本申請是國際申請日為2012年03月30日、國際申請?zhí)枮閜ct/us2012/031538、進(jìn)入國家階段的申請?zhí)枮?01280026938.x、發(fā)明名稱為“針對組織因子途徑抑制物(tfpi)的單克隆抗體”的pct申請的分案申請。

zhuozhiwang,johnmurphy,tobiasmarquardt,dietermoosmayer

序列表提交

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提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(tfpi)的分離的單克隆抗體及其片段。

背景技術(shù)：

血液凝固(bloodcoagulation)是血液形成穩(wěn)定的凝塊以使出血停止的過程。該過程涉及血液中循環(huán)的許多酶原和輔因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和輔因子原經(jīng)由序貫或同時(shí)將它們轉(zhuǎn)化成活化形式的數(shù)種途徑而相互作用。最后，所述過程導(dǎo)致在存在因子va、離子鈣、和血小板的情況下由激活的因子x(fxa)將凝血酶原激活為凝血酶。激活的凝血酶繼而誘導(dǎo)血小板聚集，而且將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成血纖蛋白，其然后被激活的因子xiii(fxiiia)交聯(lián)以形成凝塊。

可以通過兩種獨(dú)特的途徑來實(shí)施導(dǎo)致因子x激活的過程：接觸激活途徑(以前稱為內(nèi)源性途徑)和組織因子途徑(以前稱為外源性途徑)。先前認(rèn)為，凝固級聯(lián)由連接至共同途徑的同等重要的兩種途徑組成?，F(xiàn)在知道用于啟動血液凝固的主要途徑是組織因子途徑。

因子x可以被與激活的因子vii(fviia)聯(lián)合的組織因子(tf)激活。fviia和其必需的輔因子tf的復(fù)合物是凝固(clotting)級聯(lián)的有力引發(fā)劑(initiator)。

凝固的組織因子途徑受組織因子途徑抑制物(“tfpi”)的陰性控制。tfpi是fviia/tf復(fù)合物的一種天然的、fxa依賴性反饋抑制物。它是多價(jià)kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制物的成員。在生理學(xué)上，tfpi結(jié)合激活的因子x(fxa)以形成異二聚體復(fù)合物，其隨后與fviia/tf復(fù)合物相互作用以抑制其活性，因此關(guān)閉凝固的組織因子途徑。原則上，阻斷tfpi活性可以恢復(fù)fxa和fviia/tf活性，因此延長組織因子途徑作用的持續(xù)時(shí)間，而且放大fxa的生成，所述fxa是血友病a和b的共同缺陷。

實(shí)際上，一些初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)已經(jīng)指明，通過針對tfpi的抗體來阻斷tfpi活性使延長的凝固時(shí)間正?；蛘呖s短出血時(shí)間。例如，nordfang等人顯示了血友病血漿的延長的稀釋凝血酶原時(shí)間(diluteprothrombintime)在用針對tfpi的抗體處理血漿后正?；?thromb.haemost.,1991,66(4):464-467)。類似地，erhardtsen等人顯示了通過抗tfpi抗體顯著縮短血友病a兔模型中的出血時(shí)間(bloodcoagulationandfibrinolysis,1995,6:388-394)。這些研究提示了抗tfpi抗體對tfpi的抑制對于治療血友病a或b可以是有用的。在這些研究中僅使用多克隆抗tfpi抗體。

使用雜交瘤技術(shù)，制備并鑒定針對重組人tfpi(rhtfpi)的單克隆抗體(參見yang等人,chin.med.j.,1998,111(8):718-721)。測試了單克隆抗體對稀釋凝血酶原時(shí)間(pt)和激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aptt)的影響。實(shí)驗(yàn)顯示了抗tfpi單克隆抗體縮短因子ix缺乏型血漿的稀釋促凝血酶原激酶凝固時(shí)間。提示了組織因子途徑不僅在生理學(xué)凝固而且在血友病出血中發(fā)揮重要作用(yang等人,hunanyikedaxuexuebao,1997,22(4):297-300)。

因而，需要對tfpi特異性的抗體來治療血液學(xué)疾病和癌癥。

一般而言，已經(jīng)使用遺傳工程改造來生成鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗體以生成用于人疾病的治療性抗體。顯示了鼠單克隆抗體作為治療劑具有有限的用途，這是由于短的血清半衰期、不能觸發(fā)人效應(yīng)物功能、和人抗-小鼠-抗體的生成(brekke和sandlie,“therapeuticantibodiesforhumandiseasesatthedawnofthetwenty-firstcentury,”nature2,53,52-62,jan.2003)。已經(jīng)顯示了嵌合抗體引起人抗嵌合抗體應(yīng)答。人源化抗體進(jìn)一步使抗體的小鼠組分最小化。然而，完全人抗體完全避免與鼠元件有關(guān)的免疫原性。因此，需要開發(fā)完全人抗體以避免與其他形式的遺傳工程化單克隆抗體有關(guān)的免疫原性。特別是，長期預(yù)防性治療諸如血友病治療需要人源化或優(yōu)選，完全人抗體。如果使用具有鼠組分或鼠來源的抗體，抗tfpi單克隆抗體具有形成對該治療的免疫應(yīng)答的高風(fēng)險(xiǎn)，這是由于需要的許多給藥和治療的持續(xù)時(shí)間長。例如，血友病a的抗體療法可以每周需要給藥，持續(xù)患者一生。這對免疫系統(tǒng)會是連續(xù)的挑戰(zhàn)。因此，需要用于血友病和相關(guān)的遺傳性和獲得性凝血缺乏或缺陷的抗體療法的完全人抗體。

已經(jīng)經(jīng)由由koehler和milstein在“continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity,”nature256,495-497(1975)中所描述的雜交瘤技術(shù)來制備治療性抗體。也可以在原核生物和真核生物中重組制備完全人抗體。治療性抗體優(yōu)選抗體在宿主細(xì)胞中的重組生成而不是雜交瘤生成。重組生成具有如下的優(yōu)點(diǎn)，即較大的產(chǎn)物一致性、可能地較高的生產(chǎn)水平、和受控制的制備，其使動物衍生的蛋白質(zhì)的存在最小化或消除動物衍生的蛋白質(zhì)的存在。出于這些原因，想要具有重組生成的單克隆抗tfpi抗體。

另外，因?yàn)閠fpi以高親和力結(jié)合活化的因子x(fxa)，所以有效的抗tfpi抗體應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)?shù)挠H和力。因此，期望具有具有可以與tfpi/fxa結(jié)合競爭的結(jié)合親和力的抗tfpi抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

提供了具有特異性結(jié)合到人組織因子途徑抑制物(tfpi)的特異性表位的單克隆抗體。也提供了編碼抗tfpi單克隆抗體的多核苷酸。還提供了包含抗tfpi單克隆抗體的藥物組合物和治療遺傳性和獲得性凝血缺乏或缺陷諸如血友病a和b的方法。

附圖說明

圖1描述通過大小排阻分析faba和tfpikunitz結(jié)構(gòu)域2的復(fù)合物形成。

圖2描述人組織因子途徑抑制物和其抗體(faba)之間的相互作用的卡通圖示。具有表示的可變輕(vl)和重(vh)結(jié)構(gòu)域的faba表示為下面的結(jié)構(gòu)。tfpi的kunitz結(jié)構(gòu)域2(kd2)表示為上面的結(jié)構(gòu)。

圖3描述在faba表面的關(guān)鍵表位殘基asp102(d102)、ile105(i105)、arg107(r107)、cys106-cys130二硫鍵和tfpi的結(jié)合。

圖4描述tfpi-faba復(fù)合物和胰蛋白酶結(jié)合的kunitz結(jié)構(gòu)域2(kd2)的疊加，并且顯示tfpi與因子xa和faba同時(shí)結(jié)合的排除。kd2和faba以卡通圖示顯示，胰蛋白酶顯示為透明表面。還表示faba和胰蛋白酶的空間位阻。

圖5描述通過大小排阻分析fabb和tfpikunitz結(jié)構(gòu)域1+2的復(fù)合物形成。

圖6描述顯示在第一角和相對于第一角旋轉(zhuǎn)90度的另一角處人組織因子途徑抑制物和其抗體(fabb)之間的相互作用的兩個(gè)卡通圖示。具有表示的可變輕(vl)和重(vh)結(jié)構(gòu)域的fabb顯示在圖的下面部分(灰色陰影)。tfpikunitz結(jié)構(gòu)域1(kd1)以白色顯示，并且tfpikunitz結(jié)構(gòu)域2(kd2)以黑色顯示。

圖7描述在fabb表面的關(guān)鍵表位殘基asp31(d31)、asp32(d32)、pro34(p34)、lys36(k36)、glu60(e60)、cys35-cys59二硫鍵和kunitz結(jié)構(gòu)域1tfpi的結(jié)合。還顯示，但未枚舉，kunitz結(jié)構(gòu)域2的結(jié)合。

圖8描述kunitz結(jié)構(gòu)域2的表位殘基glu100(e100)、glu101(e101)、pro103(p103)、ile105(i105)、arg107(r107)、tyr109(y109)和fabb的結(jié)合和相互作用的視野的兩個(gè)角。arg107與kunitz結(jié)構(gòu)域1的gly33(g33)和cys35(c35)相互作用。

圖9描述tfpi-fabb復(fù)合物和bpti、因子viia和組織因子的復(fù)合物的疊加，并且顯示tfpi與因子viia/組織因子和fabb的同時(shí)結(jié)合的排除。fabb與因子viia、和fabb與組織因子的空間位阻通過箭頭表示。

圖10描述tfpi-fabb復(fù)合物和胰蛋白酶結(jié)合的kunitz結(jié)構(gòu)域2的疊加，并且顯示tfpi與因子xa和fabb同時(shí)結(jié)合的排除。表示fabb與胰蛋白酶、和fabb結(jié)合的kunitz結(jié)構(gòu)域1與胰蛋白酶的空間位阻。

