專利名稱：利用基因工程技術(shù)培育托品烷類生物堿高產(chǎn)的顛茄及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生理學(xué)、育種學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，為一種利用基因工程技術(shù)培育托品烷類生物堿高產(chǎn)的顛茄的方法，具體涉及目的基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建、獲得托品烷類生物堿高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因顛茄的具體程序。本發(fā)明還提供利用基因工程獲得的托品烷類生物堿高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因顛茄及其培養(yǎng)的子代、再生植株、植物組織或種子。
背景技術(shù)：
顛茄(Atropa bellandonna)是民間傳統(tǒng)的藥用植物，為茄科顛茄屬植物，是產(chǎn)生托品烷類生物堿的資源植物。托品烷類生物堿的生物合成途徑已經(jīng)闡明，編碼限速酶的基因已經(jīng)克隆，其中氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶和莨菪堿-6-羥化酶是該途徑上最重要的限速酶。已經(jīng)有研究報(bào)道，在莨菪發(fā)根中過量表達(dá)來源與黑莨菪的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因，使得東莨菪堿的含量比原始材料提高了9倍。
本方面采用基因工程方法在顛茄過量表達(dá)來源于顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因，從而達(dá)到打破顛茄中托品烷類生物堿生物途徑上的限速反應(yīng)，最終培育出托品烷類生物堿高產(chǎn)的顛茄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種利用基因工程技術(shù)遺傳改良顛茄的方法，該方法將轉(zhuǎn)移顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)到顛茄中高效表達(dá)，從而提高顛茄中托品烷類生物堿的合成能力。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種植物表達(dá)載體，它包含上述顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是顛茄。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明分離出的兩條DNA分子一條是顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因的編碼區(qū)，用引物fabpmt5’-ccggatccATGGAGGTCAACCACAACAATG-3’和rabpmt5’-ccgagctcTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’可以從顛茄中擴(kuò)增出來；另一條是顛茄的莨菪堿-6-羥化酶基因的編碼區(qū)，用引物fabh6h5’-ccagatctATGGCTACTCTTGTCTCAAATTG-3’和rabh6h5’-cccacgtg TTAGGCATTAATTTTATATGGC-3’可以從顛茄中擴(kuò)增出來。
一種利用基因工程技術(shù)提高顛茄中托品烷類生物堿含量的方法，特征在于利用攜帶顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的植物表達(dá)載體，采用任何轉(zhuǎn)基因方法在顛茄細(xì)胞、組織、器官、植株中過量表達(dá)氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶和莨菪堿-6-羥化酶，從而提高顛茄中托品烷類生物堿生物合成能力。其步驟如下(1)采用基因克隆的方法獲得顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)；(2)把顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成植物表達(dá)載體；(3)獲得顛茄的無菌外植體；(4)采用任何轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)到顛茄細(xì)胞、組織、器官、植株中；(5)在特定的條件下篩選和鑒定顛茄轉(zhuǎn)化子；(6)在適合的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因的顛茄，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明涉及的植物表達(dá)載體包含顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的DNA。
用上述方法獲得的生命體，它是轉(zhuǎn)基因的顛茄的細(xì)胞、組織、器官、植株。其特征為導(dǎo)入了在CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)，其氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶和莨菪堿-6-羥化酶表達(dá)水平得到大大提高，托品烷類生物堿合成能力得到大大提高，托品烷類生物堿含量液得到大大提高。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。在本發(fā)明中，術(shù)語“生命體”指顛茄的細(xì)胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，術(shù)語“托品烷類生物堿”包括莨菪堿和東莨菪堿。
在本發(fā)明中，術(shù)語“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、如PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，術(shù)語“在特定的條件下篩選和鑒定顛茄轉(zhuǎn)化子”是指用在離體培養(yǎng)的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的顛茄的轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定顛茄的轉(zhuǎn)化子。
