本發(fā)明涉及一株生防用解淀粉芽胞桿菌及其應用。
背景技術：
：近年來，化學農(nóng)藥的大量使用，造成3R問題(抗藥性，農(nóng)藥殘留和有害生物再猖獗)突出。特別是隨著人們生活水平的提高，對農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)要求越來越高，高毒的化學農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用也越來越受到限制。因此人們迫切需要一種綠色，安全，高效的防治植物病蟲害的方式，而生物防治將是解決這一問題的重要途徑。芽胞桿菌(Bacillussp.)是一種革蘭氏陽性細菌。因其在生長過程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細菌生長的代謝物，又能夠產(chǎn)生抗逆性強(如耐熱、耐旱、抗紫外線等)的芽胞，成為了理想的生防菌篩選對象。研究表明，目前應用于防治植物病害的芽胞桿菌屬細菌主要有解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)和多粘芽胞桿菌(B.polymyxa)等。其中，解淀粉芽胞桿菌是生防菌中研究最多的一類，其特點是在自然界中分布廣泛，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類多，抑菌活性強、抑菌譜廣等，在植物病害的田間防治中也得到了應用和重視。另外解淀粉芽孢桿菌還具有誘導植物產(chǎn)生抗性、促進植物生長的功能，生防潛力巨大。生防解淀粉芽孢桿菌資源豐富，但不同株系間的生防能力具有一定差異，需要深入挖掘和充分開發(fā)利用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一株生防用解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)及其應用。本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌分離于北京市平谷區(qū)桃樹根圍土壤中，命名為X1-b，已于2016年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNo.12742。X1-b在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后形成乳白色圓形菌落，不透明，邊緣不整齊，菌落上褶皺狀突起，內(nèi)部呈環(huán)狀凹陷。油鏡下觀察為桿狀細胞，細胞為1.07～1.25μm×2.37～3.09μm。本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌具有針對植物病原真菌和植物病原細菌的抑菌活性。所述植物病原真菌為蕓苔鏈格孢Alternariabrassicae、細極鏈格孢Alternariatenuissima、葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea、白腐盾殼霉菌Coniothyriumdiplodiella、大斑凸臍蠕孢Exserohilumturcicum、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、腐皮鐮刀菌Fusariumsolani、圍小叢殼菌Glomerellacingulata、棒形擬盤多毛孢Pestalotiopsisclavispora、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、意大利青霉Penicilliumitalicum、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、藤倉鐮刀菌Fusariumfujikuroi、莖點霉屬Phomasp.和蘋果黑腐皮殼菌Valsamali；所述植物病原細菌為醋酸桿菌Acetobactermalorum、西瓜食酸菌Acidovoraxcitrulli、葡糖桿菌Gluconobacteroxydans、胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacteriumcarotovorum、丁香假單胞桿菌斑生致病變種Pseudomonassyringaepvmaculicola。本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌可用于制備針對植物病原真菌和植物病原細菌的生防菌劑或微生物菌肥。