圖11描述(a)faba的輕鏈和重鏈(seqidnos:2和3)和fabc的輕鏈和重鏈(seqidnos:6和7)的序列比對以及(b)tfpi-fabax-射線結(jié)構(gòu)與fabc的同源性模型的疊加。(a)互補(bǔ)位殘基為粗體文字并且突出表示。在faba和fabc中不同的互補(bǔ)位殘基hc_asn32用星號標(biāo)記。(b)kunitz結(jié)構(gòu)域2(kd2)顯示為黑色卡通。fab結(jié)構(gòu)顯示為灰色帶?；パa(bǔ)位殘基hc_asn32顯示為棒。

圖12描述(a)fabb的輕鏈和重鏈(seqidnos:4和5)和fabd的輕鏈和重鏈(seqidnos:8和9)的序列比對以及(b)tfpi-fabbx-射線結(jié)構(gòu)與fabd的同源性模型的疊加。(a)互補(bǔ)位殘基為粗體文字并且突出表示。在fabb和fabd中不同的互補(bǔ)位殘基用星號標(biāo)記。(b)kunitz結(jié)構(gòu)域1(kd1)和kunitz結(jié)構(gòu)域2(kd2)分別顯示為淺灰色和黑色卡通。fab結(jié)構(gòu)顯示為灰色帶。在fabb和fabd中不同的互補(bǔ)位殘基顯示為棒。

圖13描述(a)阻斷fxa結(jié)合至tfpi上的fabc和fabd的表面等離子體共振(biacore)數(shù)據(jù)，以及(b)阻斷fviia/tf結(jié)合至tfpi上的fabc和fabd的表面等離子體共振(biacore)數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

定義

如本文中所使用的，術(shù)語“組織因子途徑抑制物”或“tfpi”指由細(xì)胞天然表達(dá)的人tfpi的任何變體、同種型和物種同系物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對tfpi的結(jié)合減少血液凝固時(shí)間。

如本文中所使用的，“抗體”指整個(gè)抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈。該術(shù)語包括天然存在的或由正常的免疫球蛋白基因片段重組過程形成的全長免疫球蛋白分子(例如igg抗體)，或免疫球蛋白分子中保留特異性結(jié)合活性的免疫學(xué)活性部分諸如抗體片段。不管結(jié)構(gòu)，抗體片段與由全長抗體識別的相同抗原結(jié)合。例如，抗tfpi單克隆抗體片段結(jié)合tfpi的表位?？贵w的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段執(zhí)行?？贵w的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”內(nèi)涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)fab片段，即一種由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)f(ab’)2片段，即一種包含由鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的兩個(gè)fab片段的二價(jià)片段；(iii)fd片段，其由vh和ch1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(iv)fv片段，其由抗體的單條臂的vl和vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，(v)dab片段(ward等人,(1989)nature341:544-546)，其由vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)；(vii)微型抗體(minibody)、雙抗體、三抗體、四抗體、和κ體(參見例如ill等人,proteineng1997;10:949-57)；(viii)駱駝igg；和(ix)ignar。此外，雖然fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即vl和vh是由不同基因編碼的，但是可以使用重組方法通過合成的接頭來連接它們，所述合成的接頭使它們能夠作為單條蛋白質(zhì)鏈生成，其中vl和vh區(qū)配對以形成單價(jià)分子(稱為單鏈fv(scfv)；參見例如，bird等人(1988)science242:423-426;和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意圖涵蓋在抗體的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來獲得這些抗體片段，并以與完整的抗體相同的方式來對片段分析功效。

此外，考慮抗體模擬物中可以涵蓋抗原結(jié)合片段。如本文中所使用的，術(shù)語“抗體模擬物”或“模擬物”意指展現(xiàn)出與抗體類似的結(jié)合，但是是更小的備選抗體或非抗體蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。此類抗體模擬物可以包含在支架中。術(shù)語“支架”指用于以改編的功能和特征工程改造新產(chǎn)物的多肽平臺。

術(shù)語“表位”是指抗體特異性結(jié)合或相互作用的抗原的范圍或區(qū)域，在一些實(shí)施方案中，其表示抗原與抗體物理接觸的地方。相反，術(shù)語“互補(bǔ)位”是指抗原特異性結(jié)合的抗體的范圍或區(qū)域。如果相應(yīng)抗體的結(jié)合是相互排斥的，即一種抗體的結(jié)合排斥另一種抗體的同時(shí)結(jié)合，則特征在于競爭結(jié)合的表位被稱為重疊的。如果抗原能夠同時(shí)容納兩個(gè)相應(yīng)抗體的結(jié)合，則表位被稱為是獨(dú)立的(唯一的)。

如本文中所使用的，術(shù)語“競爭性抗體”是指結(jié)合與如本文所述的tfpi約、本質(zhì)上或基本上相同，或甚至相同的表位的抗體?！案偁幮钥贵w”包括具有重疊的表位特異性的抗體。因此，競爭性抗體能夠有效地競爭如本文所述的抗體結(jié)合tfpi。優(yōu)選地，競爭性抗體可以結(jié)合與本文所述的抗體相同的表位。從另外的觀點(diǎn)，競爭性抗體具有與本文所述的抗體相同的表位特異性。

如本文中所使用的，術(shù)語“抑制結(jié)合”和“阻斷結(jié)合”(例如，指抑制/阻斷tfpi配體對tfpi的結(jié)合)可互換使用，并且涵蓋部分和完全抑制或阻斷兩者。抑制和阻斷還意圖包括與不與抗tfpi抗體接觸的tfpi相比在與抗tfpi抗體接觸時(shí)tfpi對生理學(xué)底物的結(jié)合親和力的任何可測量降低，例如阻斷tfpi與因子xa的相互作用或者阻斷tfpi-因子xa復(fù)合物與組織因子、因子viia或組織因子/因子viia的復(fù)合物的相互作用達(dá)至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。

如本文中所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一分子組成的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。因而，術(shù)語“人單克隆抗體”指具有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)和恒定區(qū)的展示單一結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。

如本文中所使用的，“分離的抗體”意圖指基本上沒有具有不同抗原性特異性的其他抗體的抗體(例如結(jié)合tfpi的分離的抗體基本上沒有結(jié)合與tfpi不同的抗原的抗體)。然而，結(jié)合人tfpi的表位、同種型或變體的分離的抗體可以具有與其他相關(guān)抗原(例如來自其他物種的(例如tfpi物種同系物))的交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上沒有其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物。

如本文中所使用的，“特異性結(jié)合”指抗體對預(yù)定抗原的結(jié)合。典型地，抗體以至少約10⁵m^-1的親和力結(jié)合，而且以比其結(jié)合與預(yù)定抗原或緊密相關(guān)抗原不同的無關(guān)抗原(例如bsa、酪蛋白)的親和力高(例如大至少兩倍)的親和力結(jié)合預(yù)定抗原。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異性的抗體”在本文中與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。

如本文中所使用的，關(guān)于igg抗體的術(shù)語“高親和力”指至少約10⁷m^-1、在一些實(shí)施方案中至少約10⁸m^-1、在一些實(shí)施方案中至少約10⁹m^-1、10¹⁰m^-1、10¹¹m^-1或更大，例如多達(dá)10¹³m^-1或更大的結(jié)合親和力。然而，對于其他抗體同種型，“高親和力”結(jié)合可以有所變化。例如，igm同種型的“高親和力”結(jié)合指至少約1.0x10⁷m^-1的結(jié)合親和力。如本文中所使用的，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如igm或igg1)。

“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”指抗體分子的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)內(nèi)形成與結(jié)合的抗原的三維結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的n端抗原結(jié)合表面的三個(gè)高變區(qū)之一。從重鏈或輕鏈的n端出發(fā)，這些互補(bǔ)決定區(qū)分別表示為“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”。cdr參與抗原-抗體結(jié)合，而且cdr3包含對于抗原-抗體結(jié)合特異性的獨(dú)特區(qū)域。因此，抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包括6個(gè)cdr，其包含來自各個(gè)重鏈和輕鏈v區(qū)的cdr區(qū)。

如本文中所使用的，“保守取代”指涉及用一種或多種氨基酸取代具有相似生物化學(xué)特性的氨基酸且不導(dǎo)致多肽的生物學(xué)或生物化學(xué)功能損失的多肽修飾?！氨Ｊ匕被崛〈敝赣镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替換氨基酸殘基的取代。本領(lǐng)域中已經(jīng)限定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。涵蓋的是，本發(fā)明的抗體可以具有保守的氨基酸取代，而且仍保留活性。

對于核酸和多肽，術(shù)語“實(shí)質(zhì)同源性”指明在最佳比對和比較時(shí)兩個(gè)核酸或兩個(gè)多肽或其指定序列在至少約80%的核苷酸或氨基酸，通常至少約85%，優(yōu)選地約90%、91%、92%、93%、94%、或95%，更優(yōu)選地至少約96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、或99.5%的核苷酸或氨基酸中是相同的，具有適當(dāng)?shù)暮塑账峄虬被岵迦牖蛉笔??；蛘?，?dāng)區(qū)段在選擇性雜交條件下與該鏈的互補(bǔ)物雜交時(shí)存在核酸的實(shí)質(zhì)同源性。本發(fā)明包括與本文中所列舉的特定核酸序列和氨基酸序列具有實(shí)質(zhì)同源性的核酸序列和多肽序列。

兩個(gè)序列間的百分比同一性是序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，%同源性=相同位置的數(shù)目/位置總數(shù)x100)，其考慮缺口的數(shù)目和每個(gè)缺口的長度，它們需要被引入以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法(諸如不限于vectornti^tm(invitrogencorp.,carlsbad,ca)的alignx^tm模塊)來實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列間的序列比較和百分比同一性測定。對于alignx^tm，多重比對的默認(rèn)參數(shù)是：缺口開放罰分：10；缺口延伸罰分：0.05；缺口分開罰分范圍：8；比對延遲的%同一性：40。(進(jìn)一步的詳情參見

