本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的川芎嗪酰腙類衍生物、制備方法及其應(yīng)用，屬于化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥嚴(yán)重影響人類健康和生命安全，抗腫瘤藥物的開發(fā)和應(yīng)用是解決這一問題的重要途徑。川芎嗪為中藥川芎的主要藥效成分，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管等作用，臨床主要用于缺血性心腦血管疾病的治療。近年來，研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪及其衍生物可以通過改善荷瘤機(jī)體的高凝狀態(tài)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑，抑制肺癌的生長和侵襲轉(zhuǎn)移。川芎嗪及其衍生物在腫瘤的預(yù)防和治療中顯示出良好的應(yīng)用前景。水楊醛是一類重要的有機(jī)中間體。酰腙類化合物為結(jié)構(gòu)中含有酰腙基（–conhn=ch–）官能團(tuán)的一類化合物，由酰肼與醛或酮發(fā)生親核加成反應(yīng)制備得到。酰腙類化合物由于結(jié)構(gòu)中含有酰腙基等活性基團(tuán)，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種生物活性，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有技術(shù)中在制備川芎嗪酰腙類衍生物時(shí)，存在收率低、抗腫瘤活性低、對(duì)正常細(xì)胞毒性高的缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤活性的川芎嗪酰腙類衍生物。本發(fā)明還提供上述川芎嗪酰腙類衍生物的制備方法以及在肺癌預(yù)防和治療中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)以下發(fā)明目的：

本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物，收率高；抗腫瘤活性高；對(duì)正常細(xì)胞毒性低。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種川芎嗪酰腙類衍生物，所述川芎嗪酰腙類衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

；

該川芎嗪酰腙類衍生物的化學(xué)名稱為：n-(2-羥基苯亞甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰肼；

該川芎嗪酰腙類衍生物的分子式為：c15h16n4o2；

該川芎嗪酰腙類衍生物的相對(duì)分子量為：284.13。

本發(fā)明還提供了上述川芎嗪酰腙類衍生物的制備方法，其包括如下步驟：

（1）制備川芎嗪酸

將kmno4水溶液滴加到川芎嗪中，60min內(nèi)滴加完畢，反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)24h，過濾，濾液減壓濃縮，冰水浴冷卻，用稀鹽酸調(diào)至ph為1，冰箱過夜冷藏，濾液用氯仿萃取，減壓濃縮，用95%乙醇重結(jié)晶，得川芎嗪酸。

（2）制備川芎嗪酸乙酯

將濃硫酸加入川芎嗪酸和無水乙醇中，回流12~24h。減壓濃縮除去乙醇，加水溶解，再加入nahco3使ph為8~10。乙酸乙酯萃取，干燥，過濾，減壓蒸除溶劑，得川芎嗪酸乙酯；

所述回流，優(yōu)選為15~17h；

所述川芎嗪酸、無水乙醇、濃硫酸的摩爾比為1:（28~35）:（0.3~1.4）；

優(yōu)選為1:（33~35）:（0.3~0.4）；

所述濃硫酸，質(zhì)量濃度為98%，密度為1.8364g/ml。

（3）制備川芎嗪酰肼

將川芎嗪酸乙酯中加入無水乙醇及水合肼，回流6~10h，減壓濃縮蒸除過量的乙醇和水合肼，加少量無水乙醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得川芎嗪酰肼；