其中，所述植物病原真菌為蕓苔鏈格孢Alternariabrassicae、細極鏈格孢Alternariatenuissima、葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea、白腐盾殼霉菌Coniothyriumdiplodiella、大斑凸臍蠕孢Exserohilumturcicum、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、腐皮鐮刀菌Fusariumsolani、圍小叢殼菌Glomerellacingulata、棒形擬盤多毛孢Pestalotiopsisclavispora、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、意大利青霉Penicilliumitalicum、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、藤倉鐮刀菌Fusariumfujikuroi、莖點霉屬Phomasp.和蘋果黑腐皮殼菌Valsamali；所述植物病原細菌為醋酸桿菌Acetobactermalorum、西瓜食酸菌Acidovoraxcitrulli、葡糖桿菌Gluconobacteroxydans、胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacteriumcarotovorum、丁香假單胞桿菌斑生致病變種Pseudomonassyringaepvmaculicola。解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-bCGMCCNo.12742在制備抗生素中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述抗生素為合成表面活性素(surfactin)、桿菌霉素(bacillomycin)、豐原素(fengycin)和/或抗霉枯草菌素(mycosubtilin)。本發(fā)明還提供了針對植物病原真菌和植物病原細菌的生防菌劑微生物菌肥，其中所述生防菌劑的活性成分為本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌。本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌具有對植物病原真菌和植物病原細菌的抑菌活性并且具有較寬的抑菌譜。附圖說明圖1為X1-b的革蘭氏染色(圖a)和芽胞染色結(jié)果(圖b)(100倍油鏡下觀察)。圖2為拮抗菌X1-b鞭毛染色。圖3X1-b的16SrDNA擴增電泳圖；圖注：圖中M為marker,1分別為X1-b。圖4、細菌X1-bgyrB基因擴增電泳圖圖注：圖中M為marker,1分別為X1-b。圖5為生防菌液對黃瓜綿腐病的防治效果。圖6為生防菌液對柑橘青霉病的防治效果。圖7為解淀粉芽胞桿菌X1-b合成的4種抗菌肽基因簇示意圖；圖注：A：表面活性素；B：桿菌霉素；C：豐原素；D：抗霉枯草菌素。具體實施方式實施例1.拮抗細菌X1-b的分離及鑒定一、菌株X1-b的分離拮抗細菌X1-b菌株分離自北京市平谷區(qū)桃樹根圍土壤，分離方法：土壤溶液梯度稀釋法稱取0.5g桃樹根圍土壤溶于50mL的滅菌水中，用滅菌水梯度稀釋，最后涂在NA(牛肉膏蛋白胨)培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)2d(天)。用滅菌牙簽挑取上訴培養(yǎng)的菌落，置于放有靶標病原真菌—蘋果樹皮腐爛病菌(Valsamali)的PDA培養(yǎng)基上。25℃培養(yǎng)3～5d，檢查各細菌對病原真菌的抑菌帶寬度。結(jié)果篩選到蘋果樹皮腐爛病菌有較強活性的生防菌命名為菌株X1-b。二、菌株X1-b的鑒定1、芽胞桿菌X1-b的形態(tài)觀察及部分生理生化鑒定1)菌落形態(tài)觀察將純化的X1-b菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，瓊脂條17g，蒸餾水1000mL，pH＝7.0，121℃高壓滅菌15min。)上，28℃培養(yǎng)48h。觀察平板菌落特征，包括色澤、平滑或有褶皺、致密或疏松、質(zhì)地、邊緣溝紋等形態(tài)。2)革蘭氏染色A、染色試劑(1)草酸銨結(jié)晶紫染液甲液：結(jié)晶紫2.0g，乙醇(95％)20mL乙液：草酸銨0.8g，蒸餾水80mL將甲、乙兩液相混合，靜置48h后使用(2)盧哥爾氏碘液碘片1g,KI2g，蒸餾水300mL；先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，再將碘單質(zhì)溶于濃碘化鉀溶液中，待碘完全溶解后再加水稀釋至300mL。(3)脫色劑：95％的乙醇(4)復染劑：0.5％的蕃紅水溶液：蕃紅O乙醇液(2.5％)20m1，蒸餾水80m1，可將2.5％蕃紅O乙醇液作為母液，貯存在棕色瓶中，使用時再稀釋。B、染色方法取X1-b菌株接種于NB培養(yǎng)基(NB(營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，pH＝7.0，121℃高壓滅菌15min。)