。

可以使用clustalw計(jì)算機(jī)程序(thompson等人,nucleicacidsresearch,1994,2(22):4673-4680)來測定用于測定詢問序列(本發(fā)明的序列)與主題序列之間的最好總體匹配的另一種方法(也稱為總體序列比對)，所述clustalw計(jì)算機(jī)程序基于higgins等人(computerapplicationsinthebiosciences(cabios),1992,8(2):189-191)的算法。在序列比對中，詢問和主題序列都是dna序列。所述總體序列比對的結(jié)果按百分比同一性計(jì)。dna序列的clustalw比對中經(jīng)由成對比對來計(jì)算百分比同一性所使用的優(yōu)選參數(shù)是：矩陣=iub，k-元組=1，頂部對角線的數(shù)目=5，缺口罰分=3，缺口開放罰分=10，缺口延伸罰分=0.1。對于多重比對，優(yōu)選下列clustalw參數(shù)：缺口開放罰分=10，缺口延伸參數(shù)=0.05；缺口分開罰分范圍=8；比對延遲的%同一性=40。

核酸可以存在于全細(xì)胞中、細(xì)胞裂解物中，或者以部分純化的或基本上純的形式存在。核酸在純化得離開與其在天然環(huán)境中正常相關(guān)的其他細(xì)胞成分時(shí)是“分離的”或“給予基本上純的”。為了分離核酸，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)諸如下列各項(xiàng)：堿/sds處理、cscl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域中公知的其他技術(shù)。

結(jié)合tfpi的特異性表位的單克隆抗體

本文提供了與如seqidno:1所示的人tfpi特異性結(jié)合的單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，抗tfpi單克隆抗體抑制tfpi配體與tfpi的結(jié)合。因此，在一些實(shí)施方案中，抗tfpi單克隆抗體可以抑制tfpi的活性。

提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(seqidno:1)的表位的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含一個(gè)或多個(gè)kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:2或seqidno:4中所示的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:3或seqidno:5中所示的重鏈。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:2中所示的輕鏈和seqidno:3中所示的重鏈。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:4中所示的輕鏈和seqidno:5中所示的重鏈。在一些實(shí)施方案中，還考慮，分離的單克隆抗體可以包含與提供的那些具有實(shí)質(zhì)同源性的輕鏈或重鏈。例如，包含實(shí)質(zhì)同源性的分離的單克隆抗體可以包含一個(gè)或多個(gè)保守取代。

在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(seqidno:1)的表位的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含選自以下的一個(gè)或多個(gè)殘基：seqidno:l的

及其組合。

在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基glu100。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基glu101。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基asp102。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基pro103。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基gly104。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基ile105。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基cys106。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基arg107。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基gly108。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基tyr109。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基lys126。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基gly128。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基gly129。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基cys130。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基leu131。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基gly132。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基asn133。

在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基ile105和asp102。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基ile105和leu131。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基ile105、asp102和leu131。在一些實(shí)施方案中，表位進(jìn)一步包含seqidno:1的殘基

。

在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(seqidno:1)的表位的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含通過在seqidno:1的殘基cys106和cys130之間的二硫鍵連接的兩個(gè)氨基酸環(huán)。在一些實(shí)施方案中，表位進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：seqidno:1的

。在一些實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基ile105。在其他實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基asp102。在其他實(shí)施方案中，表位包含seqidno:1的殘基leu131。并且在一些實(shí)施方案中，表位進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：seqidno:l的

。

也提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(seqidno:1)的表位的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含一個(gè)或多個(gè)kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基和一個(gè)或多個(gè)kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:6或seqidno:8中所示的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:7或seqidno:9中所示的重鏈。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:6中所示的輕鏈和seqidno:7中所示的重鏈。在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含seqidno:8中所示的輕鏈和seqidno:9中所示的重鏈。在一些實(shí)施方案中，還考慮，分離的單克隆抗體可以包含與提供的那些具有實(shí)質(zhì)同源性的輕鏈或重鏈。例如，包含實(shí)質(zhì)同源性的分離的單克隆抗體可以包含一個(gè)或多個(gè)保守取代。

在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：seqidno:1的及其組合。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基asp31。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基asp32。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基gly33。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基pro34。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基cys35。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基lys36。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基cys59。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基glu60。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基asn62。

在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基pro34和glu60。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基pro34和lys36。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含seqidno:1的殘基pro34、lys36和glu60。

在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：seqidno:1的

及其組合。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基glu100。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基glu101。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基pro103。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基gly104。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基ile105。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基cys106。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基arg107。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基gly108。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基tyr109。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基phe114。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基asn116。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基glu123。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基arg124。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基lys126。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基tyr127。

在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基arg107和glu101。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基arg107和tyr109。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基arg107、glu101和tyr109。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含seqidno:1的殘基gly128。

在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基可以額外地包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：seqidno:1的及其組合。

在一些實(shí)施方案中，分離的單克隆抗體包含kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基和kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基，所述kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：；所述kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：

。

也提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制物(seqidno:1)的表位的分離的單克隆抗體，其中所述表位包含通過在seqidno:1的殘基cys35和cys59之間的二硫鍵連接的兩個(gè)氨基酸環(huán)。在一些實(shí)施方案中，表位進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基和一個(gè)或多個(gè)kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域1的殘基包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：seqidno:l的。在一些實(shí)施方案中，kunitz結(jié)構(gòu)域2的殘基包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的殘基：seqidno:l的

。

還提供了可以競爭本文所述的任何抗體結(jié)合tfpi的抗體。例如，與本文所述的抗體結(jié)合相同表位的抗體將能夠有效地競爭結(jié)合tfpi。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合tfpi的分離的單克隆抗體，其中所述分離的單克隆抗體與本文所述的任何分離的單克隆抗體是競爭的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與具有如seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6或seqidno:8所示的輕鏈的抗體是競爭的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與具有如seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7或seqidno:9所示的重鏈的抗體是競爭的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與具有如seqidno:2所示的輕鏈和如seqidno:3所示的重鏈的抗體是競爭的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與具有如seqidno:4所示的輕鏈和如seqidno:5所示的重鏈的抗體是競爭的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與具有如seqidno:6所示的輕鏈和如seqidno:7所示的重鏈的抗體是競爭的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與具有如seqidno:8所示的輕鏈和如seqidno:9所示的重鏈的抗體是競爭的。

還提供了可以競爭本文所述的任何抗體結(jié)合tfpi的雙特異性抗體。例如，此類雙特異性抗體可以結(jié)合如上所述的一個(gè)或多個(gè)表位。

抗體可以是物種特異性的或者可以與多種物種交叉反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，抗體可以與人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、豬、犬、貓或其他哺乳動物物種的tfpi特異性反應(yīng)或交叉反應(yīng)。

抗體可以是各類抗體中任一種的，諸如但不限于igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、分泌性iga、igd和ige抗體。

核酸、載體和宿主細(xì)胞

盡管提供了單克隆抗體的氨基酸序列，但是考慮可以設(shè)計(jì)核酸序列以編碼任何這些單克隆抗體。此類多核苷酸可以編碼抗tfpi抗體的輕鏈或重鏈。在一些實(shí)施方案中，此類多核苷酸可以編碼通過可降解的鍵分開的抗tfpi抗體的輕鏈和重鏈兩者。進(jìn)一步，上述抗體可以使用包含編碼任何所述單克隆抗體的分離核酸分子的表達(dá)載體和包含此類載體的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。

制備針對tfpi的抗體的方法

可以通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼依照本發(fā)明的實(shí)施方案的單克隆抗體的可變區(qū)的核苷酸序列來重組生成單克隆抗體。借助于表達(dá)載體，可以將含有所述核苷酸序列的核酸在適合于生成的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染并表達(dá)。因而，還提供了用于生成與人tfpi結(jié)合的單克隆抗體的方法，包括：

(a)將編碼本發(fā)明的單克隆抗體的核酸分子轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，

(b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以便在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述單克隆抗體，和任選地

(c)分離并純化所生成的單克隆抗體，其中所述核酸分子包含編碼本發(fā)明的單克隆抗體的核苷酸序列。

在一個(gè)實(shí)例中，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，將通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的dna插入表達(dá)載體中以使基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作連接。在此背景中，術(shù)語“可操作連接”意圖指將抗體基因連接入載體中以使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列行使其預(yù)期的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。表達(dá)載體和表達(dá)控制序列選擇為與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？梢詫⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入分開的載體中，或者更典型地，將這兩種基因都插入同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)的方法來將抗體基因插入表達(dá)載體中(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)的限制性位點(diǎn)，或者如果沒有限制性位點(diǎn)存在，則為平端連接)?？梢允褂帽疚闹兴枋龅目贵w的輕鏈和重鏈可變區(qū)來創(chuàng)建任何抗體同種型的全長抗體基因，其通過將它們插入已經(jīng)編碼想要的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中以使vh區(qū)段與載體內(nèi)的ch區(qū)段可操作連接并使vl區(qū)段與載體內(nèi)的cl區(qū)段可操作連接來實(shí)現(xiàn)。另外/或者，重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號肽。可以將抗體鏈基因克隆入載體中以使信號肽以符合讀碼框方式與抗體鏈基因的氨基末端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。

除了抗體鏈編碼基因以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還攜帶調(diào)節(jié)序列，其在宿主細(xì)胞中控制抗體鏈基因的表達(dá)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意圖包括啟動子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)，其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。此類調(diào)節(jié)序列記載于例如。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)(包括調(diào)節(jié)序列的選擇)可以取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、想要的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括指導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，諸如源自巨細(xì)胞病毒(cmv)、猿病毒40(sv40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(admlp))和多瘤的啟動子和/增強(qiáng)子?；蛘?，可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，諸如泛素啟動子或β-珠蛋白啟動子。

除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，重組表達(dá)載體可以攜帶額外的序列，諸如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)志基因。選擇標(biāo)志基因促進(jìn)已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞的選擇(參見例如均為axel等人的美國專利號4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，選擇標(biāo)志基因?qū)σ呀?jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞賦予對藥物諸如g418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。選擇標(biāo)志基因的實(shí)例包括二氫葉酸還原酶(dhfr)基因(用于通過甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增在dhfr-宿主細(xì)胞中使用)和neo基因(用于g418選擇)。