所述回流，優(yōu)選為6~8h；

所述川芎嗪酸乙酯：80%水合肼的摩爾比為1:（9~13）；優(yōu)選為1:（12~13）。

（4）制備川芎嗪水楊醛酰腙

將川芎嗪酰肼溶解于無水乙醇中，加入水楊醛，回流2~5h，室溫冷卻，過濾，無水乙醇重結(jié)晶，得川芎嗪水楊醛酰腙；

所述回流，優(yōu)選為2~3h；

所述川芎嗪酰肼：水楊醛的摩爾比為1:（0.8~1.6）；優(yōu)選為1:（1.3~1.4）。

本發(fā)明所述方法，產(chǎn)物總收率為40%~49%，上述優(yōu)選方案，制備的產(chǎn)物，總收率為47~49%。

本發(fā)明通過將川芎嗪酰肼與水楊醛縮合，制備了一種含有酰腙基的川芎嗪酰腙類衍生物，該化合物含有川芎嗪及酰腙活性抗腫瘤結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮作用，產(chǎn)生強(qiáng)抗腫瘤活性，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生較低的毒性。該衍生物的制備對(duì)于新型抗腫瘤藥物的開發(fā)具有重要意義。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

（1）本發(fā)明的川芎嗪酰腙類衍生物以川芎嗪為母核，合成了目標(biāo)產(chǎn)物n-(2-羥基苯亞甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰肼，該結(jié)構(gòu)中含有川芎嗪結(jié)構(gòu)，又含有酰腙基活性結(jié)構(gòu)，使制備的川芎嗪酰腙類衍生物具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)正常細(xì)胞毒性低。本發(fā)明的合成路線簡單，操作方便，產(chǎn)物總收率為40~49%，產(chǎn)率高，能夠應(yīng)用到抗肺癌藥物的制備中。

（2）本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用。

采用mtt法進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明所述川芎嗪酰腙類衍生物，對(duì)a549細(xì)胞株抑制率為：100μm的藥物濃度，24h的抑制率為69.43%、48h的抑制率為84.03%、72h的抑制率為92.68%；陽性對(duì)照藥物5-fu，100μm的藥物濃度，24h的抑制率為38.88%、48h的抑制率為82.55%、72h的抑制率為98.92%。

本發(fā)明所述藥物與5-fu在相同的濃度下，在24h對(duì)肺癌a549細(xì)胞株的抑制率明顯強(qiáng)于5-fu，48h、72h抑制率與5-fu相當(dāng)。

（3）本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物，對(duì)人體正常細(xì)胞的毒性低。采用mtt法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明所述藥物的測(cè)試濃度為12.69μm，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h的細(xì)胞活率為79.02%、48h的細(xì)胞活率為68.74%；陽性對(duì)照藥物5-fu的測(cè)試濃度為1.69μm，24h的細(xì)胞活率為88.70%、48h的細(xì)胞活率為71.25%。

本發(fā)明所述川芎嗪酰腙類衍生物，使用濃度為5-fu的7.5倍時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的毒性無顯著差別。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物的合成路線示意圖；

圖2為本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物的理化性質(zhì)指標(biāo)；

圖3為本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物的氫譜；

圖4為本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物的碳譜；

圖5為本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物的質(zhì)譜；

圖6為本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物的紅外圖譜。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。同時(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1一種川芎嗪酰腙類衍生物的制備方法

包括以下步驟：

（1）制備川芎嗪酸

將8.4%的kmno4水溶液（含kmno46.32g）滴加到3.8g川芎嗪中，60min內(nèi)滴加完畢，反應(yīng)溫度控制在35℃，反應(yīng)24h，過濾，濾液減壓濃縮，冰水浴冷卻，用稀鹽酸調(diào)至ph為1，冰箱過夜冷藏，氯仿萃取，減壓濃縮，再用95%乙醇重結(jié)晶，得淡黃色結(jié)晶性粉末川芎嗪酸。

（2）制備川芎嗪酸乙酯

將0.75ml（0.0138mol）濃硫酸加入1.66g（0.01mol）川芎嗪酸和17ml無水乙醇（0.29mol）中，回流24h。減壓濃縮除去乙醇，加入10ml蒸餾水，再加入nahco3調(diào)節(jié)ph為9；乙酸乙酯萃取，無水na2so4干燥過夜，過濾，減壓蒸除溶劑，得川芎嗪酸乙酯。