中，28℃培養(yǎng)過夜，取0.1mL，在載玻片上涂片、干燥和固定。(1)初染：用結(jié)晶紫覆蓋載玻片1min，水洗。(2)媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋1min，水洗。(3)脫色：將載玻片上的水甩凈，并襯以白背景，用95％乙醇滴洗至流出乙醇剛剛不出現(xiàn)紫色為止，約20～30s，立即用水沖凈乙醇。(4)復染：用蕃紅液染1～2min，水洗。(5)鏡檢：干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。3)芽胞染色A、芽胞染色液(1)孔雀綠染液：孔雀綠5g，蒸餾水100mL。(2)蕃紅水溶液：蕃紅0.5g，蒸餾水100m1。B、染色方法分別取培養(yǎng)48h的X1-b菌株培養(yǎng)液0.lmL在載玻片上涂片，干燥，固定。滴加3-5滴孔雀綠染液于己固定的涂片上。用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿使沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約4～5min。傾去染液，待載玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。用蕃紅水溶液復染1min，水洗。待干燥后，置油鏡下觀察，芽胞呈綠色，菌體呈紅色。4)鞭毛染色與夾饃染色A、鞭毛染色液A液：丹寧酸5.0g，F(xiàn)eCl31.5g，福爾馬林(15％)2.0mL，氨水5mL，NaOH(1％)1.0mL,蒸餾水100mL。B液：AgNO32g，蒸餾水100mL。將AgNO3溶解后，取出10mL備用，向其余的90mLAgNO3溶液中慢慢滴入濃氫氧化銨，則形成很渾厚的沉淀，再繼續(xù)滴加氫氧化銨并不斷搖動試液到剛剛?cè)芙獬恋沓蔀槌吻迦芤簽橹?。再用備用的硝酸銀慢慢回滴，則出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀的沉淀又消失，再繼續(xù)滴入硝酸銀，直到搖動后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。將X1-b菌株接種于NA平板上培養(yǎng)過夜。挑取平板菌種培養(yǎng)物于盛有1～2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液用于制片。取一滴菌液于載玻片的一端，然后將玻片傾斜，使菌液緩緩流向另一端，用吸水紙吸去玻片下端多余的菌液，室溫自然干燥。涂片干燥后，滴加硝酸銀染色A液覆蓋3～5min，用蒸餾水充分洗去A液，再用B液覆蓋涂片染色約數(shù)秒至1min，當涂片出現(xiàn)明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗。干燥后用油鏡觀察，觀察時，可從玻片的一段逐漸移至另一端，油鏡下觀察鞭毛。夾饃染色：使用培養(yǎng)2d的X1-bNA平板培養(yǎng)物，取菌落溶于無菌水中并涂片，在空氣中自然干燥，注意不可加熱干燥固定。用1％的結(jié)晶紫水溶液染色2min，以20％的硫酸銅水溶液沖洗，用吸水紙吸干殘液，干后用油鏡觀察。5)運動性檢測用接種針穿刺接種，將菌種接種到檢測培養(yǎng)基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂6g，蒸餾水1000mL，pH＝7.2，121℃高壓滅菌15min)上，28℃培養(yǎng)4d，接種后每24h目測觀察生長情況。若生長物由穿刺線向四周呈云霧狀擴散，則表示試驗菌株有運動性，為陽性。6)好氣性檢測將X1-bNA斜面培養(yǎng)物中加入無菌水約2mL，制成菌懸液。將裝有NA的試管加熱融化并保溫5～10min。將試管取出置室溫靜置冷卻至45～50℃時，用移液器向每個試管中加300μL菌懸液，之后雙手快速搓動試管，避免振蕩使過多空氣混入培養(yǎng)基，待菌體均勻分布于培養(yǎng)基內(nèi)后，將試管至于冰浴中，使瓊脂迅速凝固。最后將試管之于28℃溫室中靜置保溫48h后開始連續(xù)進行觀察，直至結(jié)果清晰為止。7)V-P測定將X1-b菌種接種于V-P測定培養(yǎng)基(蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO45g，水1000mL，pH7.0～7.2，每管分裝4～5mL，121℃高壓滅菌15min)中，28℃培養(yǎng)2d后向試管中加1mL40％NaOH和1mL5％α-萘酚，充分混勻，10min后變紅者為V-P反應陽性。8)過氧化氫酶的測定從NA斜面上挑取少量X1-b培養(yǎng)物，涂在干凈的載玻片上，滴加10％的過氧化氫，有氣泡產(chǎn)生者為陽性。