本發(fā)明涉及一種香豆素吡唑啉熒光化合物的應(yīng)用，尤其涉及7-羥基香豆素吡唑啉衍生物即3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮在制備grp94抑制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

grp94(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94)由hsp90b1基因編碼，是hsp90(熱休克蛋白90)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的亞型，在結(jié)構(gòu)上與hsp90高度保守。grp94主要參與細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白和膜蛋白的折疊和裝配。臨床研究表明，grp94參與黑色素瘤、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌等一系列癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，grp94已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。此外，grp94也會(huì)參與到自身免疫以及炎癥相關(guān)疾病中。grp94的分子伴侶功能主要依賴于它的atp酶結(jié)構(gòu)域，在結(jié)構(gòu)上不同于hsp90，因此設(shè)計(jì)合成特異性靶向grp94的抑制劑用于腫瘤等疾病的治療具有重要意義。然而，目前關(guān)于grp94抑制劑的研究較少，亟待開發(fā)可以用于臨床研究的grp94抑制劑。

香豆素是自然界中一類重要的天然有機(jī)化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗hiv、抗氧化、抗凝血、抗抑郁、消炎止痛和保護(hù)肝臟等藥理作用。新生霉素是香豆素類抗生素的代表藥，對(duì)多種癌細(xì)胞有抑制作用，能與抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用，逆轉(zhuǎn)抗癌藥的耐藥性。新生霉素可抑制hsp90的活性，通過與hsp90的c端atp位點(diǎn)結(jié)合，而產(chǎn)生抗腫瘤作用。香豆素類化合物具有藥理運(yùn)用較廣、生物利用度高、合成較為簡單、分子量較小和低毒性等特點(diǎn)。

吡唑啉衍生物是一類重要的含氮五元雜環(huán)化合物。吡唑啉類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗變形蟲、抗高血壓、抗抑郁、消炎止痛和抑制免疫等功能。此類化合物還具有良好的光學(xué)性質(zhì)，普遍應(yīng)用于紡織品的熒光增白劑、熒光探針、染料等方面。

香豆素和吡唑啉衍生物均為重要的有機(jī)化合物，在有機(jī)合成領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮即為香豆素吡唑啉衍生物，其結(jié)構(gòu)式為：

分子式：c24h18n2o3

分子量：382.1317，性狀：固體粉末。

經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)檢索查新，利用上述香豆素吡唑啉衍生物3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮作為grp94抑制劑的研究與應(yīng)用，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮在制備grp94抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮(hcp1)在制備grp94抑制劑中的應(yīng)用。

其中：有效抑制grp94生物學(xué)功能的3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮的濃度為1～10μm。

優(yōu)選的，有效抑制grp94生物學(xué)功能的3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮的濃度為10μm。

為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮的生化和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來闡明其在制備grp94抑制劑及其相關(guān)研究中的應(yīng)用。

采用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：其中所述3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮在以下實(shí)驗(yàn)中簡稱hcp1。

1、hcp1與grp94直接相互作用

通過biacore表面等離子體共振的方法在體外檢測hcp1與grp94蛋白之間的相互作用。將grp94蛋白固定于cm5芯片上，分別使用2.74μm,1.83μm,1.22μm,0.81μm和0.54μm的hcp1進(jìn)行注射，獲得hcp1與grp94相互作用時(shí)的傳感圖和平衡解離常數(shù)。

結(jié)果表明：通過biacoret200所得的響應(yīng)值和hcp1成濃度對(duì)應(yīng)關(guān)系，hcp1和grp94相互作用的平衡解離常數(shù)為1.683μm，說明hcp1可以直接結(jié)合到grp94上。(見圖1)。

2、hcp1在細(xì)胞內(nèi)與grp94共定位

利用hcp1的熒光特性，通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測hcp1在a549細(xì)胞內(nèi)的發(fā)光情況和分布情況。