（3）制備川芎嗪酰肼

將1.3165g（0.0068mol）川芎嗪酸乙酯中加入10ml無水乙醇及4ml80%水合肼（0.066mol），回流8h，減壓濃縮蒸除過量的乙醇和水合肼，加少量無水乙醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得苦瓜味的淡黃色針狀結(jié)晶川芎嗪酰肼。

（4）制備川芎嗪水楊醛酰腙

將0.9g（0.005mol）川芎嗪酰肼溶解于55ml無水乙醇中，加入0.55ml水楊醛（0.0053mol），回流3h，室溫冷卻，過濾，無水乙醇重結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶川芎嗪水楊醛酰腙。

采用實(shí)施例1合成方法制備得到的川芎嗪水楊醛酰腙總產(chǎn)率為41%。

實(shí)施例2一種川芎嗪酰腙類衍生物的制備方法

包括以下步驟：

（1）制備川芎嗪酸

將含有8.4%的kmno4水溶液（含kmno463.2g）滴加到38g川芎嗪中，60min內(nèi)滴加完畢，反應(yīng)溫度控制在35℃，反應(yīng)24h，過濾，濾液減壓濃縮，冰水浴冷卻，用稀鹽酸調(diào)至ph為1，冰箱過夜冷藏，氯仿萃取，減壓濃縮，再用95%乙醇重結(jié)晶，得淡黃色結(jié)晶性粉末川芎嗪酸。

（2）制備川芎嗪酸乙酯

將1.5ml（0.0276mol）濃硫酸加入16.6g（0.1mol）川芎嗪酸和170ml（2.9mol）無水乙醇中，回流16h。減壓濃縮除去乙醇，加入50ml蒸餾水，再加入nahco3調(diào)節(jié)ph為8。乙酸乙酯萃取，無水na2so4干燥過夜，過濾，減壓蒸除溶劑，得川芎嗪酸乙酯。

（3）制備川芎嗪酰肼

將13.165g（0.068mol）川芎嗪酸乙酯中加入100ml無水乙醇及40ml80%水合肼（0.66mol），回流6h，減壓濃縮蒸除過量的乙醇和水合肼，加少量無水乙醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得苦瓜味的淡黃色針狀結(jié)晶川芎嗪酰肼。

（4）制備川芎嗪水楊醛酰腙

將9g（0.05mol）川芎嗪酰肼溶解于450ml無水乙醇中，加入5.5ml水楊醛（0.053mol），回流2h，室溫冷卻，過濾，無水乙醇重結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶川芎嗪水楊醛酰腙。

采用實(shí)施例2合成方法制備得到的川芎嗪水楊醛酰腙總產(chǎn)率為46.4%。

實(shí)施例3一種川芎嗪酰腙類衍生物的制備方法

包括以下步驟：

（1）制備川芎嗪酸

將含有8.4%的kmno4水溶液（含kmno43.16g）滴加到19g川芎嗪中，60min內(nèi)滴加完畢，反應(yīng)溫度控制在35℃，反應(yīng)24h，過濾，濾液減壓濃縮，冰水浴冷卻，用稀鹽酸調(diào)至ph為1，冰箱過夜冷藏，氯仿萃取，減壓濃縮，再用95%乙醇重結(jié)晶，得淡黃色結(jié)晶性粉末川芎嗪酸。

（2）制備川芎嗪酸乙酯

將0.86ml（0.0158mol）濃硫酸加入8.2g（0.049mol）川芎嗪酸和83ml無水乙醇（1.42mol）中，回流16h。減壓濃縮除去乙醇，加入50ml蒸餾水，再加入nahco3調(diào)節(jié)ph為8。乙酸乙酯萃取，無水na2so4干燥過夜，過濾，減壓蒸除溶劑，得川芎嗪酸乙酯。

（3）制備川芎嗪酰肼

將7.9g（0.041mol）川芎嗪酸乙酯中加入100ml無水乙醇及25.6ml80%水合肼（0.42mol），回流6h，減壓濃縮蒸除過量的乙醇和水合肼，加少量無水乙醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得苦瓜味的淡黃色針狀結(jié)晶川芎嗪酰肼。