對于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式意圖涵蓋極其多種通常用于將外源dna導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、deae-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。雖然理論上有可能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是抗體在真核細(xì)胞，且最優(yōu)選地哺乳動物宿主細(xì)胞中的表達(dá)是最優(yōu)選的，這是因?yàn)榇祟愓婧思?xì)胞，且特別地哺乳動物細(xì)胞比原核細(xì)胞更有可能裝配并分泌正確折疊且有免疫學(xué)活性的抗體。

用于表達(dá)重組抗體的哺乳動物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國倉鼠卵巢(cho細(xì)胞)(包括與dhfr選擇標(biāo)志(例如如記載于r.j.kaufman和p.a.sharp(1982)mol.biol.159:601-621的)一起使用的dhfr-cho細(xì)胞，其記載于urlaub和chasin,(1980)proc.natl.acad.sci.usa77:4216-4220)、nso骨髓瘤細(xì)胞、cos細(xì)胞、hkb11細(xì)胞和sp2細(xì)胞。在將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞達(dá)足以容許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)或?qū)⒖贵w分泌入培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中的一段時(shí)間來生成抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化方法諸如超濾、大小排阻層析、離子交換層析和離心來從培養(yǎng)基回收抗體。

部分抗體序列表達(dá)完整抗體的用途

抗體主要經(jīng)由位于6個(gè)重鏈和輕鏈cdr的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。出于此原因，cdr內(nèi)的氨基酸序列比cdr外部的序列在各抗體間更加多種多樣。因?yàn)閏dr序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以有可能表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體，其通過構(gòu)建包含嫁接到來自具有不同特性的不同抗體的框架序列的來自特定天然存在抗體的cdr序列的表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)(參見例如

。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共dna數(shù)據(jù)庫獲得。這些種系序列會與成熟的抗體基因序列不同，因?yàn)樗鼈儾粫ㄍ耆b配的可變基因，其在b細(xì)胞成熟過程中通過v(d)j連接而形成。獲得特定抗體的整個(gè)dna序列以再創(chuàng)建具有與初始抗體的那些結(jié)合特性相似的結(jié)合特性的完整重組抗體是不必要的(參見wo99/45962)?？缭絚dr區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列對于此目的通常是足夠的。使用部分序列來確定哪些種系可變和連接基因區(qū)段促成重組的抗體可變基因。然后，使用種系序列來填充可變區(qū)的缺少部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)成熟過程中被切割，而且不促成最終抗體的特性。出于此原因，對表達(dá)構(gòu)建體使用相應(yīng)的種系前導(dǎo)序列是必要的。為了添加缺少的序列，可以通過連接或pcr擴(kuò)增來組合克隆的cdna序列與合成的寡核苷酸?；蛘撸麄€(gè)可變區(qū)可以合成為一套短的、重疊的寡核苷酸，并通過pcr擴(kuò)增來組合以創(chuàng)建完全合成的可變區(qū)克隆。此方法具有某些優(yōu)點(diǎn)，諸如消除或包含特定的限制性位點(diǎn)，或優(yōu)化特定的密碼子。

使用重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列來設(shè)計(jì)重疊的一組合成的寡核苷酸，以創(chuàng)建與天然序列具有相同的氨基酸編碼能力的合成的v序列。合成的重鏈和輕鏈序列可以在三個(gè)方面與天然序列不同：中斷重復(fù)核苷酸堿基串以便于寡核苷酸合成和pcr擴(kuò)增；依照kozak的規(guī)則(kozak,1991,j.biol.chem.266:19867-19870)來摻入最佳的翻譯起始位點(diǎn)；和在翻譯起始位點(diǎn)上游工程改造限制的核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。

對于重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者，近似地在相應(yīng)的非編碼寡核苷酸的中點(diǎn)將經(jīng)優(yōu)化的編碼和相應(yīng)的非編碼鏈序列分解為30-50個(gè)核苷酸的部分。因此，對于每條鏈，可以將寡核苷酸裝配成跨越150-400個(gè)核苷酸的區(qū)段的重疊雙鏈組。然后，使用合并物作為模板來生成150-400個(gè)核苷酸的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。典型地，將單一可變區(qū)寡核苷酸組分解為兩個(gè)合并物，對它們進(jìn)行分開擴(kuò)增以生成兩種重疊的pcr產(chǎn)物。然后，通過pcr擴(kuò)增來組合這些重疊的產(chǎn)物以形成完整的可變區(qū)?？赡苓€想要包括pcr擴(kuò)增中的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段以生成可以容易地克隆入表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。

然后，將再構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、翻譯啟動、恒定區(qū)、3’非翻譯的、多聚腺苷酸化、和轉(zhuǎn)錄終止序列組合以形成表達(dá)載體構(gòu)建體?？梢詫⒅劓満洼p鏈表達(dá)構(gòu)建體組合入單一載體中，共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染、或分開轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，然后將所述宿主細(xì)胞融合以形成表達(dá)這兩條鏈的宿主細(xì)胞。

因此，在另一個(gè)方面，使用人抗tfpi抗體的結(jié)構(gòu)特征來創(chuàng)建保留結(jié)合tfpi的功能的結(jié)構(gòu)相關(guān)人抗tfpi抗體。更具體地，可以將本發(fā)明的單克隆抗體的明確鑒定的重鏈和輕鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)cdr與已知的人框架區(qū)和cdr重組組合以創(chuàng)建本發(fā)明的額外的、經(jīng)重組工程改造的人抗tfpi抗體。

藥物組合物

還提供了藥物組合物，其包含治療有效量的抗tfpi單克隆抗體和藥學(xué)可接受的載體?！八帉W(xué)可接受的載體”是可以添加至活性成分以幫助配制或穩(wěn)定制劑而不對患者引起顯著不利的毒物學(xué)效果的物質(zhì)。此類載體的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括水、糖諸如麥芽糖或蔗糖、白蛋白、鹽諸如氯化鈉等。其他載體記載于例如e.w.martin的remington’spharmaceuticalsciences。此類組合物將含有治療有效量的至少一種抗tfpi單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，此類組合物可以包含治療有效量的一種或多種抗tfpi單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包含如上所述的特異性結(jié)合kunitz結(jié)構(gòu)域1的抗體和如上所述的特異性結(jié)合kunitz結(jié)構(gòu)域1和2的抗體。

藥學(xué)可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用于即時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉劑。對藥學(xué)活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域中已知的。優(yōu)選地，組合物配制用于胃腸外注射。組合物可以配制為溶液、微乳、脂質(zhì)體、或其他適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液態(tài)聚乙二醇等)、及其合適的混合物。在一些情況下，它在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。

可以如下制備無菌可注射溶液，即根據(jù)需要在具有上文所列舉的一種成分或成分組合的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物，接著微過濾滅菌。一般而言，通過將活性化合物摻入無菌媒介物中來制備分散體，所述無菌媒介物含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)及來自那些上文所列舉的成分的其他所需成分。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，一些制備方法是從其先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分和任何其他想要成分的粉末的真空干燥和冷凍干燥(凍干)。

藥學(xué)用途

可以為治療目的使用單克隆抗體來治療遺傳性和獲得性凝血缺乏或缺陷。例如，可以使用上文所描述的實(shí)施方案中的單克隆抗體來阻斷tfpi與fxa的相互作用，或者以阻止對tf/fviia活性的tfpi依賴性抑制。另外，還可以使用單克隆抗體來恢復(fù)tf/fviia驅(qū)動的fxa生成以回避fviii或fix依賴性fxa擴(kuò)增的不足。

單克隆抗體在止血病癥諸如血小板減少(thrombocytopenia)、血小板病癥和出血病癥(例如血友病a、血友病b和血友病c)的治療中具有治療用途?？梢酝ㄟ^對有需要的患者施用治療有效量的抗tfpi單克隆抗體來治療此類病癥。單克隆抗體在治療適應(yīng)癥諸如外傷和出血性中風(fēng)(hemorrhagicstroke)等中不受控制的出血中也具有治療用途。因此，還提供了用于縮短出血時(shí)間的方法，包括對有需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗tfpi單克隆抗體。

抗體可以作為單一療法或者與其他療法聯(lián)合使用以解決止血病癥。例如，認(rèn)為本發(fā)明的一種或多種抗體與凝固因子諸如因子viia、因子viii或因子ix的共施用對于治療血友病是有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療遺傳性和獲得性凝血缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的結(jié)合人組織因子途徑抑制物的單克隆抗體和(b)第二量的因子viii或因子ix，其中所述第一和第二量在一起對于治療所述缺乏或缺陷是有效的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療遺傳性和獲得性凝血缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的結(jié)合人組織因子途徑抑制物的單克隆抗體和(b)第二量的因子viii或因子ix，其中所述第一和第二量在一起對于治療所述缺乏或缺陷是有效的，且進(jìn)一步其中因子vii不是共施用的。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的單克隆抗體和因子viii或因子ix的組合，其中所述組合物不含因子vii。“因子vii”包括因子vii和因子viia。這些聯(lián)合療法有可能降低凝固因子的必要輸注頻率。共施用或聯(lián)合療法意指各自分開配制或在一種組合物中共同配制且當(dāng)分開配制時(shí)在近似相同時(shí)間或在不同時(shí)間，但在相同治療期里施用的兩種治療藥物的施用。

可以以如下劑量和頻率對患有血友病a或b的受試者胃腸外施用藥物組合物，所述劑量和頻率可以隨出血事件的嚴(yán)重程度而變化，或者在預(yù)防療法的情況下，可以隨患者的凝固缺乏的嚴(yán)重程度而變化。

可以以推注或者通過連續(xù)輸注來對有需要的患者施用組合物。例如，作為fab片段存在的發(fā)明性抗體的推注施用可以在0.0025至100mg/kg體重、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10-0.50mg/kg的量中。對于連續(xù)輸注，可以以0.001至100mg/kg體重/分鐘、0.0125至1.25mg/kg/分鐘、0.010至0.75mg/kg/分鐘、0.010至1.0mg/kg/分鐘或0.10-0.50mg/kg/分鐘施用作為fab片段存在的發(fā)明性抗體，持續(xù)一段1-24小時(shí)、1-12小時(shí)、2-12小時(shí)、6-12小時(shí)、2-8小時(shí)、或1-2小時(shí)的時(shí)間。對于施用作為全長抗體(具有完整的恒定區(qū))存在的發(fā)明性抗體，劑量量可以是約1-10mg/kg體重、2-8mg/kg、或5-6mg/kg。此類全長抗體通常會通過延續(xù)一段30分鐘至3小時(shí)的時(shí)間的輸注來施用。施用頻率將取決于狀況的嚴(yán)重程度。頻率范圍可以為每周三次至每兩周或每三周一次。

另外，可以經(jīng)由皮下注射來對患者施用組合物。例如，可以經(jīng)由皮下注射每周、每兩周或每月對患者施用10至100mg抗tfpi抗體的劑量。

如本文中所使用的，“治療有效量”指有效增加體內(nèi)的凝固時(shí)間或者在其他情況下對有需要的患者引起可測量的體內(nèi)益處所需要的抗tfpi單克隆抗體或此類抗體與因子viii或因子ix的組合的量。精確量將取決于許多因素，包括但不限于治療組合物的成分和物理特征、預(yù)期的患者群體、個(gè)體患者考慮等，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定。

實(shí)施例

實(shí)施例1.從大腸桿菌表達(dá)重組tfpi(kunitz結(jié)構(gòu)域2)并純化.

