本發(fā)明涉及一種大豆分離蛋白復(fù)合材料，尤其涉及一種大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合微凝膠珠的制備；本發(fā)明還涉及該大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠作為藥物載體的應(yīng)用；屬于復(fù)合材料、食用天然高分子材料及藥用高分子材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在醫(yī)用高分子載體材料中，新型藥物載體材料占據(jù)著非常重要的地位。在藥物的使用過程中，選擇合適的載體材料將大幅度提高藥物的有效性。理想的藥物載體應(yīng)具有很好的藥物控釋性能，并且具有好的生物相容性、生物降解性、理化及生物穩(wěn)定性和極低的細胞毒性。近年來，已經(jīng)開發(fā)了不同種類的藥物載體材料。為了提高生物相容性，以天然高分子為原料，制備可用于藥物控釋載體的高分子水凝膠也受到了關(guān)注。

海藻酸鈉是一種可食但不易被消化的大分子多糖，它在胃腸中具有吸水性、吸附性、陽離子交換和凝膠過濾等作用，能對人體新陳代謝起到獨特的調(diào)節(jié)效果。海藻酸鈉可用于制備球狀、膜狀形態(tài)的藥物載體，藥物釋放時，海藻酸鈉的ph值依賴性將顯示出一定的缺陷，因此要對海藻酸鈉進行改性，以減少蛋白水解酶對藥物的破壞。cn201510298838.8公開了一種角蛋白-海藻酸鈉復(fù)合微孔凝膠，利用該復(fù)合微孔凝膠的酸敏性，實現(xiàn)藥物分子的可控釋放；cn201510299512.7提供了一種羽毛角蛋白-海藻酸鈉復(fù)合高分子雙敏感水凝膠的制備，利用其酸敏性實現(xiàn)藥物分子的可控釋放。大豆分離蛋白作為藥物載體可保持藥物分子的活性，對藥物有很好的控釋性能。cn201510364897.0提供了一種大豆蛋白基雙敏感性高分子微孔凝膠，該高分子微孔凝膠對模型藥物尤其是小分子模型藥物具有較好的緩釋效果，因此可作為藥物載體。然而，以上凝膠的制備是以有機合成試劑為助劑，制備過程相對復(fù)雜。因此，開發(fā)易操作、廉價且無任何毒副作用的天然高分子載體材料是發(fā)展方向。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有良好的藥物控釋性能的多重敏感的大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的制備方法。

一、大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的制備

將大豆分離蛋白分散到堿溶液中得大豆分離蛋白分散液；向其中加入海藻酸鈉水溶液，室溫下攪拌混合均勻后，慢速滴注到氯化鈣的醇溶液中，靜置20~80min；再加入交聯(lián)劑的水溶液反應(yīng)10~50min得到復(fù)合凝膠珠；傾出溶劑分離凝膠珠，并用水洗滌至洗出液為中性，吸干游離水分，得到粒徑均勻的含水凝膠珠；干燥后得到大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠。

堿溶液為0.1~1.5mol/l的naoh溶液或koh溶液。堿溶液為反應(yīng)提供堿性條件，以使大豆分離蛋白均勻分散。

大豆分離蛋白分散液中，大豆分離蛋白的含量為0.01~0.05g/ml。

海藻酸鈉水溶液的濃度為0.01~0.1g/ml。大豆分離蛋白與海藻酸鈉的質(zhì)量比為1:0.5~1:2。

滴注大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液時，使用2~10ml注射器，針頭型號為7#，控制滴注速度在1~10滴/s。

氯化鈣的醇溶液為氯化鈣的乙醇或甲醇溶液，其中氯化鈣濃度為0.1~0.7mol/l。將大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液慢速滴注到氯化鈣的醇溶液，醇的最終體積分數(shù)不高于50%。氯化鈣的醇溶液作為海藻酸鈉的交聯(lián)劑；通過使用醇的水溶液調(diào)控主要成分的溶解度與分散度。