通過免疫熒光染色檢測hcp1與grp94在a549細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。

結(jié)果表明：(1)在405nm，488nm和546nm的激發(fā)波長下hcp1在細(xì)胞內(nèi)發(fā)射熒光。633nm和647nm波長激發(fā)時(shí)hcp1不發(fā)熒光。hcp1分布于a549細(xì)胞的胞質(zhì)中，在細(xì)胞核內(nèi)沒有分布。(2)hcp1和grp94在細(xì)胞內(nèi)共定位。說明hcp1特異性的靶向grp94(見圖2)。

3、hcp1抑制grp94的生物學(xué)功能

grp94作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶蛋白，參與協(xié)助tlr9由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到溶酶體和內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。通過免疫熒光雙染法檢測hcp1對(duì)tlr9在a549細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。使用溶酶體標(biāo)記蛋白lamp2對(duì)溶酶體進(jìn)行標(biāo)記。a549細(xì)胞經(jīng)grp94sirna干擾grp94的蛋白表達(dá)，hcp1(10μm)或hsp90α和hsp90β的抑制劑auy922(50nm)處理24h后進(jìn)行免疫熒光雙染檢測tlr9和溶酶體的共定位情況。通過westernblot檢測grp94sirna對(duì)grp94蛋白表達(dá)的干擾效率。

hsp90在胞質(zhì)中的亞型hsp90α和hsp90β受抑制時(shí)會(huì)引起hsp70蛋白水平的升高，而grp94的抑制劑對(duì)hsp70的蛋白水平?jīng)]有影響。使用不同濃度的hcp1(1μm，5μm和10μm)處理a549細(xì)胞24h,westernblot檢測hsp70的蛋白水平變化。

結(jié)果表明：(1)hcp1處理和grp94sirna可以降低tlr9和溶酶體的共定位。說明hcp1可以抑制tlr9由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)。(2)hcp1處理并不引起細(xì)胞內(nèi)hsp70蛋白水平的變化。說明hcp1抑制grp94的生物學(xué)功能，同時(shí)并不影響胞質(zhì)中hsp90的功能。這為hcp1作為grp94的抑制劑提供了很好的理論基礎(chǔ)(見圖3)。

上述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，經(jīng)t檢驗(yàn)：p<0.05表示有顯著性差異；p<0.01表示有極顯著性差異。

由上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果，可以得出如下結(jié)論：

hcp1與grp94直接相互作用。在細(xì)胞內(nèi)hcp1仍然具有熒光特性，與grp94存在共定位。說明hcp1特異性的靶向grp94。hcp1抑制grp94協(xié)助tlr9在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并且不影響細(xì)胞質(zhì)中hsp90的功能。這為hcp1作為grp94的抑制劑提供了很好的理論基礎(chǔ)。

grp94作為hsp90在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的亞型，參與到腫瘤，自身免疫和炎癥相關(guān)的疾病中。grp94的抑制劑可以通過抑制grp94的生物學(xué)功能抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供的3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮為研制開發(fā)有關(guān)grp94的抑制劑奠定了基礎(chǔ)。該化合物還可以作為一種有效的化學(xué)工具為研究grp94的生物學(xué)功能提供有力手段。

附圖說明

圖1：hcp1與grp94直接相互作用。

a：hcp1化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

b：通過biacoret200測定hcp1和grp94之間的結(jié)合情況。不同濃度的hcp1(2.74μm,1.83μm,1.22μm,0.81μm和0.54μm)與固定于cm5芯片的grp94蛋白相互作用，測定其響應(yīng)值。平衡解離常數(shù)kd＝1.683μm。

圖2：hcp1與grp94共定位。

a：hcp1在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)光情況。hcp1(10μm)處理a549細(xì)胞3h，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察不同波長激發(fā)光(405nm，488nm，546nm，633nm和647nm)激發(fā)時(shí)hcp1在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)光情況。bar＝20μm。

b：hcp1與grp94的共定位情況。hcp1(10μm)處理a549細(xì)胞3h，免疫熒光染色結(jié)果顯示hcp1和grp94共定位(共定位系數(shù)：0.83)，dapi染細(xì)胞核。bar＝20μm。