表達(dá)系統(tǒng)

采用命名為pdeco5n的目標(biāo)載體(根據(jù)gateway命名法)。pdeco5n基于pet-16b(novagen)，并且額外編碼his10和nusa標(biāo)簽以及用于表達(dá)融合蛋白的gateway克隆盒，所述融合蛋白由his10/nusa和目標(biāo)蛋白組成。

將編碼融合至kunitz結(jié)構(gòu)域2的n-末端(lys93至phe154，參考uniprot10646)的凝血酶切割位點(diǎn)和gateway結(jié)合位點(diǎn)(attbl-5#,attb2-3#,invitrogen)的tfpi構(gòu)建體克隆到pdeco5n載體中，導(dǎo)致產(chǎn)生命名為pdeco5ntfpikd2的表達(dá)載體。采用bl21de3(novagen)表達(dá)菌株。

使用pdeco5ntfpikd2表達(dá)的融合蛋白的氨基酸序列,600aa

序列組分

表達(dá)

用pdeco5n#209轉(zhuǎn)化的bl21de3菌株作為具有200μg/ml氨芐青霉素的2x50mllb培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)物在37℃下生長14h，攪動速率為180rpm。接下來，具有400mlcirclegrow培養(yǎng)基(q-biogene)的8個(gè)搖瓶各接種8ml預(yù)培養(yǎng)物并在37℃孵育，攪動速率為180rpm。在od600的培養(yǎng)密度，添加iptg(100mm終濃度)用于誘導(dǎo)基因，并進(jìn)一步在17℃下以180rpm培養(yǎng)24h。大腸桿菌通過離心(3000g,10min)沉淀，儲存在-80℃。

純化

將從3.2l培養(yǎng)物沉淀的大腸桿菌質(zhì)量重新懸浮于200ml裂解緩沖液(50mmtris-hclph8.0,300mmnacl,10%(w/w)甘油,40mm咪唑,蛋白酶抑制劑混合物，完全無edta(roche))，在高壓設(shè)備(microfluidics)中均質(zhì)化，并且隨后離心裂解物(100.000g,60min,4℃)。使用?ktaexplorer系統(tǒng)進(jìn)行幾個(gè)純化步驟。在初始imac層析步驟中將濃縮樣品上樣至hi-trap-瓊脂糖hp基質(zhì)(ge)的兩個(gè)連接的5ml單元。使用緩沖液a(50mmtrishclph8.0,300mmnacl,40mm咪唑)平衡、融合蛋白結(jié)合和洗滌hi-trap-瓊脂糖hp基質(zhì)。對于nusa-tfpi融合蛋白的洗脫，使用在緩沖液b(50mmtrishclph8.0,150mmnacl)中40至500mm的咪唑線性梯度。將洗脫級分合并并濃縮(使用amicon超濾裝置濃縮6-7倍)并且緩沖液交換至trishclph8.0。使用trishclph8.0中sephacryl-100(xk26/74)將濃縮樣品(6-7ml)進(jìn)一步應(yīng)用于大小排阻層析。將含有融合蛋白的主峰級分合并，通過超濾(amicon)濃縮至5ml體積。將凝血酶(hti)添加至樣品(酶：融合蛋白比例，1:50w/w)，在21℃下孵育5h，并且通過pmsf(1mm終濃度)最終終止反應(yīng)。隨后，進(jìn)行第二次大小排阻層析步驟(trishclph8.0中的sephacryl-100(xk26/74))，并且通過page監(jiān)測峰級分。將含有游離單體tfpikunitz結(jié)構(gòu)域2的級分收集并濃縮(amicon)，從3.2l大腸桿菌培養(yǎng)物產(chǎn)生約4mg產(chǎn)物。

實(shí)施例2.產(chǎn)生針對tfpi的重組單克隆抗體faba、在大腸桿菌中表達(dá)并純化

表達(dá)

faba使用表達(dá)載體pet28a和大腸桿菌菌株bl21starde3進(jìn)行共表達(dá)。將在表達(dá)載體上編碼的輕鏈和重鏈區(qū)域分別在其n-末端融合到周質(zhì)信號序列。重鏈區(qū)域還在其c-末端編碼his6標(biāo)簽用于純化fab。在tb-instant表達(dá)培養(yǎng)基中過夜生長的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株用于自身誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)(#71491,novagen)。簡而言之，將10ml轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物(在50mlfalcon管中)作為具有30μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)物在37℃下生長14h，攪動速率為180rpm。隨后，具有500mltb-instant過夜表達(dá)培養(yǎng)基的4個(gè)erlenmeyer燒瓶各接種2ml預(yù)培養(yǎng)物，在30℃下以180rpm孵育24h。將培養(yǎng)物在10℃下以10,000g離心30min，并且含有fab的上清液立即用于進(jìn)一步產(chǎn)物純化或儲存于-20℃或-80℃。

或者，fab使用表達(dá)載體pet28a和大腸桿菌菌株bl21starde3在10l生物反應(yīng)器(sartorius)中進(jìn)行共表達(dá)。將500ml轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物在具有30μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中在37℃下生長17h，以165rpm攪動，之后用于用10l自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種攪拌的生物反應(yīng)器。自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有以下組分(每升)：12g胰蛋白胨、24g酵母提取物、9.9g甘油(87%)、12.54gk2hpo4、2.31gkh2po4、0.25gmgso4x7h2o、1g葡萄糖、2.5g乳糖、30mg卡那霉素。用生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)24h(在30℃下，以350-最大800rpm)，隨后通過用離心機(jī)(heraeus)中的離心取出生物量而收獲培養(yǎng)上清液。

純化

用?ktaexplorer10s設(shè)備使用兩步層析程序純化fab。應(yīng)用中空纖維模塊(10kda截止閾值)來將1l澄清培養(yǎng)上清液濃縮至100ml的終體積并且用緩沖液a(50mm磷酸鈉ph8.0,300mmnacl,10mm咪唑)平衡緩沖液組合物。在使用?ktaexplorer系統(tǒng)的初始固定化金屬親和層析(imac)步驟中，將濃縮樣品上樣至5mlni-nta超流基質(zhì)(qiagen)。使用緩沖液a進(jìn)行ni-nta基質(zhì)的平衡、樣品結(jié)合和洗滌(結(jié)合在21℃下進(jìn)行，所有其他層析步驟在4℃)。對于fab的洗脫，使用在緩沖液a中10至250mm的咪唑線性梯度。將來自單一洗脫峰的級分合并(60ml總體積)，通過超濾濃縮至10ml，并且使用hi-prep26/10脫鹽柱緩沖液調(diào)整至pbsph7.4。隨后，將用pbs平衡的2ml抗κ輕鏈抗體基質(zhì)(kappaselectaffinitymedia,0833.10，來自bac)與濃縮的imac洗脫物在室溫下在攪拌下孵育1h。將結(jié)合樣品的基質(zhì)轉(zhuǎn)移到層析柱，并用pbs洗滌。fab樣品用2ml甘氨酸ph2.0洗脫，用1mhepesph7.5中和，并且用pd10脫鹽柱(ge,17-0851-01)緩沖液調(diào)整至pbs。

當(dāng)使用10l生物反應(yīng)器(sartorius)在大腸桿菌中表達(dá)fab時(shí)，使用以下純化程序。將經(jīng)離心的培養(yǎng)上清液依次過濾通過兩個(gè)孔徑為5和0.2μm的一次性濾器模塊(ge,kmp-hc-9204tt;kgf-a-0504tt)。應(yīng)用中空纖維模塊(10kda截止閾值)來將澄清培養(yǎng)上清液濃縮至1500ml的終體積并且用緩沖液a調(diào)整緩沖液組合物。將25mlni-nta超流基質(zhì)(qiagen，在緩沖液a中平衡)添加至濃縮的樣品，并在21℃下孵育1.5h。將結(jié)合樣品的基質(zhì)轉(zhuǎn)移到空層析柱(25x125mm)，連接至?ktaexplorer層析設(shè)備，并用緩沖液a(約250ml)洗滌。對于fab的洗脫，應(yīng)用具有5%(30ml)和10%(35ml)緩沖液b的隨后兩個(gè)步驟梯度和隨后的最高達(dá)100％緩沖液b的線性洗脫梯度。隨后如下處理合并的洗脫級分(72ml)：用離心超濾裝置(截止10kda，amicon)濃縮至終體積20ml，以三個(gè)部分上樣至脫鹽柱(gehiprep,26/10)以便將緩沖液調(diào)整至pbsph7.4，并在離心超濾裝置(amicon)中進(jìn)一步濃縮至終體積40ml。將濃縮樣品在室溫下在攪拌下與5ml抗κ輕鏈抗體基質(zhì)(kappaselectaffinitymedia,bac,用pbs平衡)孵育1h。將結(jié)合樣品的瓊脂糖基質(zhì)轉(zhuǎn)移到層析柱，并用以下順序的洗滌步驟進(jìn)行處理：用15mlpbs洗滌4次；用5ml洗滌緩沖液(100mm磷酸鈉ph6.0，100ml氯化鈉，500mm精氨酸)洗滌兩次。洗脫步驟包括3次應(yīng)用5ml100mm甘氨酸hclph3.0。將洗脫物立即用1mtrishclph8.0中和，并且通過離心(10min,3.200g)去除形成的沉淀。將樣品通過超濾(amicon)濃縮，并應(yīng)用至具有tbs緩沖液的?ktaexplorer層析系統(tǒng)上的superdex-75制備級16/60柱。峰級分通過page進(jìn)行分析，并且合并代表1.1摩爾比的fab的重鏈和輕鏈的級分，并再次通過超濾(amicon)濃縮至終體積1ml。從10l大腸桿菌培養(yǎng)上清液分離出約4mgfaba。

