本發(fā)明屬于天然活性產(chǎn)物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿及其制備方法和以其為先導(dǎo)化合物在活性化合物的制備與醫(yī)藥方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玄參科泡桐屬植物，全屬共有7種，分別是白花泡桐、毛泡桐、蘭考泡桐、楸葉泡桐、中國臺灣泡桐、川泡桐和南方泡桐，光泡桐是毛泡桐的變種。它們的果實統(tǒng)稱為泡桐果。除東北北部、內(nèi)蒙古、新疆北部、西藏等地區(qū)外全國均有分布，栽培或野生。

泡桐作為一種優(yōu)質(zhì)木材，它不僅在工農(nóng)業(yè)方面有廣泛用途，同時它還是一種常用的中草藥，其花、葉、皮、根、果古時就有其藥用記載。如《本草綱目》記述：“桐葉主惡蝕瘡著陰，皮主五痔，殺三蟲?；ㄖ鞲地i瘡，消腫生發(fā)?！薄端幮哉摗芬惭裕骸爸挝辶?，沐發(fā)去頭風(fēng)，生發(fā)滋潤”?！度珖胁菟巺R編》載泡桐果有祛痰止咳平喘作用，中醫(yī)用于治療慢性氣管炎、氣喘等。上世紀(jì)70年代，河南省防治慢性氣管炎泡桐協(xié)作組曾先后在鄭州、開封、新鄉(xiāng)和商丘等地臨床觀察泡桐果（煎劑、片劑、注射液）治療哮喘和慢性支氣管炎患者950例，并對部分病例進(jìn)行通宵同住觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泡桐果可顯著改善氣管炎患者的咳、痰、喘及肺部體征，總有效率為85%~95%，顯效以上為45%~72%；通過治療前后監(jiān)測病人的心、肝、腎功能，發(fā)現(xiàn)泡桐果無明顯的毒副作用。動物實驗研究表明，泡桐花與果實的提取物對治療哮喘等支氣管炎癥具有比較好的效果。

泡桐果中富含碳取代香葉烯基黃酮、木脂素與三萜類化合物，它們表現(xiàn)出多種顯著的生物活性，它們具有顯著的細(xì)胞毒，抗氧化，抗病毒，抗菌，抗炎和抑制乙酰與丁酰膽堿酯酶等生物活性。有關(guān)泡桐植物的利用可檢索到多份專利申請，但有關(guān)從泡桐果中制備泡桐生物堿堿的制備方法及其在藥品、保健品或化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用文獻(xiàn)或?qū)＠暾埼匆妶蟮馈?/p>

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供從泡桐果中得到的一種具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿及其制備方法與其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，主要包括生物堿的結(jié)構(gòu)確證、分離制備與生物活性研究。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一方面提供一種具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿，化學(xué)名稱為：8-羥基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氫吡咯駢[2，1-a]異喹啉-3-酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

另一方面提供具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿的制備方法，包括以下步驟：

a）干燥的楸葉泡桐果實粉碎，吹去種子，取果皮8.5kg用95%乙醇回流提取3次，每次10l，合并提取液，真空濃縮，得到提取物680g。

b）取提取物600g，加熱溶解于5l70%乙醇，靜置24h，上清液減壓濃縮，濃縮液以適量硅膠拌樣，進(jìn)行硅膠柱層析，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯洗脫，得二氯甲烷提取物198g。

c）將二氯甲烷提取物170g經(jīng)過硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，薄層色譜檢測，合并相同組分，4：6洗脫物22g再次經(jīng)過硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，99：1洗脫物2.3g經(jīng)過sephadexlh-20柱層析，甲醇洗脫，采用tlc監(jiān)測，得到含有化合物1的混合物粗品，其再經(jīng)過ods50-75μm柱層析，采用30%～100%甲醇梯度洗脫，甲醇結(jié)晶，得到化合物123.8mg。

上述具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿的制備方法，作為優(yōu)選，步驟b中采用2kg硅膠柱200-300目層析。