圖3：hcp1抑制grp94的功能。

a：hcp1抑制tlr9與溶酶體的共定位。使用grp94sirna干擾grp94的蛋白表達(dá)，hcp1(10μm)或auy922(50nm)處理a549細(xì)胞24h，免疫熒光雙染結(jié)果顯示grp94sirna和hcp1處理可以抑制tlr9和lamp2的共定位，dapi染細(xì)胞核。共定位系數(shù)分別為control(0.75)，sigrp94(0.59)，hcp1(0.57)和auy922(0.71)。bar＝20μm。

b：grp94sirna的干擾效率。westernblot結(jié)果顯示grp94sirna處理a549細(xì)胞24h的干擾效率。

c：hcp1不影響hsp70的蛋白水平。不同濃度的hcp1(1μm，5μm，10μm)處理a549細(xì)胞24h，westernblot檢測hsp70的蛋白水平。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮的制備

將2,4-二羥基苯甲醛(20mmol)、乙酰乙酸乙酯(24mmol)溶于30ml乙醇溶液中，滴加1ml哌啶作催化劑。反應(yīng)液加熱回流3h至反應(yīng)終點(diǎn)，冷至室溫后析出大量草綠色固體。抽濾得粗產(chǎn)品，再用乙醇重結(jié)晶得到綠色產(chǎn)品7-羥基-3-乙酰基香豆素。

將7-羥基-3-乙酰基香豆素、苯甲醛與催化量的哌啶(約1ml)溶于20ml無水乙醇，反應(yīng)液回流4h冷至室溫。由于此反應(yīng)在弱堿條件下轉(zhuǎn)化率低，故加入10當(dāng)量的苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)進(jìn)行的徹底，多余的苯甲醛用亞硫酸氫鈉水溶液洗去，再用乙酸將溶液調(diào)至中性，析出沉淀。抽濾，得粗產(chǎn)品，用無水乙醇重結(jié)晶得到α,β-不飽和化合物，可直接用于下一步反應(yīng)。

將上述α,β-不飽和化合物(2mmol)、苯肼(6mmol)溶于熱乙醇(50ml)中，滴加催化量的乙酸，回流反應(yīng)4h。反應(yīng)液冷至室溫后倒入2倍體積冰水中，析出深紅色固體。抽濾，所得粗產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶，或利用硅膠柱層析(乙酸乙酯/石油醚＝4:1)，得紅色粉末即為3-(1,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-3-基)-7-羥基-2h-色烯-2-酮。產(chǎn)率32％。

實(shí)施例2：hcp1與grp94直接相互作用

通過biacoret200進(jìn)行表面等離子體共振分析檢測hcp1與全長grp94蛋白的結(jié)合情況。將全長的grp94蛋白通過氨基偶聯(lián)的方法固定到cm5芯片表面。分別使用2.74μm,1.83μm,1.22μm,0.81μm和0.54μm的hcp1進(jìn)行注射。hcp1的進(jìn)樣時(shí)間為120s,流速10ul/min，解離時(shí)間600s。進(jìn)樣緩沖液為pbs(10mm磷酸鹽,137mmnacl,2.68mmkcl,0.1％二甲基亞砜[v/v],ph8.0)，溫度25℃。每次進(jìn)樣后使用10mmnaoh進(jìn)行芯片再生。結(jié)合響應(yīng)值為ru值，數(shù)據(jù)處理扣除空白對(duì)照，使用biacoret200評(píng)估軟件以1:1結(jié)合模擬分析。

結(jié)果表明：通過biacoret200所得的響應(yīng)值和hcp1成濃度對(duì)應(yīng)關(guān)系，hcp1和grp94相互作用的平衡解離常數(shù)為1.683μm，說明hcp1可以直接結(jié)合到grp94上(見圖1)。

