本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種噬菌蛭弧菌的制備方法。
背景技術(shù)：
噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)是一類體形較小、呈短桿狀或弧狀，一端有極長鞭毛的、運(yùn)動(dòng)極活潑的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤、海水、污水、沉淀物等環(huán)境中，甚至在哺乳動(dòng)物糞便中也有檢出，其具有寄生和裂解宿主菌的生物學(xué)特性。它比一般的細(xì)菌小，因而能夠侵入并裂解宿主細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，蛭弧菌對(duì)致病菌的裂解能力明顯大于非致病菌，且腸道病原菌更易被裂解。此外，噬菌蛭弧菌也可在水體凈化方面發(fā)揮一定的作用。近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖水體的污染，許多革蘭氏陰性病原菌如嗜水氣單胞菌等對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物造成了越來越嚴(yán)重的危害。蛭弧菌的這一特性，使其能夠成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一種良好的微生態(tài)制劑。據(jù)Wand等報(bào)道，在消除污水致病菌的過程中，蛭弧菌起到明顯凈化水體的作用，從而有效降低致病菌所帶來的危害。宋志萍等報(bào)道蛭弧菌可用于控制九孔鮑苗的細(xì)菌性病害。同時(shí)，邵桂元等報(bào)道蛭弧菌對(duì)引起鯽魚出病的點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌具有明顯消除作用。因此，越來越多的學(xué)者試圖開發(fā)以蛭弧菌作為原料的微生態(tài)制劑，以達(dá)到抑制病原菌的目的。
目前有關(guān)蛭弧菌分離方法很多，但是一種簡單又不影響蛭弧菌捕食活力的方法尚沒有報(bào)道過，經(jīng)過本發(fā)明人多次的試驗(yàn)驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道一種簡單快速制備噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡單快速的噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑的制備方法。
為了解決上述技術(shù)不足的問題，本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)：
1.蛭弧菌的分離純化：以EC600為宿主菌，采用液體培養(yǎng)和雙層自來水瓊脂平板相結(jié)合的方法從池塘水泥中分離獲得噬菌蛭弧菌菌株，然后采用單個(gè)菌斑傳代的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，再結(jié)合雙層自來水瓊脂平板的方法進(jìn)行10代的連續(xù)單個(gè)菌斑傳代純化，最終得到噬菌能力強(qiáng)、純系的噬菌蛭弧菌菌株。
2.步驟1中所述宿主菌液制備方法為：將EC600轉(zhuǎn)入血瓊脂平板，于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。挑取單個(gè)菌落接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，于35℃、180rpm振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后將菌液于8000×g條件下離心10min，沉淀用無菌自來水重懸，重復(fù)離心一次，用無菌自來水將濃度調(diào)至1010cfu/mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.步驟1中所述雙層瓊脂平板的制備方法為：下層瓊脂含量為2％，上層瓊脂含量為0.6％，均用無菌自來水配制。
4.噬菌蛭弧菌菌劑制備：挑取一塊雙層瓊脂平板上的噬菌斑，接種于200mL無菌自來水配制的宿主菌懸液中，于30℃、150rpm條件下振蕩培養(yǎng)90h，此時(shí)菌懸液即為噬菌蛭弧菌懸液?？蓪⒕褐苯佑糜谠囼?yàn)操作也可將獲得的菌液經(jīng)0.45μm孔徑膜過濾除菌后使用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果：與傳統(tǒng)的蛭弧菌分離方法相比，省去了配制DNB、調(diào)節(jié)pH的步驟，可直接運(yùn)用自來水進(jìn)行配制，操作簡單省時(shí)省料，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，采用無菌自來水分離的蛭弧菌與傳統(tǒng)方法分離的蛭弧菌在捕食能力和出斑時(shí)間上沒有明顯區(qū)別；大腸桿菌C600不屬于致病菌，因此避免了可能的生物危害。
具體實(shí)施方式
應(yīng)該指出，以下具體說明都是示例性性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本文所使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。若為特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例一：分離自池塘污泥的噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑的快速制備
1.樣本采集：
收集池塘的淤泥，作為噬菌蛭弧菌分離株的菌株來源。
2.宿主菌懸液的制備：
將宿主菌EC600接種于LB液體培養(yǎng)基中，于35℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)18h，然后在8000r/min條件下離心10min，沉淀用無菌自來水重懸后即為宿主菌懸液，并用無菌自來水將濃度調(diào)至1010cfu/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.蛭弧菌的分離：
(1)將200mL無菌自來水加入到獲得的淤泥樣中，振蕩混勻后取上清于500×g條件下離心10min，將獲得的上清水樣于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
(2)取50mL水樣加入到200mL宿主菌懸液中，做三個(gè)重復(fù)。在30℃條件下靜置培養(yǎng)90h。將培養(yǎng)好的菌液在3500rpm條件下離心15min，取上清進(jìn)行雙層瓊脂平板法進(jìn)行蛭弧菌分離試驗(yàn)；
(3)雙層瓊脂平板配制：下層采用2％無菌自來水瓊脂，倒入90mm平皿凝固后備用；上層采用0.6％無菌自來水瓊脂于50℃保溫備用。于10mL離心管中加入2mL宿主菌懸液，然后加入1mL水樣，最后加入4mL上層瓊脂，混勻后傾注于下層瓊脂平板上，凝固后于30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)90h，期間連續(xù)觀察出斑情況；
(4)蛭弧菌純化：由上述第(3)步獲得的蛭弧菌存在不純的情況，我們采用單個(gè)斑傳代的方法對(duì)蛭弧菌進(jìn)行雙層瓊脂平板的方法優(yōu)化，挑選出斑時(shí)間短、菌斑大且透亮的作為試驗(yàn)用蛭弧菌菌株。
(5)噬菌蛭弧菌菌劑制備：挑取步驟(4)所制備的噬菌斑一塊，加入到EC600宿主菌懸液中，30℃、150rpm條件下振蕩培養(yǎng)90h。此時(shí)獲得的菌懸液即為噬菌蛭弧菌菌劑，可將此菌劑直接用于試驗(yàn)或經(jīng)0.45μm孔徑膜過濾后使用。
(6)捕食能力檢測：選取1株臨床分離的肺炎克雷伯菌作為宿主菌，通過雙層瓊脂平板法和活菌計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行捕食能力的驗(yàn)證。
實(shí)施例二：離自河流淤泥的噬菌蛭弧菌生態(tài)制劑的快速制備
與實(shí)施例一不同的是步驟1收集河流淤泥，作為噬菌蛭弧菌分離株的菌株來源，按照實(shí)施例一的方法進(jìn)行分離獲得。
本發(fā)明以上實(shí)施例僅用于對(duì)本次發(fā)明闡釋，然而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以上實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或調(diào)整，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。