分析大小排阻層析(?ktamicrosystem,s755/150柱,100mmtrishcl,ph7.5)用來證明faba/tfpikd2復(fù)合物的形成。因此，分別分析faba、tfpikd2和faba加tfpikd2的混合物(圖1)。

實(shí)施例3.tfpi-faba復(fù)合物的結(jié)晶和x-射線結(jié)構(gòu)測定

結(jié)晶

使用座滴法使tfpikunitz結(jié)構(gòu)域2和單克隆抗體faba的共晶體在20℃下生長。將蛋白復(fù)合物濃縮至9mg/ml，并通過混合等體積的蛋白溶液和作為沉淀劑的孔溶液(wellsolution)(15%peg8000,trishclph7.5)進(jìn)行結(jié)晶。一天后出現(xiàn)晶體。

數(shù)據(jù)采集與處理

在液氮中將晶體在結(jié)晶緩沖液中的30％甘油中快速冷凍而用于冷凍保護(hù)。在marccd檢測器上以束線bl14.1,bessy同步加速器(berlin)收集數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)編入索引并與xds

整合，用pointless(p.r.evans,(2005)actacryst.d62,72-82)準(zhǔn)備用于放大(scale)，并且用scala(p.r.evans,(2005)actacryst.d62,72-82)放大。晶體衍射高達(dá)2.6?，并且具有空間群p212121，晶胞常數(shù)(cellconstants)a=65.7，b=114.7，c=151.9；α=β=γ=90°，并且不對稱單元中有兩個(gè)tfpi-fab復(fù)合物。

結(jié)構(gòu)測定和精確化(refinement)

使用phaser(a.j.mccoy等人(2007)j.appl.cryst.40,658-674)和公開的tfpikunitz結(jié)構(gòu)域2(pdb編號1tfx)和fab片段(pdb編號3mxw)的x-射線結(jié)構(gòu)作為搜索模型通過分子替換解析了tfpikunitz結(jié)構(gòu)域2和單克隆抗體fab共結(jié)構(gòu)。在分子置換之前，fab模型序列用chainsaw(n.stein,(2008)j.appl.cryst.41,641-643)進(jìn)行修改。用coot(p.emsley等人(2010)actacryst.d66:486-501)的模型構(gòu)建和使用refmac5.5(g.n.murshudov等人(1997)actacryst.d53,240-255)的最大似然精確化的迭代幾輪完成了該模型。kd2的區(qū)域phea31-asna35、prob9、lysm139-serm142、和asp140-phe154顯示弱電子密度，并且沒有包括在模型中。數(shù)據(jù)集和精確化統(tǒng)計(jì)總結(jié)在表1中。

表1.tfpi-faba復(fù)合物的數(shù)據(jù)集和精確化統(tǒng)計(jì)

^a括號中的數(shù)值用于高分辨率殼。

^b，其中ihkl是反射hkl的強(qiáng)度，并且<ihkl>是多次觀察的平均強(qiáng)度。

^c，其中fobs和fcalc分別是觀察和計(jì)算的結(jié)構(gòu)因子振幅。

^d5%測試集。

^ermsd，距離理想的立體化學(xué)的參數(shù)集的均方根誤差。

實(shí)施例4.faba的基于x-射線結(jié)構(gòu)的表位作圖

tfpi-faba的復(fù)合物(圖2)結(jié)晶為兩個(gè)拷貝復(fù)合物/每個(gè)不對稱單元。復(fù)合物的主鏈重疊，整體均方根偏差(rmsd)為0.7?，各fab結(jié)合至結(jié)合的tfpi表位。用ccp4程序areaimol(p.j.briggs(2000)ccp4newsletterno.38)分析tfpi與faba接觸的殘基(表位)和相應(yīng)的埋藏表面。具有最小5?²埋藏表面或超過50％埋藏表面的殘基已經(jīng)被視為接觸的(表2)。用areaimol分析faba與tfpi接觸的殘基(互補(bǔ)位)和相應(yīng)的埋藏表面。具有最小5?²埋藏表面或超過50％埋藏表面的殘基已經(jīng)被視為接觸的(表3)。

表2：tfpi與faba接觸的殘基。鏈c和n對應(yīng)于不對稱單元中相應(yīng)復(fù)合物的tfpi。

表3：faba與tfpi接觸的殘基。鏈a、b和鏈l、m代表不對稱單元中各自復(fù)合物的faba輕鏈和重鏈。

被faba識別的非線性表位定義為區(qū)域glu100-arg109和lys126、gly128-asn133。faba的互補(bǔ)位包括輕鏈(lc)殘基，和重鏈(hc)殘基

?；诮佑|的數(shù)量，cdr-l3、cdr-h2和cdr-h3似乎是主要相互作用位點(diǎn)。

表位由通過cys106和cys130之間的二硫鍵連接的兩個(gè)環(huán)組成(圖3)。二硫鍵針對cdr-h3的hc_trp108堆疊，而相鄰ile105和leu131埋藏在由

生成的疏水性裂縫中。基于接觸的數(shù)量，ile105和leu131是與cdr-l3、cdr-h2和cdr-h3的疏水性接觸中的主要表位殘基。

tfpi區(qū)域glu101-ile105與cdr-h2相互作用。界面的強(qiáng)烈特征在于hc_tyr54、hc_tyr60和hc_arg62。hc_tyr54顯示與asp102的側(cè)鏈的極性相互作用。hc_tyr60顯示與glu101的主鏈羰基氧的極性相互作用，并且hc_arg62顯示與asp102的側(cè)鏈和gly132的主鏈羰基氧的極性相互作用。

asp102是與cdr-h2hc_tyr54和hc_arg62的極性相互作用中的關(guān)鍵表位殘基。faba的野生型hc_asp62替換為精氨酸導(dǎo)致親和力增加120倍?；趚射線結(jié)構(gòu)，這可以通過從hc_asp62和asp102之間的排斥轉(zhuǎn)換為hc_arg62和asp102的極性相互作用，和主鏈羰基氧來解釋。

arg107的胍基分別與cdr-h1和cdr-h3的hc_asn32和hc_asp105的側(cè)鏈直接相互作用。已經(jīng)顯示arg107對于因子xa的抑制是必不可少的(m.s.bajaj等人(2001)thrombhaemost86(4):959-72.)。faba占據(jù)該關(guān)鍵殘基，并且在抑制因子xa中競爭arg107功能。

實(shí)施例5.faba和其優(yōu)化變體fabc的互補(bǔ)位比較

為了評估faba的優(yōu)化變體fabc對tfpi表位結(jié)合的一致性，分析輕鏈和重鏈的序列比對(圖11a)和fabc的同源性模型(圖11b)的fabc中faba互補(bǔ)位殘基的保守性。使用我們的tfpi-fabax射線結(jié)構(gòu)作為輸入模板結(jié)構(gòu)用dsmodeler(accelrys,inc;fiser,a.和salia.(2003)methodsinenzymology,374:463-493)計(jì)算同源性模型。同源性模型顯示與faba相比幾乎相同的骨架構(gòu)型，其中rmsd<0.5?。在tfpi-faba復(fù)合物中觀察的20個(gè)互補(bǔ)位殘基中，hc_asn32是fabc中不同的唯一互補(bǔ)位殘基，其中天冬氨酸殘基在各自的位置(圖11)。hc_asn32與tfpiarg107相互作用?？紤]到其羧酸酯基和預(yù)期與arg107的胍基的相互作用，fabc的asp32應(yīng)當(dāng)與tfpi更緊密地相互作用?；趂aba和fabc互補(bǔ)位殘基之間的高序列保守性和預(yù)期相同的骨架構(gòu)型，fabc很可能與faba識別相同的tfpi表位。

實(shí)施例6.tfpi-因子xa相互作用的抑制的基于x-射線結(jié)構(gòu)的基本原理

faba預(yù)期tfpi-因子xa相互作用和抑制。tfpi-faba復(fù)合物與tfpi-胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)(m.j.burgering等人(1997)jmolbiol.269(3):395-407)的疊加顯示，含有faba表位的tfpi區(qū)域?qū)τ谂c胰蛋白酶(其是因子xa的替代物)的相互作用是至關(guān)重要的?；趚-射線結(jié)構(gòu)，faba與kunitz結(jié)構(gòu)域2上觀察到的表位的結(jié)合應(yīng)當(dāng)通過空間位阻排除因子xa的結(jié)合(圖4)。

實(shí)施例7.產(chǎn)生重組tfpi(kunitz結(jié)構(gòu)域1+2)、在大腸桿菌中表達(dá)并純化

表達(dá)系統(tǒng)

命名為pdeco5n的目標(biāo)載體(根據(jù)gateway命名法)是基于et-16b(novagen)。該載體還編碼his10和nusa標(biāo)簽以及用于表達(dá)融合蛋白的gateway克隆盒，所述融合蛋白由his10/nusa和目標(biāo)蛋白組成。

將編碼融合至kunitz結(jié)構(gòu)域1+2的n-末端(asp1至phe154，參考uniprot10646，成熟tfpiα)的tev蛋白酶切割位點(diǎn)和gateway結(jié)合位點(diǎn)(attbl-5#,attb2-3#,invitrogen)的dna構(gòu)建體克隆到pdeco5n載體中，導(dǎo)致產(chǎn)生命名為pdeco5ntfpikd1+2的表達(dá)載體。使用的表達(dá)菌株是bl21de3(novagen)。