9)糖醇發(fā)酵檢測用培養(yǎng)18hX1-b菌種，用針穿刺接種于培養(yǎng)基((NH4)2HPO41g，酵母膏0.2g，MgSO4·7H2O0.2g，糖(碳源)10g，0.4％溴甲酚紫乙醇液2mL，KCl5g，瓊脂5～6g，蒸餾水1000mL，pH6.8～7.0，分裝試管，培養(yǎng)基高度約為4～5Cm,121℃高壓滅菌15min；碳源：D-甘露醇、D-葡萄糖)中，培養(yǎng)1d～7d甚至14d，檢查結(jié)果。指示劑由紫色變黃表示糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，為陽性。10)淀粉水解檢測將X1-b的新鮮斜面培養(yǎng)物點種于淀粉水解培養(yǎng)基(普通肉湯培養(yǎng)基中加入0.2％可溶性淀粉，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min，倒平板備用)中，28℃恒溫培養(yǎng)2d～5d，形成明顯的菌落后，在平板上滴加碘液平板呈藍黑色，菌落周圍如有不變色透明圈，表示淀粉水解陽性；仍是藍黑色為陰性。11)丙二酸利用檢測以幼齡(10h)X1-b菌種接種于培養(yǎng)基(酵母膏1g，(NH4)2SO42g，K2HPO40.6g，KH2PO40.4g，NaCl2g，丙二酸鈉3g，溴百里酚蘭0.025g，蒸餾水1000mL，pH＝7.0～7.4，分裝試管，約4Cm高度，同時以不加丙二酸鈉為空白對照，121℃滅菌15min)中，28℃培養(yǎng)2d～5d，若培養(yǎng)液由綠色變?yōu)樗{色為陽性，不變色為陰性。12)酪蛋白水解檢測以幼齡(10h)X1-b菌種接種牛奶試管(脫脂牛奶100mL，2.5％石蕊水溶液(過夜后過濾使用)4mL，混合后的顏色為丁香或紫色適度，分裝試管，牛奶高度4cm，121℃高壓滅菌15min)中，分別于第1d、3d、5d、7d、14d觀察，牛奶變清者為陽性。13)苯丙氨酸脫氨酶檢測幼齡(10h)X1-b菌種劃線接種培養(yǎng)基(酵母膏3g，NaCl5g，K2HPO41g，L-Phe1g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL，pH＝7.0，分裝試管，121℃滅菌15min，擺斜面)中，37℃培養(yǎng)8h～24h，向試管加4～5滴10％(g/mL)FeCl3溶液，在培養(yǎng)基表面上若產(chǎn)生綠色為陽性，不變?yōu)殛幮浴?4)卵磷脂酶檢測取X1-b菌種點種于卵黃培養(yǎng)基平板上，室溫培養(yǎng)18h～24h，若在菌落四周和下面出現(xiàn)白色不透明區(qū)，表明卵磷脂酶被分解為脂肪酸，為陽性反應。卵黃培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，蒸餾水1000mL，瓊脂19g，121℃高壓滅15min。無菌取一定體積的新鮮蛋黃與等體積的無菌生理鹽水充分混勻，按5％的量加到50～55℃的上述培養(yǎng)基中，混勻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，制成卵黃平板過夜后使用。15)吲哚產(chǎn)生檢測把幼齡(10h)X1-b菌種接種于培養(yǎng)基(1％胰胨水溶液，調(diào)pH7.2～7.6，分裝1/3～1/4試管，121℃高壓滅菌15min)中，28℃培養(yǎng)1d、2d、4d、7d，沿管壁緩慢加入3～5mL的吲哚試劑(對二甲氨基苯甲醛8g，95％乙醇760mL，濃HCl160mL)于表面，液層界面產(chǎn)生紅色者，為陽性反應，若不明顯，可先加4～5滴乙醚到培養(yǎng)液中，振動，靜置，再加吲哚試劑，觀察顏色反應。16)耐鹽性檢測選擇NB培養(yǎng)基，分別加入NaCl至濃度2％，5％和7％，取幼齡菌種接種培養(yǎng)3d和7d，與未接種的對照管對比，目測生長情況，有混濁出現(xiàn)即為陽性。17)生長pH檢測把幼齡(10h)X1-b菌種分別接種于pH為6.8和5.7的NB培養(yǎng)基中，28℃，120r/min，培養(yǎng)48h后觀察菌體生長情況，有菌體形成或培養(yǎng)基變渾濁則為陽性。上述形態(tài)觀察及生理生化測定結(jié)果：X1-b在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后形成乳白色圓形菌落，不透明，邊緣不整齊，菌落上褶皺狀突起，內(nèi)部呈環(huán)狀凹陷。油鏡下觀察為桿狀細胞，細胞為1.07～1.25μm×2.37～3.09μm。革蘭氏、芽胞、鞭毛和莢膜染色結(jié)果表明X1-b菌株為革蘭氏陽性細菌(圖1中a)，芽胞位于菌體中部(圖1中b)，短桿狀或球狀，大小0.86～1.03μm×1.01～1.07μm，具有數(shù)根鞭毛，鞭毛為周生(圖2)，無莢膜。