上述具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿的制備方法，作為優(yōu)選，步驟b中采用洗脫劑的體積比是石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯=8:15:15。

上述具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿的制備方法，作為優(yōu)選，步驟c中采用1kg硅膠柱200-300目層析。

上述具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿的制備方法，作為優(yōu)選，步驟c中采用石油醚-乙酸乙酯溶劑梯度洗脫的系統(tǒng)為100：0、95：5、9：1、85：15、8：2、7：3、6：4、4：6、3：7、0：100。

上述具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿的制備方法，作為優(yōu)選，步驟c中采用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫的系統(tǒng)為100：0、99：1、98：2、95：5、9：1、8：2。

再一方面提供具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿在制備抗癌藥物或保健品方面的應(yīng)用。

上述的應(yīng)用，作為優(yōu)選，所述的抗癌藥物或保健品為用于肺癌a549細(xì)胞增殖的抑制藥物或保健品。

上述的應(yīng)用，作為優(yōu)選，所述抗癌藥物或保健品含有藥物有效計量的如權(quán)利1所述的生物堿和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明對泡桐果的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，分離得到了一個具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的新生物堿，結(jié)構(gòu)為8-羥基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氫吡咯駢[2，1-a]異喹啉-3-酮。

（2）本發(fā)明具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿，其具有比較好的細(xì)胞毒作用，可以作為抗癌的藥物或保健品使用，可被開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn)工業(yè)，用于抗癌方面的疾病治療。

附圖說明

圖1是生物堿的結(jié)構(gòu)式及主要的hmbc,¹h-¹hcosy反應(yīng)式（其中為hmbc，為¹h-¹hcosy）；

圖2是生物堿(20μm)對肺癌a549細(xì)胞周期的影響(，n=3)示意圖；

圖3是生物堿結(jié)構(gòu)的ir譜圖；

圖4是生物堿結(jié)構(gòu)的¹h-nmr譜圖；

圖5是生物堿結(jié)構(gòu)的¹³c-nmr譜圖；

圖6是生物堿結(jié)構(gòu)的hmqc譜圖；

圖7是生物堿結(jié)構(gòu)的hmbc譜圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

實施例1，一種具有吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)的生物堿，化學(xué)名稱為：8-羥基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氫吡咯駢[2，1-a]異喹啉-3-酮，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1：

1）生物堿的結(jié)構(gòu)表征：

生物堿結(jié)構(gòu)母核為吡咯駢異喹啉結(jié)構(gòu)，c-3位氧化為羰基，與n形成一個內(nèi)酰胺，苯環(huán)上c-8與c-9分別被羥基與甲氧基取代，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示；