使用pdeco5ntfpikd1+2表達(dá)的融合蛋白的氨基酸序列,600aa。

序列組分

表達(dá)

用pdeco5ntfpikd1+2轉(zhuǎn)化的bl21de3菌株作為具有200μg/ml氨芐青霉素的2x100mllb培養(yǎng)基中的預(yù)培養(yǎng)物在37℃下生長14h，攪動速率為180rpm。用200ml預(yù)培養(yǎng)物接種具有10l培養(yǎng)體積(lb培養(yǎng)基,200μg/ml氨芐青霉素)的生物培養(yǎng)器(sartoriusstedimbiotech)，并在在37℃下孵育，攪動速率為150rpm。在od600的培養(yǎng)密度，添加iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)至100mm的終濃度用于誘導(dǎo)基因，并在17℃下以50%的po2最低水平和180-800rpm的攪拌速度進(jìn)一步培養(yǎng)24h。大腸桿菌通過離心(3000g,10min)沉淀，儲存在-80℃。

純化

將從10l培養(yǎng)物沉淀的大腸桿菌質(zhì)量重新懸浮于500ml裂解緩沖液[50mmtrishclph8.0,300mmnacl,10%(w/w)甘油,40mm咪唑,蛋白酶抑制物混合物，完全無edta(roche)]，在高壓設(shè)備(microfluidics)中均質(zhì)化，并且隨后離心裂解物(100.000g,60min,4℃)。使用?kta純化系統(tǒng)進(jìn)行幾個(gè)純化步驟。在初始imac層析步驟中將離心的可溶裂解物級分上樣至含有50mlni-瓊脂糖hp基質(zhì)(ge)的柱。使用緩沖液a(50mmtrishclph8.0,300mmnacl,40mm咪唑)平衡、融合蛋白結(jié)合和洗滌hi-trap-瓊脂糖hp基質(zhì)。對于nusa-tfpi融合蛋白的洗脫，使用在緩沖液b(50mmtrishclph8.0,150mmnacl)中40至500mm的咪唑線性梯度。將洗脫級分合并(總體積140ml)，并且分份上樣至脫鹽柱hiprep26/10(ge)(兩個(gè)連接的柱單元)，用于交換至具有50mmtrishclph8.0,150mmnacl,5mmcacl2)的緩沖液。為了去除nusa標(biāo)簽，在4℃下以1:66w/w的酶與融合蛋白比例進(jìn)行用his6-標(biāo)簽的tev的蛋白水解消化，持續(xù)16小時(shí)。將樣品再次上樣至含有50mlni-瓊脂糖hp基質(zhì)(ge)的柱上，以將游離tfpi與未切割的融合蛋白和his-tev分離。然后將imac步驟的洗脫物應(yīng)用至大小排阻層析，所述大小排阻層析(sec,柱s100,ge)用來分離單體tfpi級分，所述單體tfpi級分通過超濾(amicon,具有3kda-截止范圍的單元)濃縮至約1.5mg/ml。純化的最終tfpikunitz結(jié)構(gòu)域1+2樣品在page中作為雙條帶遷移，表觀分子量約為18kda。進(jìn)一步分析(sec,western印跡)揭示，對應(yīng)于上面條帶的唯一蛋白與fabb免疫反應(yīng)。

實(shí)施例8.人igg1的蛋白水解處理并從其純化fabb。

表達(dá)

從其人igg1形式蛋白水解處理fabb。fabb_igg1在哺乳動物細(xì)胞(hek293)中作為分泌蛋白表達(dá)。為了分離igg1，將1.6l培養(yǎng)上清液上樣至hitrapmabselectsure的兩個(gè)連接柱(來自ge,5ml床體積,流速1.5ml/min,4℃,持續(xù)16h)。對于柱洗滌和平衡，使用由pbs和500mmnacl組成的緩沖液。將結(jié)合的igg1洗脫(50mm乙酸鈉,500mmnaclph3.5和隨后具有ph3.0的相同緩沖液)，中和(2.5mtris>11)，并且通過超濾濃縮至約13mg/ml。

使用在1.5mleppendorf反應(yīng)管中的22個(gè)級分用固定的木瓜蛋白酶(pierce,20ml漿料)用于消化約270mg(在12.5ml中)的igg1(孵育16h，37℃，攪動1400rpm)。處理之后，離心樣品，收集上清液，用pbs洗滌沉淀，并且合并上清液和清洗的洗滌液兩者。

再次將消化的樣品上樣至兩個(gè)連接的hitrapmabselectsure柱(2x5ml)，使fc和fab材料分離。通過超濾將合并的分離的fabb級分濃縮至約8mg/ml(總得率120mg)。此外，使用具有superdex75的大小排阻層析(柱26/60,流速2.5ml/min，使用pbs)，用于進(jìn)一步純化。進(jìn)一步濃縮和無菌過濾之后，fabb的總得率為115mg，濃度為8.5mg/ml。

分析大小排阻層析(?ktamicrosystem,s755/150柱,100mmtrishcl,ph7.5)用來證明fabb/tfpikd1+2復(fù)合物的形成(圖5)。對于fabb，在sec柱上觀察到對應(yīng)于20kda的表觀分子量的意料之外的長保留時(shí)間，其非常類似于對于tfpikd1+2檢測到的分子量。

實(shí)施例9.產(chǎn)生tfpikunitz結(jié)構(gòu)域1+2與fabb的復(fù)合物

為了形成免疫復(fù)合物，將tfpikunitz結(jié)構(gòu)域1+2和fabb以約1:1.5(w/w)的比例組合。因此，將3.85mg的濃縮的單體tfpikunitz結(jié)構(gòu)域1+2蛋白(來自s100合并的級分)與7.4mgfabb(來自secsuperdex75)混合，并且在21℃孵育16h。經(jīng)由分析sec(s200/150)和western印跡證明復(fù)合物形成。該復(fù)合物通過sec(s20026/26)在具有150mmnacl的10mmtrishclph7.4中進(jìn)一步純化，通過超濾(amicon,具有5kda截止范圍的單元)濃縮至10.3mg/ml，其用于結(jié)晶。

實(shí)施例10.tfpi-fabb復(fù)合物的結(jié)晶和x-射線結(jié)構(gòu)測定

結(jié)晶

使用座滴法使包含tfpi–kunitz結(jié)構(gòu)域1(kd1)和kunitz結(jié)構(gòu)域2(kd2)的蛋白構(gòu)建體和單克隆tfpi抗體fabb的共晶體在4℃下生長。將蛋白復(fù)合物濃縮至10mg/ml，并通過混合等體積的蛋白溶液和作為沉淀劑的孔溶液(20%peg8000)進(jìn)行結(jié)晶。三天后出現(xiàn)晶體。

數(shù)據(jù)采集與處理

在液氮中將晶體在結(jié)晶緩沖液中的30％甘油中快速冷凍而用于冷凍保護(hù)。在marccd檢測器上以束線bl14.1,bessy同步加速器(berlin)收集一種晶體的數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)編入索引并與imosflm(a.g.w.leslie,(1992),jointccp4+esf-eamcbnewsletteronproteincrystallography,no.26)整合，用pointless(p.r.evans,(2005)actacryst.d62,72-82)準(zhǔn)備用于放大(scale)，并且用scala(p.r.evans,(2005)actacryst.d62,72-82)放大。晶體衍射高達(dá)2.3?，并且具有空間群p21，晶胞常數(shù)(cellconstants)a=80.3,b=71.9,c=108.8;β=92.5°，并且不對稱單元中有兩個(gè)tfpi-kd1,-kd2-fab復(fù)合物。

結(jié)構(gòu)測定和精確化

使用phaser(a.j.mccoy等人(2007)j.appl.cryst.40,658-674)、molrep(a.vagin和a.teplyakov(1997)j.appl.cryst.30,1022-10)和內(nèi)部和公開的tfpi-kd2(pdb編號1tfx)和fab片段(pdb編號1w72)的x-射線結(jié)構(gòu)作為搜索模型通過分子替換解析了tfpi-kd1、-kd2和單克隆抗體fab的共結(jié)構(gòu)。在分子置換之前，fab和kd1模型用chainsaw(n.stein,(2008)j.appl.cryst.41,641-643)進(jìn)行處理。用coot(p.emsley等人(2010)actacryst.d66:486-501)的模型構(gòu)建和使用refmac5.5(g.n.murshudov等人(1997)actacryst.d53,240-255)的最大似然精確化的迭代幾輪完成了該模型。兩種fab的區(qū)域hc_ser131-hc_ser136、tfpi殘基asp1-leu21,asp149-phe154和kd1-kd2接頭殘基arg78-glu92顯示弱電子密度，并且沒有包括在模型中。數(shù)據(jù)集和精確化統(tǒng)計(jì)總結(jié)在表4中。

表4.tfpi-fabb復(fù)合物的數(shù)據(jù)集和精確化統(tǒng)計(jì)

^a括號中的數(shù)值用于高分辨率殼。

^b，其中ihkl是反射hkl的強(qiáng)度，并且<ihkl>是多次觀察的平均強(qiáng)度。

^c，其中fobs和fcalc分別是觀察和計(jì)算的結(jié)構(gòu)因子振幅。

^d5%測試集。

^ermsd，距離理想的立體化學(xué)的參數(shù)集的均方根誤差。

實(shí)施例11.基于x-射線結(jié)構(gòu)的表位作圖

tfpi-kd1、-kd2和fabb的復(fù)合物(圖6)結(jié)晶為兩個(gè)拷貝復(fù)合物/每個(gè)不對稱單元。復(fù)合物的主鏈重疊，整體rmsd為1.0?，各fabb結(jié)合至結(jié)合的tfpi-kd1和-kd2的表位。兩個(gè)kunitz結(jié)構(gòu)域直接相互作用或通過水介導(dǎo)的與fabb的相互作用而相互作用。kd1和kd2也彼此相互作用。用ccp4程序areaimol(p.j.briggs(2000)ccp4newsletterno.38)分析tfpi與fabb接觸的殘基(表位)和相應(yīng)的埋藏表面。具有最小5?²埋藏表面或超過50％埋藏表面的殘基已經(jīng)被視為接觸的(表5)。用areaimol分析fabb與tfpi接觸的殘基(互補(bǔ)位)和相應(yīng)的埋藏表面。具有最小5?²埋藏表面或超過50％埋藏表面的殘基已經(jīng)被視為接觸的(表6)。

