本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法。

技術(shù)背景

豬支原體肺炎又稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體引起的一種慢性呼吸道傳染病。臨床上以咳嗽、氣喘和肺部典型的“蝦肉”樣病變?yōu)樘卣?，發(fā)病率高，死亡率低。豬肺炎支原體可以通過抑制先天性和后天性肺臟免疫導(dǎo)致多殺性巴氏桿菌等上呼吸道共生菌在肺臟增殖并促使疾病發(fā)生，它還可以與豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病毒混合感染，加重疾病的發(fā)生。盡管豬肺炎支原體并非引起肺臟疾病的唯一病原，但是它作為能引起肺臟疾病病原體的增強(qiáng)子而著稱，因此成為造成經(jīng)濟(jì)損失的一個(gè)主要原因。

豬支原體肺炎等疾病有效的預(yù)防和控制方法是為豬只提供優(yōu)良的生活環(huán)境，如保證圈舍內(nèi)的空氣清新、通風(fēng)條件良好、環(huán)境溫度適宜及豬只的數(shù)量適宜，豬場(chǎng)實(shí)施科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓芾泶胧缈刂曝i的進(jìn)出流動(dòng)、仔豬早期斷奶等。但是這些有效控制方法在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)很難做到。目前豬場(chǎng)常使用的方法是藥物治療和疫苗防控。

不管是豬肺炎支原體滅活疫苗還是弱毒活疫苗，無細(xì)胞培養(yǎng)都需要培養(yǎng)基。豬肺炎支原體由于基因組小，基因數(shù)量有限，從而導(dǎo)致生物合成途徑缺乏，需要從生長(zhǎng)環(huán)境中獲取糖、氨基酸、嘌呤、嘧啶和膜成分，這就要求豬肺炎支原體培養(yǎng)基中含有這些成分。從豬肺炎支原體分離、鑒定至今，已有不同配方的培養(yǎng)基，從最早的煮沸豬肺組織滅活細(xì)胞培養(yǎng)基、豬肺埋塊無細(xì)胞培養(yǎng)基，到后來的Friis培養(yǎng)基、江蘇農(nóng)科院的KM2培養(yǎng)基、獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程中的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，都可以培養(yǎng)出豬肺炎支原體，但是培養(yǎng)的滴度難以超過10⁹CCU，血清用量也都比較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種營(yíng)養(yǎng)豐富、培養(yǎng)滴度高、生產(chǎn)成本低且適合豬肺炎支原體(兔化弱毒株)快速生長(zhǎng)的高效培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可使豬肺炎支原體(兔化弱毒株)的菌液滴度達(dá)到10⁹-10¹⁰CCU，培養(yǎng)時(shí)間僅需40～48h，且所需豬血清濃度不超過10％，最優(yōu)組合豬血清僅需8％。培養(yǎng)時(shí)間大大縮短可以減少陳舊菌、老齡菌的產(chǎn)生，從而減少陳舊菌、老齡菌代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，并且減少生產(chǎn)耗能；培養(yǎng)基中豬血清的用量大大降低，一方面有利于減少由豬血清帶來的過敏應(yīng)激反應(yīng)，另一方面有利于生產(chǎn)成本的大幅降低。

本發(fā)明的另一目的是提供豬肺炎支原體(兔化弱毒株)高效培養(yǎng)基的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案

1.一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括20×Hank′s 25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去離子水770～870ml，輔助培養(yǎng)基包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％輔酶Ι1～5ml、10萬U/ml青霉素5～10ml和滅活的健康豬血清80～200ml組成。

2.本發(fā)明所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于它能培養(yǎng)豬肺炎支原體兔化弱毒株，并且培養(yǎng)的CCU滴度可以達(dá)到10⁹～10¹⁰，所需豬血清濃度不超過10％。

3.本發(fā)明所述的一種高效豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于20×Hank′s液包括：

20×Hank′s1：NaCl 12～16g、MgSO₄·7H₂O 0.1g～0.5g、KCl 0.4～1.0g、MgCl₂·6H₂O 0.1～0.5g、CaCl₂ 0.2～0.5g、去離子水100ml；