實(shí)施例3：hcp1與grp94共定位

將a549細(xì)胞接種于直徑3.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中，37℃，co2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h之后，加入hcp1(10μm)處理3h，去除培養(yǎng)液，0.1mpbs緩沖液洗2次，加入1640原液，置于激光共聚焦顯微鏡下不同波長激發(fā)光(405nm，488nm，546nm，633nm和647nm)拍照。

將a549細(xì)胞接種于直徑3.5cm的玻璃皿底培養(yǎng)皿中，37℃，co2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h之后，加入hcp1(10μm)處理3h，去除培養(yǎng)液，0.1mpbs洗兩遍，4％多聚甲醛固定細(xì)胞15min。棄4％多聚甲醛，0.1mpbs緩沖液洗3次，每次5min；棄0.1mpbs緩沖液，加入正常血清封閉液，室溫封閉20min；棄封閉液，加入grp94一抗(用pbs做陰性對(duì)照)，一抗稀釋比為1：100，濕盒中4℃過夜(18h以上)；棄一抗，用0.1mpbs緩沖液洗3次，每次5min；棄0.1mpbs緩沖液，加入相應(yīng)alexafluor647熒光二抗，37℃反應(yīng)60min；棄二抗，用0.1mpbs緩沖液洗3次，每次5min；用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察、分析結(jié)果。

結(jié)果表明：(1)在405nm，488nm和546nm的激發(fā)波長下hcp1在細(xì)胞內(nèi)發(fā)射熒光。633nm和647nm波長激發(fā)時(shí)hcp1不發(fā)熒光。hcp1分布于a549細(xì)胞的胞質(zhì)中，在細(xì)胞核內(nèi)沒有分布。(2)hcp1和grp94在細(xì)胞內(nèi)共定位。說明hcp1特異性的靶向grp94(見圖2)。

實(shí)施例4：hcp1抑制grp94的功能

將a549細(xì)胞接種于直徑3.5cm的玻璃皿底培養(yǎng)皿中，37℃，co2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h之后，轉(zhuǎn)染grp94sirna或分別加入hcp1(10μm)或auy922(50nm)處理24h。去除培養(yǎng)液，0.1mpbs洗兩遍，100％冰甲醇-20℃固定細(xì)胞10min，去除hcp1熒光。棄甲醇，0.1mpbs緩沖液洗3次，每次5min；棄0.1mpbs緩沖液，加入正常血清封閉液，室溫封閉20min；棄封閉液，加入一抗(用pbs做陰性對(duì)照)，一抗稀釋比為1：100，濕盒中4℃過夜(18h以上)；棄一抗，用0.1mpbs緩沖液洗3次，每次5min；加入另一種一抗(用pbs做陰性對(duì)照)，一抗稀釋比為1：100，濕盒中4℃過夜(18h以上)；棄一抗，用0.1mpbs緩沖液洗3次，每次5min；棄0.1mpbs緩沖液，加入兩種相應(yīng)熒光二抗，37℃反應(yīng)60min；棄二抗，用0.1mpbs緩沖液洗3次，每次5min；用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察、分析結(jié)果。

將a549細(xì)胞接種于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，37℃，co2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h之后，轉(zhuǎn)染grp94sirna24h之后，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，4℃12000g離心15min，取上清，westernblot檢測grp94的干擾效率。

將a549細(xì)胞接種于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，37℃，co2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h之后，加入不同濃度的hcp1(1μm，5μm和10μm)處理細(xì)胞24h之后，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，4℃12000g離心15min，取上清，westernblot檢測hsp70的蛋白水平。

結(jié)果表明：(1)hcp1處理和grp94sirna可以降低tlr9和溶酶體的共定位。說明hcp1可以抑制tlr9由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)。(2)hcp1處理并不引起細(xì)胞內(nèi)hsp70蛋白水平的變化。說明hcp1抑制grp94的生物學(xué)功能，同時(shí)并不影響胞質(zhì)中hsp90的功能。這為hcp1作為grp94的抑制劑提供了很好的理論基礎(chǔ)(見圖3)。