在本發(fā)明中，術(shù)語“在適合的條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因的顛茄，獲得轉(zhuǎn)基因后代”是指對經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化子離體培養(yǎng)，并檢測氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因的表達(dá)水平，篩選托品烷類生物堿高產(chǎn)的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因后代。
在本發(fā)明中，我們從顛茄中克隆氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因的編碼區(qū)，并構(gòu)建了植物高效反義表達(dá)載體，并遺傳轉(zhuǎn)化顛茄，打破顛茄中托品烷類生物堿生物合成途徑中的限速反應(yīng)，推動(dòng)代謝流往目標(biāo)產(chǎn)物方向流動(dòng)，提高顛茄中托品烷類生物堿的合成能力，從而提高顛茄中托品烷類生物堿的產(chǎn)量，然后篩選獲得托品烷類生物堿高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因顛茄進(jìn)行培養(yǎng)，并獲得轉(zhuǎn)基因后代。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如《分子克隆》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的克隆根據(jù)顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(GenBank登錄號AB018570)和莨菪堿-6-羥化酶基因(GenBank登錄號AB017153)的全長序列，并根據(jù)植物雙元載體pCAMBIA1304和pBI121的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)攜帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的基因特異性引物分別擴(kuò)增目的基因的編碼區(qū)，用于構(gòu)建植物表達(dá)載體。
克隆顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)的引物為fabpmt5’-ccggatccATGGAGGTCAACCACAACAATG-3’(作為上游引物，攜帶Bam HI酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；rabpmt5’-ccgagctcTCAAAACTCAACCAAATCCCTC-3’(作為下游引物，攜帶SacI酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)。
克隆顛茄莨菪堿-6-羥化酶基因的引物為fabh6h5’-ccagatctATGGCTACTCTTGTCTCAAATTG-3’(作為上游引物，攜帶Bgl II酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)；rabh6h5’-cccacgtg TTAGGCATTAATTTTATATGGC-3’(作為下游引物，攜帶Pml I酶切位點(diǎn)和5’末端的兩個(gè)保護(hù)堿基cc)。
從顛茄葉片中提總RNA(上海華舜生物工程有限公司的RNA提取試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa RNA PCR Kit)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50ul，包含去離子水，10×PCR buffer 5ul，dNTP 1ul，MgCl23ul，引物各1ul，cDNA摸板1ul，Taq酶0.5ul。PCR條件為94℃3分鐘，隨之以94℃45秒、58℃45秒、和72℃2分鐘進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸8分鐘。1％瓊脂糖電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增目的基因。
電泳分離后，回收(賽百勝PCR產(chǎn)物回收試劑盒)PCR產(chǎn)物，取適量回收產(chǎn)物與PMD18-T easy Vector載體連接(TaKaRa PMD 18-T Vector試劑盒)后轉(zhuǎn)入DH5α，LB+氨芐青霉素(100mg/l)固體培養(yǎng)基上抗性篩選陽性克隆，PCR鑒定后送測序(賽百勝公司完成)。
實(shí)施例2構(gòu)建攜帶顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的植物表達(dá)載體選用pBI121和pCAMBIA1304為基本元件，構(gòu)建雙元三價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+(p1304+)。構(gòu)建流程如下1)Hind III和EcoR I雙酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121表達(dá)盒，回收pCAMBIA1304大片段；連接這兩個(gè)回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α，在卡那霉素LB平板上篩選得到單克隆，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，HindIII和EcoRI雙酶切驗(yàn)證；即構(gòu)建好p1304+。
將經(jīng)過測序正確后的攜帶目的基因的DH5α(已經(jīng)轉(zhuǎn)入顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)或莨菪堿6-羥化酶基因編碼區(qū))分別搖菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，分別提取質(zhì)粒；用Bam HI及sac I雙酶切攜帶顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)的PMD 18-T easy Vector載體，1％瓊脂糖電泳后回收小片段；1％瓊脂糖電泳后回收小片段。
將構(gòu)建好p1304+用Bam HI及sac I雙酶切后回收大片斷，并與從PMD 18-T easyVector載體上用Bam HI及sac I雙酶切切下的顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB+Kan(100mg/l)固體培養(yǎng)基上篩選抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得攜帶顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)的重組質(zhì)粒并命名為p1304+-abpmt。