20×Hank′s2：Na₂HPO₄·12H₂O 0.1～0.4g、KH₂PO₄ 0.1～0.35g、葡萄糖1～5g、1％酚紅溶液2～4ml、去離子水96～98ml。

4.本發(fā)明所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于制備步驟如下：

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制：按配比量取20×Hank′s 1 25～35ml、20×Hank′s 2 25～35ml，稱取酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去離子水770～870ml，攪拌均勻，10M NaOH調(diào)pH至7.2～7.4，115℃高壓滅菌20min；

(2)輔助培養(yǎng)基的配制：按配比量取過濾除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％輔酶Ι1～5ml、10萬U/ml青霉素5～10ml、56℃滅活的豬血清80～200ml。

5.本發(fā)明所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于它還包括高效豬肺炎支原體固體培養(yǎng)基，配制方法是在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)中加入0.8～1.5％瓊脂糖。

本發(fā)明具體實(shí)施方式

1.培養(yǎng)基的組分

一種豬肺炎支原體(兔化弱毒株)高效培養(yǎng)基，其特征在于由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基組成。其中：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基的主要成分包括20×Hank′s 25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去離子水770～870ml；

輔助培養(yǎng)基的主要成分包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％輔酶Ι1～5ml、10萬U/ml青霉素5～10ml和滅活的健康豬血清80～200ml。

2.培養(yǎng)基的制備方法

一種豬肺炎支原體(兔化弱毒株)高效培養(yǎng)基，其特征在于制備方法包括以下步驟：

(1)20×Hank′s液的制備：20×Hank′s液包括20×Hank′s1和20×Hank′s2。

1)20×Hank′s1：按配比稱取NaCl 12～16g、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g、KCl 0.4～1.0g、MgCl₂·6H₂O0.1～0.5g、CaCl₂ 0.2～0.5g，去離子水100ml，配制時(shí)CaCl₂單獨(dú)溶解，其余各成分逐一溶解，最后混合；

2)20×Hank′s2：按配比稱取Na₂HPO₄·12H₂O 0.1～0.4g、KH₂PO₄ 0.1～0.35g、葡萄糖1～5g、去離子水96～98ml，逐一溶解后加入1％酚紅溶液2-4ml。

(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備：

按配比量取20×Hank′s 1 25～35ml、20×Hank′s 2 25～35ml于770～870ml去離子水中，按配比逐一稱取酵母提取物1-5g、乳蛋白水解物0.5-3g、牛心提取物5～12g，攪拌均勻，10M NaOH調(diào)pH至7.2～7.4，115℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)輔助培養(yǎng)基的制備：

1)5％精氨酸溶液：稱取L-精氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)5％半胱氨酸溶液：稱取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)5％輔酶Ι：稱取輔酶Ι5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)高效液體培養(yǎng)基的制備：使用前，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入過濾除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％輔酶Ι1～5ml、10萬U/ml青霉素5～10ml、56℃滅活的健康豬血清80～200ml，基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至1000ml。

(5)高效固體培養(yǎng)基的制備：按配比向未高壓滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中稱取瓊脂糖8～15g，115℃高壓滅菌20min，待培養(yǎng)基冷涼至50～60℃時(shí)，按配比量取過濾除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％輔酶Ι1～5ml、10萬U/ml青霉素5～10ml、56℃滅活的健康豬血清80～200ml，總體積為1000ml。鋪平板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明涉及生物材料資源信息

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)兔化弱毒株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。該菌株為疫苗生產(chǎn)菌株(參見寧宜寶主編，獸用疫苗學(xué)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008年，p442)。

本發(fā)明的積極意義

本發(fā)明涉及一種高效的豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明所述的高效豬肺炎支原體培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基組成，其中：基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要成分有Hank′s液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心提取物，可以通過高壓蒸汽滅菌方式除菌，大大地減少了過濾除菌帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)；輔助培養(yǎng)基由豬血清、精氨酸、半胱氨酸、酚紅溶液、青霉素等組成，豬血清通過鈷照射除菌，其余成分過濾除菌后與滅活的豬血清混合。本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體兔化弱毒株的滴度達(dá)到10⁹～10¹⁰CCU，培養(yǎng)時(shí)間最低可至40h，大大減少了陳舊菌、老齡菌的產(chǎn)生，并且豬血清用量可以低至8％，減少了豬血清帶來的過敏應(yīng)激反應(yīng)，降低了企業(yè)生產(chǎn)成本。