另外，好氣性檢測顯示X1-b為好氧性細菌，該菌運動性良好、V-P測定和接觸酶反應陽性、遇葡萄糖和甘露醇產(chǎn)酸、能水解淀粉、不能利用丙酸鹽和酪蛋白、苯丙氨酸脫氨酶和卵磷脂酶檢測結(jié)果為陰性、不能產(chǎn)生吲哚、能在含7％的NaCl培養(yǎng)基上生長，在pH為6.8和5.7的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長良好(詳見表1)。表1X1-b部分生理生化特征結(jié)果特征X1-b運動性+接觸酶+厭氧生長-V-P測定+產(chǎn)酸：D-葡萄糖+D-甘露醇+淀粉水解+丙酸鹽利用-酪蛋白水解-苯丙氨酸脫氨酶-卵黃卵磷脂酶-吲哚產(chǎn)生-生長NaCl：2％+5％+7％+生長pH：6.8營養(yǎng)肉湯+5.7營養(yǎng)肉湯+注：+陽性反應；-陰性反應2、拮抗細菌X1-b的16SrDNA和gyrB基因序列分析法鑒定1)基因組DNA提取與純化(1)將X1-b菌種接種于NA平板上，28℃培養(yǎng)16h，用0.15mol/LNaCl與0.1mol/LEDTA(pH8.0)緩沖液洗平板，收集菌體。(2)將上述細胞懸液置于1.5mL離心管中12000rpm離心1min收集細胞，沉淀懸浮于500μLTE(50mMTris-HCl，5mMEDTA，pH8.0)緩沖液中。(3)加溶菌酶0.5～1mg/mL(終濃度)，置37℃水浴30～60min。(4)加SDS(20％)至終濃度2％，37℃水浴30～60min。(5)加CTAB溶液100uL，5mol/LNaCl80uL，65℃水浴10min。(6)加入等體積氯仿︰異戊醇(24︰1，v/v)混合液，振蕩混勻。(7)12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入2mL離心管中。(8)加入1/10體積的5mol/L乙酸鈉(NaAc)，2倍體積-20℃存放的無水乙醇輕輕混勻，-20℃沉淀1h左右。(9)4℃下12000rpm離心15min，70﹪乙醇洗滌沉淀2～3次。(10)在超凈工作臺中，無菌風吹干，用TE(pH8.0)緩沖液溶解細菌的總DNA，-20℃冰箱保存待用。2)拮抗細菌X1-b的16SrDNA序列PCR擴增以拮抗細菌總DNA為模版，采用細菌16SrDNA區(qū)通用引物27f和1492r進行PCR擴增。27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492r：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'由上海生工合成。PCR反應體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，總DNA模版1μL，引物27f1μL，引物1492r1μL，ddH2O9.5μL，反應總體積為25μL。PCR擴增反應程序：95℃預變性5min；然后95℃變性30s，54℃退火30s；72℃延伸1min30s，34個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，備用。3)拮抗細菌X1-b的gyrB基因序列PCR擴增以細菌X1-b的總DNA為模版，采用細菌gyrB基因保守區(qū)序列引物gyrb-up1f和gyrb-up2r進行PCR擴增。gyrB-up1fGAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，gyrB-up2rAGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT由上海生工合成。PCR反應體系為(30μL)：2×TaqPCRMasterMix15μL，ddH2O12μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板1μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，34個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，備用。4)PCR產(chǎn)物的檢測采用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測X1-b的16SrDNA和gyrB基因PCR擴增產(chǎn)物。檢測正確后將PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測得的供試菌株16SrDNA、gyrB區(qū)段的雙向序列，用DNAMAN5.2軟件進行拼接和整理，在GenBank中進行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比對分析，得出與X1-b菌株的相近的已鑒定的菌株名稱。5)16SrDNA，gyrB基因序列分析結(jié)果以芽胞桿菌X1-b基因組DNA為模板，用通用引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示16SrDNA，gyrB基因均擴增出大小約為1.4kb的DNA片段(見圖3和圖4)。