生物堿為白色粉末，esi-ms給出準(zhǔn)分子離子峰m/z234[m＋h]⁺，說明相對分子量為233，結(jié)合¹h-和¹³c-nmr譜，可確定分子式為c13h15no3，不飽和度為7。如圖3，ir中3298，1681，1594，1514cm^-1的吸收峰表明結(jié)構(gòu)中具有羥基、羰基與苯環(huán)結(jié)構(gòu)。如圖4，¹h-nmr中顯示出14個氫質(zhì)子，δ3.82（3h，s）是一個甲氧基信號，δ6.58（1h，s），6.69（1h，s）為芳香環(huán)上對位氫信號，表明苯環(huán)為1，2，4，5-四取代形式（占用四個飽和度）。如圖5，¹³c-nmr譜中顯示13個碳信號，出現(xiàn)在低場的δ175.92為羰基碳信號，結(jié)合ir中1681cm^-1的吸收峰，可推斷結(jié)構(gòu)中存在一個酰胺結(jié)構(gòu)。在低場處δ109.30，116.35，127.18，129.84，146.72，148.59為苯環(huán)上的六個碳信號，δ56.65是一個明顯的甲氧基碳信號。此外，結(jié)合圖6hmqc，δ28.93，29.01，32.85，38.62為四個亞甲基碳信號，δ58.59是一個次甲基碳信號，¹h-¹hcosy顯示它們組成了結(jié)構(gòu)中“-ch2-ch2-”和“-ch-ch2-ch2-”兩個結(jié)構(gòu)片段，與酰胺結(jié)構(gòu)滿足另外三個不飽和度，三者須形成兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在圖7hmbc譜中，δ4.10(h-5)和δ58.58(c-10b)；δ4.10，3.03(h2-5)和δ175.92(c-3)；δ2.57，2.36(h2-2)和δ175.92(c-3)；δ4.10(h-5)和δ127.18(c-6a)；δ4.76(h-10b)和δ129.84(c-10a)；δ2.72(h2-2)和δ129.84(c-10a)；δ6.69(h-10)和δ58.58(c-10b)；δ6.58(h-7)和δ29.01(c-6)之間分別具有明顯的遠(yuǎn)程相關(guān)信號，根據(jù)這些相關(guān)信息，可推斷出化合物1的結(jié)構(gòu)為吡咯駢異喹啉（圖1）。此外，δ6.69(h-10)與δ146.76顯示強相關(guān)，與δ148.52弱相關(guān)，而δ6.58(h-7)與δ148.52顯示強相關(guān)，與δ146.76弱相關(guān)，說明c-9和c-8的¹³c-nmr數(shù)據(jù)分別為δ148.52和δ146.76。δ3.82（-och3）和δ148.52之間的hmbc相關(guān)信號確定甲氧基連接到c-9上。因此，該化合物的結(jié)構(gòu)鑒定為8-羥基-9-甲氧基-1，2，3，5，6，10b-六氫吡咯駢[2，1-a]異喹啉-3-酮（圖1）。該化合物的碳?xì)鋽?shù)據(jù)與從鸚哥花中得到的一個生物堿非常相似，區(qū)別在于二者結(jié)構(gòu)中甲氧基和羥基的位置正好相反。經(jīng)檢索，上述物質(zhì)為一個新天然產(chǎn)物。

表1.生物堿的¹h-和¹³c-nmr數(shù)據(jù)

生物堿：白色粉末，c13h15no3，uv(ch3oh)λmax=286nm；2838，2449，1681，1594，1514，1426，1270，1233，1207，1106cm^-1；hr-esi-msm/z234.1051[m＋h]⁺（計算值234.2052），esi-msm/z233.8[m＋h]⁺；¹h-和¹³c-nmr數(shù)據(jù)見表1。

2）該生物堿的制備方法

干燥的楸葉泡桐果實粉碎，吹去種子，取果皮（8.5kg）用95%乙醇回流提取3次，每次10l，合并提取液，真空濃縮，得到提取物（680g）。取提取物600g，加熱溶解于5l70%乙醇，靜置24h，上清液減壓濃縮，濃縮液以適量硅膠拌樣，進(jìn)行硅膠（200-300目，2kg）柱層析，依次用石油醚（8l）、二氯甲烷（15l）、乙酸乙酯（15l）洗脫，得二氯甲烷提取物198g。將二氯甲烷提取物（170g）經(jīng)過硅膠（200-300目，1kg）柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（100：0、95：5、9：1、85：15、8：2、7：3、6：4、4：6、3：7、0：100）溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，薄層色譜檢測，合并相同組分，4：6洗脫物22g再次經(jīng)過硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（100：0、99：1、98：2、95：5、9：1、8：2）梯度洗脫，99：1洗脫物（2.3g）經(jīng)過sephadexlh-20柱層析，甲醇洗脫，采用tlc監(jiān)測，得到含有化合物1的混合物粗品，其再經(jīng)過ods（50-75μm）柱層析，30%→100%甲醇梯度洗脫，甲醇結(jié)晶，得到化合物1（23.8mg）。

3)生物堿的活性篩選

用mtt法檢測了該生物堿對體外培養(yǎng)的肺癌a549細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果表明此化合物的細(xì)胞毒作用比較顯著，其ic50為16.51μm。以20μm的濃度作用a549細(xì)胞24小時后，可使g1期細(xì)胞的比例明顯增大，比空白對照增加約12%（圖2），表明該化合物可把a549細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期g1期。

以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。