將構(gòu)建好p1304+-abpmt用Bgl II及Pml I雙酶切后回收大片斷，并與從PMD 18-Teasy Vector載體上用Bgl II及Pml I雙酶切切下的顛茄菪莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB+Kan(100mg/l)固體培養(yǎng)基上篩選抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得攜帶顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因編碼區(qū)和菪莨菪堿-6-羥化酶基因編碼區(qū)的的重組質(zhì)粒并命名為p1304+-abpmt-abh6h。該質(zhì)?？梢詫?dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或者EHA105，獲得工程菌，命名為LBA4404-abpmt-abh6h或EHA105--abpmt-abh6h，可用于對顛茄的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3顛茄無菌外植體的獲得方法一利用外植體建立顛茄無菌外植體采取顛茄幼芽和幼莖，流水沖洗1小時(shí)；然后用2％(M/V)NaClO溶液浸泡10分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡15分鐘，用無菌水沖洗6次；然后接種在添加無菌叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加植物生長調(diào)節(jié)物1.25mg/L BA(芐基腺嘌呤)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)顛茄的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為55μmol.m-2.s-1。40天后，即可獲得無菌的顛茄無菌外植體，等到葉片長到3cm×3cm大小時(shí)可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
方法二利用顛茄種子在無菌條件下萌發(fā)獲得無菌外植體采取顛茄成熟的種子，用2％(M/V)NaClO溶液浸泡20分鐘，用無菌水沖洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡30分鐘，用無菌水沖洗6次；在無菌條件下去除其種皮；將顛茄胚接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基盛于150ml的三角瓶中，于121℃滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基，添加30g/L蔗糖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5.8，再添加5％瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)顛茄的幼芽，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。待種子萌動(dòng)后，改變培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為25μmol.m-2.s-1。等到葉片長到3cm×3cm大小時(shí)可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例4根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化顛茄獲得轉(zhuǎn)基因顛茄1、根癌農(nóng)桿菌LBA4404-abpmt-abh6h、EHA105-abpmt-abh6h。使用前自冰箱取出，接種于50ml YEB液體培養(yǎng)(添加卡那霉素達(dá)到終濃度為100mg/L)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)兩次；2、第二次活化OD600達(dá)0.3時(shí)，加100μmol/mL乙酰丁香酮，繼續(xù)28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，OD600達(dá)0.6時(shí)，室溫下4000rpm離心10分鐘；3、棄上清，菌體用MS液體培養(yǎng)基(100μmol/mL乙酰丁香酮)懸浮，稀釋到原體積的5倍，在28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，使菌液濃度達(dá)到的OD600＝0.3左右；稱轉(zhuǎn)化液；可用于顛茄的遺傳轉(zhuǎn)化；1、2、3個(gè)步驟稱為活化根癌農(nóng)桿菌；4、取無菌顛茄頂芽、側(cè)芽、莖等植物不同部位，將莖切成1cm小段，或?qū)⑷~片切成2cm2左右，用無菌的解剖刀劃以“+”字形傷口，放入上述轉(zhuǎn)化液中，侵染10分鐘后取出，用無菌衛(wèi)生紙吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2天，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)。
5、共培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至添加1.25mg/L BA的MS固體培養(yǎng)基(添加250mg/L頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的；添加50mg/L潮霉素作為篩選壓獲得轉(zhuǎn)基因顛茄叢生芽)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為55μmol.m-2.s-1。40天后，獲得新生的顛茄叢生芽。
6、待從顛茄轉(zhuǎn)化外植體上誘導(dǎo)出的叢生芽長到1cm左右是，分別切下單個(gè)的叢生芽，接種在無植物生長調(diào)節(jié)物的MS固體培養(yǎng)基上(添加250mg/L頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的；添加50m/L潮霉素作為篩選壓獲得轉(zhuǎn)基因顛茄叢生芽)繼代培養(yǎng)；在該培養(yǎng)基上生長正常的顛茄叢生芽即為轉(zhuǎn)基因顛茄。以后每25天繼代培養(yǎng)一次，繼代5次后，農(nóng)桿菌可以去除干凈。然后僅在添加0.25mg/L NAA的MS固體培養(yǎng)基上生根即可。轉(zhuǎn)基因顛茄煉苗1周后，即可移栽。
實(shí)施例5
轉(zhuǎn)基因顛茄的分子檢測1、顛茄基因組DNA的提取，方法如下1)取少量顛茄，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer。
