本發(fā)明涉及元素含量檢測(cè)領(lǐng)域，具體為一種快速定量檢測(cè)植物及食品中無機(jī)硒含量的方法。

背景技術(shù)：

目前檢測(cè)食品中無機(jī)硒含量的方法，有湖北地標(biāo)《富有機(jī)硒食品硒含量要求》，杭州地標(biāo)《稻米中有機(jī)硒和無機(jī)硒含量的測(cè)定》，國(guó)標(biāo)中有富硒酵母、富硒食用菌粉、硒化卡拉膠的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。其中，湖北地標(biāo)的檢測(cè)方法是將水相中的硒，經(jīng)過環(huán)己烷萃取，除去部分有機(jī)硒，剩下的水溶性硒經(jīng)過消化處理后，都計(jì)算為無機(jī)硒；國(guó)標(biāo)中的富硒酵母、富硒食用菌粉的標(biāo)準(zhǔn)是水相中的硒直接用原子熒光檢測(cè)，數(shù)值作為無機(jī)硒含量。但是在原子熒光檢測(cè)中，+4價(jià)的硒是主要響應(yīng)值，而其他價(jià)態(tài)的硒，在原子熒光上也有響應(yīng)值，會(huì)引起干擾。這些簡(jiǎn)單的物理方法沒有辦法做到完全準(zhǔn)確的定量檢測(cè)植物及食品中的無機(jī)硒含量。

其他主要依賴檢測(cè)設(shè)備的有機(jī)硒含量的檢測(cè)方法，例如高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜、氣相質(zhì)譜，設(shè)備投入大，人員要求配置高；而hplc-hg-afs方法，一般是通過各種酶的水解，將水解后各種含硒氨基酸的含量相加，得到有機(jī)硒的含量，將總硒含量減去測(cè)得的有機(jī)硒含量，得到無機(jī)硒的含量，但水解過程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，差值算法得到的無機(jī)硒含量在精準(zhǔn)度也容易出現(xiàn)偏差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種快速定量檢測(cè)植物及食品中無機(jī)硒含量的方法，所述方法所用設(shè)備價(jià)格低廉，檢測(cè)過程中不需要復(fù)雜的水解過程，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)精確度高，檢測(cè)迅速。檢測(cè)限可達(dá)0.1ug/ml；seo3^2-0.1～50ug/ml范圍內(nèi)線性良好,seo4^2-0.119～5.96ug/ml范圍內(nèi)線性良好。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種快速定量檢測(cè)植物及食品中無機(jī)硒含量的方法，其特征在于，利用由高效液相色譜、在線消解裝置和原子熒光檢測(cè)器組合而成的hplc-hg-afs聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)所述植物或食品中seo3^2-和seo4^2-的含量，將檢測(cè)結(jié)果相加即得到所述植物或食品中無機(jī)硒的含量。

具體包括以下步驟：

1)分析儀器系統(tǒng)配置：將高效液相色譜、在線消解裝置和原子熒光檢測(cè)器組合成hplc-hg-afs聯(lián)用系統(tǒng)；

高效液相色譜的體積在0.1ul～100ul；

所述高效液相色譜中流動(dòng)相為磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液或添加有機(jī)試劑的磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液；洗脫方式為同種流動(dòng)相等度洗脫；

或配置兩種以上流動(dòng)相，通過所述兩種以上流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；

所述在線消解裝置為紫外消解，消解液為含氫氧化鉀的碘化鉀溶液；

2)樣品處理：稱取精確度到0.0001g的待測(cè)樣品0.5g～1.0g，置于燒杯中，加入30～80ml純水，靜置后置于50～70℃的水浴中超聲5～30min后過濾，取濾液，所述濾液純水定容，經(jīng)水相濾膜過濾后得到浸提液備用；

3)無機(jī)硒檢測(cè)：用外標(biāo)法測(cè)定所述浸提液中的seo3^2-和seo4^2-的含量，測(cè)得seo3^2-的含量和seo4^2-含量的和即為所測(cè)樣品中無機(jī)硒的總量。

所述步驟1)中磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液濃度范圍在5～100mol/l。

所述步驟1)中磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液ph范圍在2.5～9.5。

所述步驟1)中添加有機(jī)試劑的磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液中，有機(jī)試劑占緩沖液的體積比0％～100％。

所述有機(jī)試劑為甲醇、乙醇、丙酮中的一種或幾種。

所述步驟2)消解液中碘化鉀的質(zhì)量濃度為0.01％～50％。

所述步驟2)消解液中氫氧化鉀的質(zhì)量濃度為0.01％～10％。

所述步驟2)中待測(cè)樣品是所述植物或食品干燥研磨后的粉態(tài)樣品。

所述步驟3)中外標(biāo)法包括測(cè)定seo3^2-和seo4^2-標(biāo)準(zhǔn)曲線和混合標(biāo)樣色譜；所述seo3^2-和seo4^2-標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定用到實(shí)際分別為亞硒酸鉀和硒酸鉀；所述混合標(biāo)樣為1mg/mll-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1mg/ml硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1mg/mlse-甲基硒代-l-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1mg/mlk2seo3標(biāo)準(zhǔn)溶液和1mg/mlk2seo4標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合溶液。