（4）制備川芎嗪水楊醛酰腙

將7.2g（0.04mol）川芎嗪酰肼溶解于400ml無水乙醇中，加入4.2ml水楊醛（0.04mol），回流2h，室溫冷卻，過濾，無水乙醇重結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶川芎嗪水楊醛酰腙。

采用本實(shí)施例合成方法制備得到的川芎嗪水楊醛酰腙總產(chǎn)率為43.1%。

實(shí)施例4一種川芎嗪酰腙類衍生物的制備方法

包括以下步驟：

（1）制備川芎嗪酸

將含有8.4%的kmno4水溶液（含kmno425.28g）滴加到15.2g川芎嗪中，60min內(nèi)滴加完畢，反應(yīng)溫度控制在35℃，反應(yīng)24h，過濾，濾液減壓濃縮，冰水浴冷卻，用稀鹽酸調(diào)至ph為1，冰箱過夜冷藏，氯仿萃取，減壓濃縮，再用95%乙醇重結(jié)晶，得淡黃色結(jié)晶性粉末川芎嗪酸。

（2）制備川芎嗪酸乙酯

將0.9ml（0.016mol）濃硫酸加入6.64g（0.04mol）川芎嗪酸和82ml無水乙醇（1.4mol）中，回流16h。減壓濃縮除去乙醇，加入50ml蒸餾水，再加入nahco3調(diào)節(jié)ph為8。乙酸乙酯萃取，無水na2so4干燥過夜，過濾，減壓蒸除溶劑，得川芎嗪酸乙酯。

（3）制備川芎嗪酰肼

將5.3g（0.027mol）川芎嗪酸乙酯中加入100ml無水乙醇及19.84ml80%水合肼（0.33mol），回流6h，減壓濃縮蒸除過量的乙醇和水合肼，加少量無水乙醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得苦瓜味的淡黃色針狀結(jié)晶川芎嗪酰肼。

（4）制備川芎嗪水楊醛酰腙

將3.6g（0.02mol）川芎嗪酰肼溶解于350ml無水乙醇中，加入2.97ml水楊醛（0.028mol），回流2h，室溫冷卻，過濾，無水乙醇重結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶川芎嗪水楊醛酰腙。

采用本實(shí)施例合成方法制備得到的川芎嗪水楊醛酰腙總產(chǎn)率為48.6%。

上述實(shí)施例1~4制備得到的川芎嗪酰腙類衍生物的結(jié)構(gòu)式為：

；

該川芎嗪酰腙類衍生物的化學(xué)名稱為n-(2-羥基苯亞甲基)-3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰肼，分子式為c15h16n4o2，相對(duì)分子量為284.13。

經(jīng)過理化性質(zhì)及波譜測(cè)試，其理化性質(zhì)為：白色針狀結(jié)晶，其余理化性質(zhì)指標(biāo)見附圖2。

實(shí)施例5體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

將上述實(shí)施例1~4制備得到的川芎嗪酰腙類衍生物進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)：

采用mtt法進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，具體試驗(yàn)方法為：肺癌a549細(xì)胞加入2ml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃，5%co2)，每2天換一次液。待細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，將舊培養(yǎng)液倒掉，用1mlpbs輕洗細(xì)胞2次。加入1ml胰酶消化1min，吸棄胰酶，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液2ml終止胰酶的作用，用吸管反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，使之從瓶壁脫落成細(xì)胞懸液，900轉(zhuǎn)/min離心3min，棄去上清，再加入2ml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，用一次性吸管反復(fù)吹打30次，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔10000個(gè)接種于96孔板，每孔100μl，置于37℃、5%co2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后待細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)時(shí)，加入本發(fā)明制備得到的川芎嗪酰腙類衍生物（川芎嗪酰腙類衍生物預(yù)先用0.22μm微孔濾膜進(jìn)行無菌處理，分別配制成50μm、100μm、150μm、200μm的濃度）。