2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其間經(jīng)常顛倒混勻；3)12000rpm，室溫離心10分鐘；4)取上清液，加500ul飽和酚[Tris-HCl(pH8.0)飽和，吸取下層]，輕輕混勻，4℃靜置5分鐘至分層；5)12000rpm，室溫離心10min；6)吸上清(約250微升)，加2倍體積的無水乙醇(-20℃儲(chǔ)存)，充分混勻，室溫靜置至DNA析出；7)8000rpm，4℃離心5分鐘；8)用75％的乙醇洗2次，稍離心，吸凈殘余乙醇，室溫放置，使乙醇揮發(fā)完全。
9)加50ul TE(100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH 8.0)，溶解DNA。37℃水浴1小時(shí)。
10)加40ul氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕混勻，靜置5分鐘至分層。
11)12000rpm，室溫離心10分鐘。
12)吸取上清(約35ul)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR檢測。
抽提緩沖液配方如下100mM Tris-HCl(pH8.0)2.5％(v/v) 巰基乙醇500mM NaCl20mM EDTA1.5％(w/v) SDS2、轉(zhuǎn)基因顛茄的PCR檢測，方法如下由于所用的目的基因莨菪氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和菪莨菪堿-6-羥化酶基因都源于顛茄自身，不可能用PCR直接檢測。由于這兩個(gè)基因在p1304+上是和潮霉素抗性基因在同一個(gè)邊界內(nèi)，因而可以在轉(zhuǎn)基因顛茄中DNA中檢測潮霉素抗性基因以確認(rèn)轉(zhuǎn)化子。潮霉素抗性基因(812bp)的檢測使用引物fhygr(5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’)和rhygr(5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG’-3)。PCR程序?yàn)?4℃變性5min→30個(gè)循環(huán)(94℃ 50sec→58℃ 50sec→72℃ 1min)→72℃ 6min。
陽性對照為p1304+-abpmt-abh6h作為模板擴(kuò)增，陰性對照為顛茄的天然葉片DNA作為模板擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測。
實(shí)施例6野生型顛茄和轉(zhuǎn)基因顛茄中莨菪堿和東莨菪堿的含量比較莨菪堿和東莨菪堿含量測定參照Hashimoto等人建立的方法(1993年)。結(jié)果為莨菪堿在野生型顛茄主根、葉和莖中的含量分別為8.1mg/g(干重)、1.4mg/g(干重)、0.3mg/g(干重)；莨菪堿在轉(zhuǎn)基因顛茄主根、葉和莖中的含量分別為14.2mg/g(干重)、3.6mg/g(干重)、1.2mg/g(干重)；東莨菪堿在野生型顛茄主根、葉和莖中的含量分別為0.6mg/g(干重)、0.2mg/g(干重)、0.03mg/g(干重)；東莨菪堿在轉(zhuǎn)基因顛茄主根、葉和莖中的含量分別為4.6mg/g(干重)、3.8mg/g(干重)、0.4mg/g(干重)。
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括具有編碼顛茄氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因核苷酸序列的編碼區(qū)。
2.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括具有編碼顛茄莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸序列的編碼區(qū)。
3.一種利用基因工程技術(shù)提高顛茄中托品烷類生物堿含量的方法，特征在于構(gòu)建攜帶權(quán)利要求1和2中的DNA分子的植物高效表達(dá)載體，采用轉(zhuǎn)基因方法在顛茄細(xì)胞、組織、器官、植株中過量表達(dá)權(quán)利1和2中的DNA分子，其步驟如下(1)采用基因克隆方法獲得來源于顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)；(2)把來源于顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)連于表達(dá)調(diào)控序列，形成高效植物表達(dá)載體；(3)獲得顛茄無菌外植體；(4)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移來源于顛茄的氮甲基腐氨轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和莨菪堿-6-羥化酶基因核苷酸的編碼區(qū)到顛茄細(xì)胞、組織、器官、植株中；(5)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子；(6)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得轉(zhuǎn)基因后代；(7)轉(zhuǎn)基因顛茄中托品烷類生物堿的檢測。
4.一種DNA分子，其特征是用權(quán)利要求3所述方法獲得的植物表達(dá)載體。
5.用權(quán)利要求3所述方法獲得的生命體，其特征在于它是可生產(chǎn)托品烷類生物堿的轉(zhuǎn)基因顛茄，其基因組中整合了來至于權(quán)利要求3中質(zhì)粒的T-DNA。
6.用權(quán)利要求5所述方法獲得的顛茄后代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用基因工程技術(shù)培育托品烷類生物堿高產(chǎn)的顛茄的方法。其過程是用高保真RT－PCR分離目的基因，構(gòu)建攜帶目的基因的雙元三價(jià)植物高效表達(dá)載體，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把目的基因?qū)腩嵡迅咝П磉_(dá)；在特定的篩選和誘導(dǎo)條件下獲得轉(zhuǎn)基因的顛茄；并對轉(zhuǎn)基因顛茄進(jìn)行分子檢測和化學(xué)檢測，最終獲得托品烷類生物堿含量大大提高的轉(zhuǎn)基因顛茄。本發(fā)明不但提供了一種利用基因工程技術(shù)培育托品烷類生物堿高產(chǎn)的顛茄的新方法，而且可以為包括莨菪堿和東莨菪堿在內(nèi)的托品烷類生物堿的生產(chǎn)提供一種新型優(yōu)質(zhì)藥源。
文檔編號C12N15/82GK1884545SQ20051005714
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者廖志華, 陳敏, 楊春賢, 蘭小中, 孫敏, 付玉凡, 張啟堂 申請人:西南師范大學(xué)