實(shí)施例

為了使本發(fā)明更易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例證加以說明。

實(shí)施例1

——本發(fā)明培養(yǎng)基的制備

1.20×Hank′s液的制備：

1)20×Hank′s1：稱取NaCl 16g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 1.0g、MgCl_··6H₂O 0.5g，各成分逐一溶解于去離子水90ml，稱取CaCl₂ 0.5g溶解于10ml去離子水，二者混勻；

2)20×Hank′s2：稱取Na₂HPO₄·12H₂O 0.4g、KH₂PO₄ 0.35g、葡萄糖5g，逐一溶解于去離子水98ml，并加入1％酚紅溶液2ml。

2.基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備：

量取20×Hank′s 1 35ml、20×Hank′s 2 35ml于722ml去離子水中，稱取酵母提取物2g、乳蛋白水解物0.5g、牛心提取物6g，逐一攪拌溶解，10M NaOH調(diào)pH至7.4，115℃高壓滅菌20min。

3.輔助培養(yǎng)基的制備：

1)5％精氨酸溶液：稱取L-精氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)5％半胱氨酸溶液：稱取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)5％輔酶Ι：稱取輔酶Ι5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.高效液體培養(yǎng)基的制備：

向上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.22μm濾器過濾除菌的5％精氨酸溶液1ml、5％半胱氨酸溶液1ml、5％輔酶Ι1ml、10萬/ml青霉素5ml、56℃滅活的健康豬血清200ml。

實(shí)施例2

——本發(fā)明培養(yǎng)基的制備

(1)20×Hank′s液的制備：

1)20×Hank′s1：稱取NaCl 12g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、KCl 0.4g、MgCl₂·6H₂O 0.1g，各成分逐一溶解于去離子水90ml，稱取CaCl₂ 0.2g溶解于10ml去離子水，二者混勻；

2)20×Hank′s2：稱取Na₂HPO₄·12H₂O 0.1g、KH₂PO₄ 0.10g、葡萄糖5g，逐一溶解于去離子水96ml，并加入1％酚紅溶液4ml。

(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備：

量取20×Hank′s 1 25ml、20×Hank′s 2 25ml于825ml去離子水中，稱取酵母提取物5g、乳蛋白水解物3g、牛心提取物12g，逐一攪拌溶解，10M NaOH調(diào)pH至7.2，115℃高壓滅菌20min。

(3)輔助培養(yǎng)基的制備：

1)5％精氨酸溶液：稱取L-精氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)5％半胱氨酸溶液：稱取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)5％輔酶Ι：稱取輔酶Ι5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)高效液體培養(yǎng)基的制備：

向上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入過濾除菌的5％精氨酸溶液5ml、5％半胱氨酸溶液5ml、5％輔酶Ι5ml、10萬/ml青霉素10ml、56℃滅活的健康豬血清100ml。

實(shí)施例3

——本發(fā)明培養(yǎng)基的制備

(1)20×Hank′s液的制備：

1)20×Hank′s1：稱取NaCl 15g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、KCl 0.6g、MgCl₂·6H₂O 0.3g，各成分逐一溶解于去離子水90ml，稱取CaCl₂ 0.3g溶解于10ml去離子水，二者混勻；

2)20×Hank′s2：稱取Na₂HPO₄·12H₂O 0.2g、KH₂PO₄ 0.20g、葡萄糖2g，逐一溶解于去離子水97ml，并加入1％酚紅溶液3ml。

(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備：

量取20×Hank′s 1 30ml、20×Hank′s 2 30ml于780ml去離子水中，稱取酵母提取物3g、乳蛋白水解物2g、牛心提取物8g，逐一攪拌溶解，10M NaOH調(diào)pH至7.3，115℃高壓滅菌20min。

(3)輔助培養(yǎng)基的制備：

1)5％精氨酸溶液：稱取L-精氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)5％半胱氨酸溶液：稱取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)5％輔酶Ι：稱取輔酶Ι5g溶解于100ml去離子水，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)高效液體培養(yǎng)基的制備：

