如SEQ ID NO,4所示，與SEQ ID NO,1相比從第18到第102位核苷酸序列相同，對應的菌株為綠色魏斯氏菌；僅通過序號4的引物擴增獲得目的片段序列如SEQ ID NO,5所示，與SEQ ID NO,1相比從第34到第110位核苷酸序列相同，對應的菌株為類腸膜魏斯氏菌。

表1 魏斯氏菌特異性引物序列

(4)隨機選取20株步驟3鑒定獲得的不同種的菌株的基因組序列，以及編號為1～8、21、46、47這幾株未擴增出目的片段的菌株，采用通用引物1492R和27F進行16S rDNA擴增，將擴增后的序列與Genbank數(shù)據庫進行比對，驗證步驟(2)的鑒定結果。結果顯示，16SrDNA的鑒定結果與步驟3的鑒定結果一致，編號為1～8、21、46、47的菌株均不是魏斯氏屬的菌株。說明引物GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA/AACCATGCGGTTGTTGGTA能夠成功區(qū)分魏斯氏屬的微生物，表1的特異性引物能夠進一步地對魏斯氏屬的菌株進行準確分類。

實施例4醬醪中魏斯氏菌的篩選

1.菌株的富集培養(yǎng)

配制稱取10～20g醬醪樣品接種于200mL選擇性培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h獲得培養(yǎng)液。

2.菌株的篩選

將步驟1獲得的培養(yǎng)液稀釋涂布至固體選擇性培養(yǎng)基，37℃培36h。挑取培養(yǎng)基上100個單菌落分別編號為1～72，對這72個菌株進行特異性引物菌落PCR，PCR程序為：94℃30s，94℃3min，55℃30s，72℃1min，72℃10min，12℃保持，循環(huán)數(shù)32(以無菌水為陰性對照)。PCR產物用2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳成像，能夠得到大小為120～160bp的特異性條帶的菌株為所需菌株。擴增結果顯示，共得到63株與條帶相符的菌株。如圖7所示，獲得片段大小約140bp的條帶，與SEQ ID NO.1所示標記物片段大小一致。

3.魏斯氏菌的鑒定

將步驟2中獲得的目的片段一致的73個菌株接種于選擇性培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)24h得到菌液，利用試劑盒提取各菌株的基因組后進行16S rRNA擴增，測序鑒定菌株。結果顯示，均為魏斯氏菌，其中Weissella paramesenteroides菌株24個，Weissella confusa菌株21個，Weissella cibaria菌株17個，Weissella viridescens菌株11個。

實施例5酒醅中魏斯氏菌的篩選

1.酒醅樣品中菌株的富集培養(yǎng)

稱取10～20g酒培樣品接種于200mL選擇性培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h獲得培養(yǎng)液。

2.酒醅樣品中菌株的篩選

將上述培養(yǎng)液稀釋涂布至固體選擇性培養(yǎng)基，37℃培36h。挑取培養(yǎng)基上100個單菌落分別編號為1～100，對這100個菌株進行特異性引物菌落PCR。PCR產物用2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳成像，共得到65株與條帶相符的菌株，部分電泳圖如圖8所示。

3.酒醅樣品中魏斯氏菌的鑒定

將步驟2中獲得的目的片段一致的65個菌株接種于選擇性培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)24h得到菌液，利用試劑盒提取各菌株的基因組后進行16S rRNA擴增，測序鑒定菌株。結果顯示，均為魏斯氏菌，其中Weissella paramesenteroides菌株16個，Weissella confusa菌株19個，Weissella cibaria菌株20個，Weissella viridescens菌株10個。

實施例6土壤中魏斯氏菌的篩選

1.土壤樣品中菌株的富集培養(yǎng)

稱取10～20g土壤樣品接種于200mL選擇性培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h獲得培養(yǎng)液。

2.土壤樣品中菌株的篩選

將上述培養(yǎng)液稀釋涂布至固體選擇性培養(yǎng)基，37℃培36h。挑取培養(yǎng)基上100個單菌落分別編號為1～100，對這100個菌株進行特異性引物菌落PCR。PCR產物用2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳成像，共得到69株與條帶相符的菌株，部分電泳圖如圖9所示。

3.土壤樣品中魏斯氏菌的鑒定

將步驟2中獲得的目的片段一致的69個菌株接種于選擇性培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)24h得到菌液，利用試劑盒提取各菌株的基因組后進行16S rRNA擴增，測序鑒定菌株。結果顯示，均為魏斯氏菌，其中Weissella paramesenteroides菌株18個，Weissella confusa菌株15個，Weissella cibaria菌株20個，Weissella viridescens菌株16個。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種高效篩選魏斯氏菌的標記物及其應用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcgtgagct gcatcggaat ggacgaaatg ttatccggat taatgggact ttgctcaacg 60

caacagcgtt aaaagaagtg ggcaatcatt tggttgatat tcatgggcaa aatgagcacc 120

aagcgttaat gcaggttgat 140

<210> 2

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcggattgg tctctttttg ggaatggacg aaatgttatc cggattaatg ggactttgct 60

caacgcaaca gcgttaaaag aagtgggcaa tcatttggtt gatattcatg ggcaaaatga 120

gcacgctcag taaccgtgtg c 141

<210> 3

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcatccgtca gttcatcaca tggacgaaat gttatccgga ttaatgggac tttgctcaac 60

gcaacagcgt taaaagaagt gggcaatcat ttggttgaga ttacgcactt accacagg 118

<210> 4

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcaaacaca acaagcctat tcggaatgga cgaaatgtta tccggattaa tgggactttg 60

ctcaacgcaa cagcgttaaa agaagtgggc aatcatttgt gttgagcaag ttccaaagc 119

<210> 5

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctctgaagt gattttatct gactccggat taatgggact ttgctcaacg caacagcgtt 60

aaaagaagtg ggcaatcatt tggttgatat tcatgggcaa ccatgcggtt gttggta 117

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctgaagt gattttatct gaca 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaccatgcgg ttgttggta 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcggattgg tctctttttg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cacgctcagt aaccgtgtgc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcatccgtca gttcatcac 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gattacgcac ttaccacagg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgcaaacaca acaagcctat 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgttgagcaa gttccaaagc 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctctgaagt gattttatct gac 23

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaccatgcgg ttgttggta 19