根據(jù)測序結(jié)果獲得菌株X1-b的16SrDNA序列(16SribosomalRNAgene，partialsequence)(序列表中序列1所示)和gyrB基因序列(DNAgyrasesubunitBgene,partialsequence)(序列表中序列2所示)。與GenBank中基因序列進行同源性比較結(jié)果表明與X1-b菌株16SrDNA序列與芽孢桿菌屬不同種如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)YS52和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)S499等菌株的16SrDNA基因序列相似率均達99％?？梢猿醪酱_定芽胞桿菌X1-b的分類地位屬于芽胞桿菌屬(Bacillussp.)。X1-b菌株gyrB基因序列的Blast比對分析結(jié)果顯示其同B.amyloliquefacienssubsp.plantarumUCMB5036、B.amyloliquefaciensCC178和B.amyloliquefaciensY2等解淀粉芽胞桿菌菌株相似率達99％，確定X1-b菌株為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-b，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏日期2016年7月6日，保藏編號為CGMCCNo.12742。實施例2.解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-bCGMCCNo.12742的抑菌活性測定靶標植物病原真菌和病原細菌由北京農(nóng)學院植物病理學實驗室提供(見表2，表3)，分別測定菌株解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-b對以上病原真菌和細菌的拮抗活性。同時，以蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)BT(由中國農(nóng)業(yè)大學植病生防實驗室提供)，本發(fā)明的發(fā)明人分離的另一株枯草芽胞桿菌(B.subtilis)X1-a，以及不接任何拮抗細菌的培養(yǎng)為對照，每處理重復3次，觀察細菌對不同病原菌生長的抑制情況，并測量抑菌帶寬度。表2和表3中的病原真菌和病原細菌按照本領域已知的常規(guī)方法從自然界分離并鑒定。表2.靶標植物病原真菌表3.靶標植物病原細菌一、病原菌活化真菌活化：將4℃保存的病原菌菌種，用滅菌接種針挑取菌絲到新的PDA培養(yǎng)基平板中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d，備用。細菌活化：取出細菌菌種，用接種針劃線接種到新鮮的NA固體培養(yǎng)基中，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2d，備用。液體培養(yǎng)時，挑取單菌落于5mL液體NB培養(yǎng)基中，28℃、150r/min，振蕩培養(yǎng)48h。二、對植物病原真菌的抑菌作用測定將活化好的植物病原真菌用滅菌打孔器打取5mm直徑的菌塊，放入新的PDA培養(yǎng)平皿中心位置；四周放4片滅菌濾紙片，其上滴加10μL培養(yǎng)好的生防細菌菌液；置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4d后開始進行抑菌帶寬度(拮抗菌距離病原真菌邊緣的距離)的測量。三、對植物病原細菌的抑菌作用測定融化NA固體培養(yǎng)基，待溫度降至50度左右，加入5mL植物病原細菌菌液，搖勻后倒平皿，平皿凝固后在四周放4片滅菌濾紙片，分別滴加10μL拮抗細菌菌液，每皿重復3次，晾干后28℃恒溫培養(yǎng)，2d后開始進行抑菌圈半徑(拮抗菌距離病原細菌邊緣的距離)的測量。四、結(jié)果與分析1、生防細菌對植物病原真菌的抑菌活性測定拮抗細菌X1-b對植物病原真菌的抑制活性測定結(jié)果見表4。從表4可見解淀粉芽胞桿菌X1-b對所測的病原真菌均有較強的抑菌效果，抑菌帶寬度均大于4mm；而枯草芽胞桿菌(B.subtilis)X1-a和蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)BT抑菌譜較窄，只對少數(shù)病原真菌有抑菌作用，抑菌帶寬度較小，抑菌能力較弱。由此可見解淀粉芽胞桿菌X1-b對植物病原真菌抑菌譜較廣，抑菌能力強。表4、拮抗細菌X1-b對病原真菌的抑菌帶寬度測定結(jié)果(單位：mm)2、拮抗細菌X1-b對植物病原細菌的抑菌活性測定拮抗細菌X1-b對8株植物病原細菌的抑制活性測定結(jié)果見表5。