向上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.22μm濾器過濾除菌的5％精氨酸溶液2ml、5％半胱氨酸溶液2ml、5％輔酶Ι2ml、10萬/ml青霉素5ml、56℃滅活的健康豬血清150ml。

實(shí)施例4

——本發(fā)明培養(yǎng)基與現(xiàn)有培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體(兔化弱毒株)的比較

1.菌株及培養(yǎng)條件

豬肺炎支原體兔化弱毒株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，經(jīng)本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)幾十代后菌液CCU滴度穩(wěn)定在10⁹～10¹⁰。該菌株接種于上述3種具體實(shí)施的培養(yǎng)基和現(xiàn)有的商品化培養(yǎng)基(青島日水生物技術(shù)有限公司的豬肺炎支原體培養(yǎng)基(批號(hào)20150624)、卡邁舒生物科技有限公司的豬肺炎支原體培養(yǎng)基(批號(hào)20150223)、招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司的KM2豬肺炎支原體肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)20150610)及Goodwind等復(fù)合培養(yǎng)基(參見甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京:農(nóng)業(yè)出版社,1980.)、石河子大學(xué)KM2培養(yǎng)基(參見李石,李劼,周霞.豬肺炎支原體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的篩選.黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(18):61-63)、改良Freys氏培養(yǎng)基和支原體培養(yǎng)基(參見中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程2000年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001)，種子復(fù)壯后以5％比例接種，37℃震蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黃，pH值降至6.5以下時(shí)，取出培養(yǎng)菌液。

2.活菌滴度CCU(顏色改變單位)測(cè)定

每個(gè)培養(yǎng)菌液取13支無菌試管，每支試管裝0.9ml不同配方的培養(yǎng)基，向第1管中加入0.1ml待測(cè)菌液，渦旋機(jī)上混勻后，更換吸頭，吸取0.1ml到第2支試管，如此依次進(jìn)行10倍系列稀釋，直至第12管，第13管設(shè)為對(duì)照，僅添加培養(yǎng)基，不添加豬肺炎支原體菌液，每個(gè)培養(yǎng)菌液做3個(gè)重復(fù)。將所有試管放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察試管菌液變色情況并作記錄。觀察時(shí)間為2周，最后發(fā)生顏色改變的試管稀釋度即為該菌液的CCU。

3.豬肺炎支原體生長(zhǎng)情況及CCU測(cè)定結(jié)果

豬肺炎支原體(兔化弱毒株)在不同配方培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)時(shí)間見下表1。

表1豬肺炎支原體(兔化弱毒株)在不同配方培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

豬肺炎支原體(兔化弱毒株)在支原體培養(yǎng)基、青島日水豬肺炎支原體培養(yǎng)基、卡邁舒豬肺炎支原體培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，接種后培養(yǎng)10天均未觀察到顏色變化；在改良Frey氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天變色，CCU滴度僅為10³，繼續(xù)傳代1次，7天變色，CCU為10¹，再繼續(xù)傳代則不再變色；在拓普KM2培養(yǎng)基中也是培養(yǎng)4天變色，但CCU滴度僅為10¹，繼續(xù)傳代不再變色；在Goodwin等復(fù)合培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3次后也不再變色，而且隨著傳代次數(shù)的增加CCU在逐漸降低(數(shù)據(jù)未列出)。而豬肺炎支原體(兔化弱毒株)在上述本發(fā)明培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天即變色，CCU滴度都在10⁹以上。

本發(fā)明的培養(yǎng)基非常適合豬肺炎支原體(兔化弱毒株)的生長(zhǎng)，5％的接種比例傳代，一般培養(yǎng)40～48h培養(yǎng)基pH從7.6降至6.5左右，最優(yōu)組合下豬血清用量?jī)H為8％，培養(yǎng)的菌液CCU為10¹⁰。而一般的豬肺炎支原體培養(yǎng)基并不適合豬肺炎支原體兔化弱毒株的生長(zhǎng)。

實(shí)施例5

——本發(fā)明培養(yǎng)基與已申請(qǐng)專利豬肺炎支原體培養(yǎng)基的比較見表2。

表2本發(fā)明培養(yǎng)基與已申請(qǐng)專利豬肺炎支原體培養(yǎng)基的比較