本發(fā)明的技術(shù)效果為：

本發(fā)明所述方法利用hplc-hg-afs系統(tǒng)，以磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液或含有有機(jī)試劑的磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液為流動(dòng)相，直接測(cè)定無機(jī)硒的含量，測(cè)定效果好，省去了現(xiàn)有技術(shù)中hplc-hg-afs系統(tǒng)必須先使待測(cè)樣品中各種酶水解這一耗時(shí)過程，檢測(cè)迅速，操作簡(jiǎn)單，避免了因酶未充分水解帶來的計(jì)算誤差，同時(shí)所述流動(dòng)相使得各組分干擾少，分離清晰準(zhǔn)確，檢測(cè)準(zhǔn)確度高。

附圖說明

圖1是標(biāo)樣中seo3^2-工作曲線，y＝969.7x-291.52(r＝0.9994)

圖2是標(biāo)樣中seo4^2-工作曲線，y＝715.13x-23.428(r＝0.9967)

圖3是實(shí)例1混合標(biāo)樣的色譜圖。

圖4是實(shí)例3混合標(biāo)樣的色譜圖。

如圖3及圖4所示，從左到右主峰依次為l-硒代胱氨酸、se-甲基硒代-l-半胱氨酸、亞硒酸鉀、硒代蛋氨酸、硒酸鉀。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述方法采用的是高效液相色譜-在線消解-原子熒光檢測(cè)器，高效液相色譜對(duì)seo3⁴⁺和seo4⁶⁺及其他各種硒代氨基酸及其衍生物和硒脲等成分，做到完全分離；在線消解單元將色譜分離后的各種含硒成分轉(zhuǎn)為氫化物。所述方法通過對(duì)seo3^2-和seo4^2-的含量的檢測(cè)，相加得出植物及食品中無機(jī)硒的含量。該方法設(shè)備價(jià)格低廉，使用方法精確，數(shù)據(jù)精確度高，檢測(cè)迅速。具體包括：

1、系統(tǒng)配置

將高效液相色譜、在線消解裝置、原子熒光檢測(cè)器組裝成一個(gè)聯(lián)用系統(tǒng)。高效液相色譜通過對(duì)seo3^2-、seo4^2-、硒代氨基酸及其衍生物、小分子硒脲之類的含硒化合物進(jìn)行分離；經(jīng)過在線消解裝置之后，將各個(gè)形態(tài)的含硒化合物都轉(zhuǎn)化為氫化物，從而被原子熒光檢測(cè)器檢測(cè)。

2、儀器分析方法

流動(dòng)相為不同濃度、不同ph的磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液；添加不同有機(jī)試劑的溶液；洗脫方式為等度洗脫，也可配制成2種以上不同濃度的流動(dòng)相，通過改變流動(dòng)相的比例進(jìn)行梯度洗脫。通過改變流動(dòng)相中的有機(jī)相和水相的比例，水相中鹽含量的比例，兩種鹽之間的不同配比，鹽溶液的不同ph值，達(dá)到將不同含硒化合物達(dá)到良好分離的效果。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

精密稱取亞硒酸鉀適量，用水稀釋制成若干個(gè)每1ml中硒含量不同的溶液，分別取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積a為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果求得回歸方程。

精密稱取硒酸鉀適量，用水稀釋制成若干個(gè)每1ml中硒含量不同的溶液，分別取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積a為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果求得回歸方程。

4、混合標(biāo)準(zhǔn)品的配置

稱取l-硒代胱氨酸，用濃hcl溶解，用水定容，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mll-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取硒代蛋氨酸，用稀鹽酸溶解并定容，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/ml硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取se-甲基硒代-l-半胱氨酸，用濃hcl溶解，用水定容，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mlse-甲基硒代-l-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取k2seo3，用稀鹽酸溶解并定容，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mlk2seo3標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取k2seo4，用水溶解并定容，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mlk2seo4標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取不同體積的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成混合標(biāo)準(zhǔn)液，0.22um水相濾膜過濾后使用。

5、樣品的處理

稱取待測(cè)樣品0.5g～1.0g(精確至0.0001g)，置于燒杯中，加入少量純水，靜置一段時(shí)間，于水浴超聲后過濾，取濾液，純水定容，經(jīng)水相濾膜過濾后使用。

6、無機(jī)硒含量測(cè)定：用外標(biāo)法定性定量測(cè)定樣品浸提液中的seo3^2-和seo4^2-的含量，和為無機(jī)硒總量。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