從表5可見，解淀粉芽胞桿菌X1-b對葡糖桿菌Sfyg3-2、醋酸桿菌Sfb-18、大白菜軟腐病菌ECC、十字花科細菌性黑斑病菌PSM和西瓜細菌性果斑病菌MH21均有不同程度的抑菌活性，而對野油菜黃單胞菌XCP、水稻白葉枯病菌XO99F以及青枯雷爾氏菌RS0909沒有抑菌活性。作為對照，蘇云金芽胞桿菌BT對所有待測病原細菌均無抑菌活性，枯草芽胞桿菌X1-a僅對大白菜軟腐病菌ECC有一定的拮抗活性。表5拮抗細菌X1-b對植物病原細菌的抑菌圈半徑(單位：mm)實施例3、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-bCGMCCNo.12742對黃瓜綿腐(Pythiumaphanidermatum)病和柑橘青霉(penicilliumitalicum)病的防治試驗一、病原菌活化與生防菌發(fā)酵液的制備真菌活化：將保存的柑橘青霉菌(Penicilliumitalicum)PI-1用滅菌接種針挑取菌絲到新的PDA培養(yǎng)基平板中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d，備用。解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-bCGMCCNo.12742生防菌液的制備：挑取新活化的X1-b單菌落接于含有30mL液體NA培養(yǎng)基300mL三角瓶中，28℃、150r/min，振蕩培養(yǎng)48h，即為生防用發(fā)酵菌液。滅菌發(fā)酵液：直接將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在121℃，高壓滅菌20min。二、對黃瓜綿腐病的防治試驗取菜地田間自然土(含瓜果腐霉菌)鋪滿滅菌培養(yǎng)皿中，將黃瓜表面用5％的次氯酸鈉消毒5min，截成5cm左右的小段，置于盛有帶菌土的培養(yǎng)皿中，分別在培養(yǎng)皿中加入10mL的滅菌水、X1-b生防發(fā)酵液、X1-b滅菌發(fā)酵液和1％的硫酸銅溶液，置于保濕箱中，25℃放置3-4d，調(diào)查黃瓜的發(fā)病情況，計算防病效果。三、對柑橘青霉病的防治試驗將柑橘表面用5％的次氯酸鈉消毒5min，用滅菌接種針刺傷，用打孔器打取活化好的青霉菌(Penicilliumitalicum)PI-1菌片，將菌片貼在傷口處20min，取下菌片，在傷口處貼上滅菌脫脂棉，脫脂棉上分別滴加500μL的滅菌水、X1-b生防發(fā)酵液、X1-b生防發(fā)酵液的滅菌液和1％的硫酸銅溶液，置于保濕箱中，25℃放置3-4d，調(diào)查柑橘的發(fā)病情況，計算防病效果。四、結(jié)果與分析1、生防菌液對黃瓜綿腐病的防治效果拮抗細菌X1-b對植物黃瓜綿腐病的防治效果見圖5。從圖5可見解淀粉芽胞桿菌X1-b發(fā)酵液對所測的黃瓜綿腐病有較好的防治效果。相對于硫酸銅溶液(防效100％)，X1-b發(fā)酵液防效能達到70％，發(fā)酵液經(jīng)過高壓滅菌之后防效也能達40％～50％左右。2、生防菌液對柑橘青霉病的防治效果拮抗細菌X1-b對柑橘青霉病的防治效果見圖6。從圖6可見解淀粉芽胞桿菌X1-b發(fā)酵液和硫酸銅處理的柑桔均未有青霉菌的擴展，防效能達到100％，X1-b的滅菌發(fā)酵液防效較小或喪失了防治效果。實施例4、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)X1-bCGMCCNo.12742產(chǎn)抗菌肽基因鑒定隨著測序技術的迅猛發(fā)展，高通量測序已經(jīng)日益成為生物學研究中的重要手段，發(fā)揮著越來越廣泛的作用。其中二代測序廣泛用于生物研究領域，而本章主要對解淀粉芽胞桿菌X1-b進行了全基因組二代測序，為下一步研究基因的功能奠定基礎。經(jīng)過二代測序序列組裝和分析比對結(jié)果顯示，解淀粉芽胞桿菌X1-b的全基因組序列染色體長度為4175709bp，共有4261個基因，基因平均大小為862bp，GC％為46.12％，4075個CDS，87個tRNA，13套rRNA。經(jīng)過對全基因組的生物信息分析，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌X1-b至少擁有合成4種抗菌肽的基因簇，分別是：合成表面活性素(surfactin)的srfA、srfB、srfC和srfD基因簇；桿菌霉素(bacillomycin)合成基因bacA、bacB、bacC、bacD和bacE；豐原素(fengycin)合成基因ppsA、ppsB、ppsC、ppsD和ppsE；還有合成抗霉枯草菌素(mycosubtilin)的基因簇基因mycA、mycB、mycC(圖7)。說明，生防解淀粉芽胞桿菌X1-b株產(chǎn)抗菌肽基因簇很多，這也是其抑菌譜寬的決定因素之一。以上說明對本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的，本領域普通技術人員理解，在不脫離所附權利要求所限定的精神和范圍的情況下，可做出許多修改、變化或等效，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。序列表<110>北京農(nóng)學院<120>一株生防用解淀粉芽胞桿菌及其應用<130>WHOI170016<160>2<210>1<211>1505<212>DNA<213>解淀粉芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）X1-b<400>1agagtttgatcctggctcaggccsaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagc60ggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaa120cctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttga180accgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcg240cattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagag300ggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagg360gaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtttt420cggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcacctt480gacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtag540gtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaggggctcgcaggcggtttcttaagtct600gatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgca660gaggaggagagtggcactccacgtgtagcgtgaaatgcgtagagatgtggaggacaccag720tggcgaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaac780aggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggttt840ccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaag900actgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattc960gaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggac1020gtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgaga1080tgttgggtttagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgg1140gcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatc1200atgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaa1260ccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcg1320actgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcc1380cgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgag1440gtaacctttatggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaaca1500aggta1505<210>2<211>1215<212>DNA<213>解淀粉芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）X1-b<400>2gaagtcatcatgaccgttctccacgccggcggtaaatttgacggaagcggatataaagta60tccggcggtctt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