表5：tfpi與fabb接觸的殘基。鏈c、d和鏈n、o對應(yīng)于不對稱單元中相應(yīng)復(fù)合物的tfpikunitz結(jié)構(gòu)域1和kunitz結(jié)構(gòu)域2。

表6：fabb與tfpi接觸的殘基。鏈a、b和鏈l、m代表不對稱單元中各自復(fù)合物的fabb輕鏈和重鏈。

fabb識別kd1和kd2的非線性表位，所述非線性表位由以下定義：tfpi-kd1的殘基asp31-lys36、cys59(其與cys35形成二硫鍵)、glu60和asn62，和tfpi-kd2的glu100、glu101、區(qū)域pro103-cys106(其與cys130形成二硫鍵)、殘基arg107-tyr109、phe114、asn116、glu123、arg124和殘基lys126-gly128。fabb中與tfpi-kd1相互作用的互補(bǔ)位包括

。fabb中與tfpi-kd2相互作用的互補(bǔ)位包括

?；诮佑|的數(shù)量，輕鏈cdr似乎是對于tfpi-kd1的主要相互作用位點(diǎn)，重鏈cdr似乎是對于tfpi-kd2的主要相互作用位點(diǎn)。

tfpi-kd1上的非線性表位由通過cys35和cys59之間的二硫鍵連接的兩個(gè)環(huán)區(qū)域組成。該表位的特征在于被asp31、asp32、glu60和lys36與fabb的極性相互作用的三角包圍的pro34的中央疏水性相互作用(圖7)。

pro34處在cdr-l1的lc_tyr30和lc_tyr31、cdr-l3的lc_trp90和cdr-h3的hc_tyr102生成的疏水性裂縫中。asp31和asp32具有與cdr-h3的極性相互作用和與hc_arg101、hc_tyr102和水分子的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。hc_tyr102側(cè)鏈處于良好朝向以具有與pro34的疏水性相互作用，與asn31的極性相互作用和與cdr-l3的lc_trp90的芳香相互作用。

asp31和asp32與cdr-h3的相互作用是關(guān)鍵的表位特征，并且hc_tyr102和hc_arg101的朝向和相互作用似乎是至關(guān)重要的。野生型殘基hc_lys99突變?yōu)榱涟彼釋?dǎo)致親和力增加20倍。hc_leu99位于輕鏈和重鏈之間的疏水性界面，隨后是cdr-h3環(huán)。在該位置上的極性和柔性賴氨酸側(cè)鏈?zhǔn)遣焕?，并且干擾了最佳cdr-h3構(gòu)型和抗原相互作用。

形成極性三角的第二個(gè)角的glu60與lc_tyr30(cdr-l1)、lc_trp90的側(cè)鏈和lc_gly93(cdr-l3)的主鏈氮相互作用。

該三角的第三個(gè)角由lys36形成。lys36對于tfpi對因子viia/組織因子復(fù)合物的抑制是必要的殘基(m.s.bajaj等人(2001)thrombhaemost86(4):959-72.)。在與fabb的復(fù)合物中，lys36顯著接觸，并且被cdr-l1lc_leu27、lc_arg28、lc_asn29、lc_tyr31、cdr-l2lc_asp50和水分子所埋藏。lys36與因子viia/組織因子復(fù)合物的相互作用同時(shí)結(jié)合至fabb，并且其抑制似乎被排除。

tfpi-kd2上的非線性表位由三個(gè)部分組成，所述部分包含殘基glu100、glu101、pro103-tyr109、phe114；asn116和glu123；arg124、lys126-gly128。kd2-表位形成與fabbcdr-l1、-l2、-h1和-h3的極性和疏水性相互作用(圖8)。

glu100、glu101、arg107和tyr109是提供與由cdr-hl(與glu100和glu101相互作用)cdr-l1、-l2、-h3(與arg107相互作用)和cdr-l2、-h3(與tyr109相互作用)生成的fabb的三個(gè)分離表面區(qū)域接觸的強(qiáng)烈極性或疏水性錨定點(diǎn)的關(guān)鍵表位殘基。

arg107分別被cdr-l1、-l2、-h3的lc_tyr31、lc_tyr49、hc_arg101、和hc_tyr102顯著接觸，并且額外與kd1的gly33和cys35相互作用。已經(jīng)顯示arg107對于因子xa的抑制是必不可少的(m.s.bajaj等人(2001)thrombhaemost86(4):959-72.)。fabb占據(jù)該關(guān)鍵殘基，并且在抑制因子xa中排斥arg107功能。

glu100和glu101與cdr-hl殘基hc_arg30、hc_ser31、和hc_thr28和hc_tyr32形成氫鍵。

tyr109處在由cdr-l2lc_tyr48、和cdr-h3殘基hc_tyr100、和hc_trp103生成的疏水性利基(niche)中，并且與hc_asp105形成氫鍵。

實(shí)施例12.fabb和其優(yōu)化變體fabd的互補(bǔ)位比較

為了評估fabb的優(yōu)化變體fabd對tfpi表位結(jié)合的一致性，分析輕鏈和重鏈的序列比對(圖12a)和fabd的同源性模型(圖12b)的fabd中fabb互補(bǔ)位殘基的保守性。使用我們的tfpi-fabbx射線結(jié)構(gòu)作為輸入模板結(jié)構(gòu)用dsmodeler(accelrys,inc;fiser,a.和salia.(2003)methodsinenzymology,374:463-493)計(jì)算同源性模型。同源性模型顯示與fabb相比幾乎相同的骨架構(gòu)型，其中rmsd<0.5?。在tfpi-fabb復(fù)合物中觀察的29個(gè)互補(bǔ)位殘基中，七個(gè)殘基(五個(gè)輕鏈殘基，兩個(gè)重鏈殘基)在fabd中不同(圖12)。lc_arg28;lc_asn29、lc_asp92、和lc_gly93顯示與tfpi表位殘基的主鏈相互作用。預(yù)期fabd中這些殘基的替換不會誘導(dǎo)與不同tfpi表位的結(jié)合。fabd中的lc_tyr48和hc_gln1替換為苯丙氨酸和谷氨酸是忽略不計(jì)的，因?yàn)樵趚射線結(jié)構(gòu)中沒有觀察到極性側(cè)鏈相互作用。hc_arg30顯示與tfpi的glu100的極性相互作用，并且在fabd中被替換為絲氨酸。在該位置上，對于與tfpi相互作用，精氨酸應(yīng)該是比絲氨酸有利的。基于fabb和fabd互補(bǔ)位殘基之間分析的替換的預(yù)期影響、整體序列保守性和fabd同源性模型的低rmsd，考慮fabd與fabb識別相同的tfpi表位。

實(shí)施例13tfpi與因子xa和因子viia/組織因子復(fù)合物的相互作用的抑制的基于x-射線結(jié)構(gòu)的基本原理

fabb結(jié)合tfpi的kd1和kd2兩者。kd2結(jié)合并抑制因子xa。kd1結(jié)合并抑制因子viia/組織因子復(fù)合物。已經(jīng)報(bào)道了kd2與胰蛋白酶的復(fù)合物的x-射線結(jié)構(gòu)(m.j.burgering等人(1997)jmolbiol.269(3):395-407)和bpti與tf和因子viia的胞外部分的復(fù)合物的x-射線結(jié)構(gòu)(e.zhang等人(1999)jmolbiol285(5):2089-104.)。胰蛋白酶是因子xa的替代物，bpti是tfpi-kd1的同源物。tfpi-fabb復(fù)合物與kd2-胰蛋白酶或bpti-因子viia/組織因子的疊加揭示，抗體結(jié)合分別排除kd1和kd2與其天然配體因子viia/組織因子和因子xa的結(jié)合(圖9，圖10)。

實(shí)施例14.fabc和fabd阻斷tfpi與fxa和fvii/tf的結(jié)合

為了證實(shí)fabc和fabd可以阻斷tfpi上的fviia/tf-復(fù)合物或fxa-結(jié)合，我們進(jìn)行了表面等離子體共振(biacore)研究。使用胺偶聯(lián)試劑盒(gehealthcare)用170ru的人tfpi固定cm5芯片。注射60μl體積的fabc、fabd或陰性對照fab，然后在芯片上注射60μl的5μg/mlfviia/tf復(fù)合物或fxa。注射凝血因子后，注射30至45μl的10mm甘氨酸(ph1.5)以再生芯片。將陰性對照fab后生成的凝血因子的相對單位(ru)指定為100％，并且計(jì)算注射的fabc或fabd后生成的凝血因子的ru。如圖13a中顯示，在0.3μg/ml和1μg/ml濃度，tfpi上的fabc結(jié)合分別引起fxa結(jié)合顯著降低至42.6％和5.2％。同樣，0.3和1μg/ml濃度的fabd分別將fxa結(jié)合降低至20.8％和7.6％。fviia/tf結(jié)合的結(jié)果顯示在圖13b中。在0.3和1μg/ml濃度，fabc分別將fviia/tf結(jié)合降低至25.1%和10.0%，而fabd完全阻斷fviia/tf結(jié)合，這可能是由于fabd與tfpi的kd1的直接結(jié)合。

雖然本發(fā)明已經(jīng)參照具體的實(shí)施方案和實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解可以進(jìn)行各種修飾和變化，而且可以在不背離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍的前提下替換等同方案。因而，說明書和實(shí)施例應(yīng)以說明性而非限制性意義看待。此外，本文中所提及的所有文章、書籍、專利申請和專利通過引用完整地并入本文。

序列表

<110>bayerhealthcarellc

wang,zhuozhi

murphy,john

marquardt,tobias

moosmayer,dieter

<120>針對組織因子途徑抑制物(tfpi)的單克隆抗體

<130>bhc115001

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>276

<212>prt

<213>智人

<400>1

aspserglugluaspglugluhisthrileilethraspthrgluleu

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