川芎嗪酰腙類衍生物與a549細(xì)胞分別作用24h、48h、72h后，吸棄原培養(yǎng)液，用1mlpbs洗滌，每孔加入mtt10μl，1640培養(yǎng)液90μl，孵育4h后加入dmso20μl，室溫震蕩10min。將96孔培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，于490nm測(cè)定每孔的光密度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。評(píng)價(jià)本發(fā)明制備的川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)肺癌a549細(xì)胞的抑制作用。采用100μm5-fu作為陽性對(duì)照。

本發(fā)明的川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)a549細(xì)胞株抑制率及48h半數(shù)有效濃度如表1所示。

表1本發(fā)明的川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)a549細(xì)胞株抑制率及48h半數(shù)有效濃度

從表1，可以看出本發(fā)明川芎嗪酰腙類衍生物與5-fu的體外抗腫瘤活性隨時(shí)間增加藥效增強(qiáng)，川芎嗪酰腙類衍生物在72h呈顯著的量效關(guān)系，其24h、48h對(duì)肺癌a549細(xì)胞株的抑制率強(qiáng)于5-fu，72h抑制率與5-fu相當(dāng)。川芎嗪酰腙類衍生物48h腫瘤抑制率最強(qiáng)，48h半數(shù)有效抑制濃度為12.69μm，5-fu的48h半數(shù)有效抑制濃度1.69μm。結(jié)果表明川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)肺癌a549細(xì)胞具有顯著的抑制作用。

實(shí)施例6體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：

將本發(fā)明制備得到的川芎嗪酰腙類衍生物進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：

采用mtt法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（huvec）加入2ml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，放入37℃、5%co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2天換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，用1mlpbs輕洗細(xì)胞2次。加入1ml胰酶消化1min，吸棄胰酶，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液2ml終止胰酶的作用，用吸管反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，使之從瓶壁脫落成細(xì)胞懸液，900轉(zhuǎn)/min離心3min，棄去上清，再加入2ml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，用一次性吸管反復(fù)吹打30次，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔10000個(gè)接種于96孔板，每孔100μl，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后待細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)時(shí)，加入本發(fā)明制備得到的川芎嗪酰腙類衍生物（衍生物預(yù)先用0.22μm微孔濾膜進(jìn)行無菌處理）。

川芎嗪酰腙類衍生物與huvec分別作用24h、48h、72h后，吸棄原培養(yǎng)液，用1mlpbs洗滌，每孔加入mtt10μl，1640培養(yǎng)液90μl，孵育4h后加入dmso20μl，室溫震蕩10min。將96孔培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，于490nm測(cè)定每孔的光密度值，評(píng)價(jià)川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，結(jié)果用細(xì)胞活率表示，細(xì)胞活率越高表示藥物毒性越小。本發(fā)明的川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)huvec細(xì)胞株毒性評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示。采用5-fu作為陽性對(duì)照。

表2本發(fā)明的川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)huvec細(xì)胞株毒性評(píng)價(jià)結(jié)果

從表2可以看出隨著給藥時(shí)間的增加，huvec細(xì)胞活率降低，即本發(fā)明川芎嗪酰腙類衍生物與5-fu隨著給藥時(shí)間的增加，對(duì)正常細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞毒性。本發(fā)明川芎嗪酰腙類衍生物（12.69μm）48h細(xì)胞毒性與5-fu（1.69μm）相當(dāng)，72h細(xì)胞毒性略大于5-fu，可能與其給藥劑量高于5-fu有關(guān)。經(jīng)與陽性抗腫瘤藥物5-fu對(duì)比，川芎嗪酰腙類衍生物對(duì)正常細(xì)胞毒性較低。本發(fā)明闡述的結(jié)果為川芎嗪酰腙類衍生物在抗肺癌藥物的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，為高效低毒抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有重要價(jià)值。

除非特殊說明，本發(fā)明所述的百分比，均為質(zhì)量百分比，所述的比例，均為質(zhì)量比例。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。