1.1儀器和試劑

高效液相色譜采用安捷倫1100；在線消解裝置采用北分瑞利pdi-10；原子熒光檢測(cè)器采用af-640a。

磷酸二氫鉀(純度：99％)、氯化鉀(純度：99％)、氫氧化鉀(化學(xué)純，純度：85％)、硼氫化鉀(ar)、鹽酸(ar)、碘化鉀(ar)、硒代胱氨酸(純度：98％)、se-甲基硒代-l-半胱氨酸(純度：98％)、亞硒酸鉀(純度：98％)、硒代蛋氨酸(純度：98％)、硒酸鉀(純度：99％)。

1.2以富硒植物a為檢測(cè)樣品，富硒植物a為干燥粉末態(tài)。

1.3檢測(cè)方法

表1分析儀器參數(shù)

表2在線消解裝置及原子熒光參數(shù)

1.3.1檢測(cè)限和線性范圍

精密稱取亞硒酸鉀適量，用水稀釋制成每1ml中分別硒含量為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、35ug的溶液，分別取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積a為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果求得回歸方程為：y＝969.7x-291.52(r＝0.9994)。檢測(cè)見過如圖1所示，seo3^2-0.1～50ug/ml范圍內(nèi)線性良好。

精密稱取硒酸鉀適量，用水稀釋制成每1ml中分別硒含量為0.119、0.238、0.592、0.954、1.19、2.38、5.96ug的溶液，分別取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積a為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果求得回歸方程為：y＝715.13x-23.428(r＝0.9967)。樣品處理。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，seo4^2-0.119～5.96ug/ml范圍內(nèi)線性良好。

1.3.2混合標(biāo)準(zhǔn)品制備

稱取l-硒代胱氨酸，用1ml濃hcl溶解，用水定容至50ml容量瓶中，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mll-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取硒代蛋氨酸，用2％的鹽酸溶解并定容至50ml容量瓶中，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/ml硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取se-甲基硒代-l-半胱氨酸，用1ml濃hcl溶解，用水定容至50ml容量瓶中，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mlse-甲基硒代-l-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取k2seo3，用2％的鹽酸溶解并定容至50ml容量瓶中，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mlk2seo3標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取k2seo4，用水溶解并定容至50ml容量瓶中，密封，振蕩均勻，4℃避光保存。制成1mg/mlk2seo4標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取0.4ml1mg/mll-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、20ml1mg/ml硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、22ml1mg/mlse-甲基硒代-l-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、3.6ml1mg/mlk2seo3標(biāo)準(zhǔn)溶液和5.5ml1mg/mlk2seo4標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成混合標(biāo)準(zhǔn)液，0.22um水相濾膜過濾后使用。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

1.4樣品處理

稱取待測(cè)樣品0.5015g富硒植物a，置于燒杯中，加入50ml純水，靜置后于50℃水浴超聲30min后過濾，取濾液，純水定容，經(jīng)水相濾膜過濾后使用。

實(shí)施例2

以壓片糖果樣品a為待測(cè)樣品，所述壓片糖果樣品a為干燥粉末態(tài)，稱取壓片糖果樣品a0.4950g，置于燒杯中，加入40ml純水，靜置后于70℃水浴超聲20min后過濾，取濾液，純水定容，經(jīng)水相濾膜過濾后使用。

其他檢測(cè)方法及使用儀器同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

檢測(cè)方法

表1分析儀器參數(shù)

表2在線消解裝置及原子熒光參數(shù)

以富硒植物b為待測(cè)樣品，所述富植物b為干燥粉末態(tài)，稱取富硒植物b0.5134g，置于燒杯中，加入45ml純水，靜置后于50℃水浴超聲30min后過濾，取濾液，純水定容，經(jīng)水相濾膜過濾后使用。

其他檢測(cè)方法及使用儀器同實(shí)施例1。

實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3所測(cè)樣品的結(jié)果如表3所示。

表3結(jié)果分析

上述實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3中，所述富硒植物a、b為堇葉碎米薺，取莖葉烘干后粉碎作為待測(cè)樣品；壓片糖果樣品a為恩施德源健康科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品富硒苦瓜雪蓮果精華片。

圖3的各個(gè)硒的組分的保留時(shí)間分別為3.8min，4.6min，5.6min，7.5min，18.0min，組分和組分之間的相互干擾少，基本能做到基線分離；圖4的各個(gè)硒的組分的保留時(shí)間分別為3.8min，4.6min，5.4min，7.5min，15.0min，組分和組分之間的相互干擾少，基本能做到基線分離；可以看出當(dāng)流動(dòng)相為磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液或添加有甲醇的磷酸二氫鉀和氯化鉀緩沖液，無機(jī)硒測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。