交聯(lián)劑為六偏磷酸鈉或1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，其水溶液的濃度為1~10mmol/l。交聯(lián)劑用量為大豆分離蛋白、海藻酸鈉總質(zhì)量的0.1~0.25倍。

二、大豆分離蛋白復(fù)合海藻酸鈉凝膠珠的形貌與結(jié)構(gòu)表征

1、宏觀形貌：新鮮制備的大豆分離蛋白復(fù)合海藻酸鈉含水凝膠珠的外觀形貌如圖1所示：粒徑分布均勻，粒徑在2~3mm。而且粒徑的大小可通過控制原料（大豆分離蛋白、海藻酸鈉、交聯(lián)劑等）的濃度與制備工藝（針頭、速度等）進行調(diào)控。

2、微觀形貌

采用掃描電鏡觀測了大豆分離蛋白復(fù)合海藻酸鈉凝膠珠的微觀形貌（圖2）?？梢悦黠@看出：大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面有較多孔洞。這與其原料大豆分離蛋白（大小不均一、形狀不規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)）、海藻酸鈉（塊狀結(jié)構(gòu)，表面有部分褶皺）完全不同，說明兩種高分子鏈有效復(fù)合，這種多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更有利于藥物的負載。

3、紅外光譜分析

大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的紅外吸收光譜如圖3所示。其中，在1652cm^-1，1546cm^-1和1242cm^-1附近出現(xiàn)了大豆分離蛋白酰胺i、酰胺ii、酰胺iii帶的特征吸收峰，表明蛋白質(zhì)材料的構(gòu)象。在3423cm^-1、1647cm^-1、1539cm^-1和1089cm^-1處出現(xiàn)了-nh2、酰胺i、酰胺ii和酰胺iii帶的特征吸收峰，1070cm^-1，1255cm^-1分別為六偏磷酸鈉的特征吸收峰，表明成功制得了大豆分離蛋白復(fù)合海藻酸鈉凝膠珠。

4、x-射線衍射分析

圖4為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的x-射線衍射光譜。從圖4可以看出，在2θ為32.3^o、45.9^o和58.2^o處出現(xiàn)了海藻酸鈉的部分衍射峰，且強度變?nèi)酢．敶蠖狗蛛x蛋白復(fù)合海藻酸鈉得到凝膠珠后其較強衍射峰變?nèi)跎踔料?。由此說明大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的形態(tài)發(fā)生了變化，這是由于二者之間發(fā)生了強烈的氫鍵作用，說明大豆分離蛋白和海藻酸鈉成功復(fù)合。

三、大豆分離蛋白復(fù)合海藻酸鈉凝膠珠的性能測試

1、不同溶液中的溶脹行為測試

大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠在三種模擬生物液（水、生理鹽水和葡萄糖溶液）中的溶脹度，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠在水中的溶脹度最大，在生理鹽水中的溶脹度最小，并且相比海藻酸鈉的溶脹度有明顯提高。

2、ph響應(yīng)性測試

測試了不同ph值時大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠溶脹度的差異，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，凝膠珠的溶脹度隨著ph值的升高而增大，ph值大于7后溶脹度又減??；當ph=7時溶脹度最大，說明大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠具有明顯的ph響應(yīng)型。

3、離子強度敏感性測試

在不同濃度鹽溶液中，測試了大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的離子強度敏感性，結(jié)果如圖7所示。發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的溶脹率隨著鹽濃度的增大而逐漸減小，并且溶脹度的變化比較明顯，說明該凝膠珠具有離子強度敏感性。

4、載藥量和包封率測試

大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠對藥物分子（5-氟尿嘧啶）的載藥量和包封率進行測試結(jié)果表明：大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠相比海藻酸鈉凝膠珠，其載藥量和包封率都有較大提高，分別達到了20.9%和7.9%。

5、藥物釋放性能測試。

測試了大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠分別在ph=1.2和ph=7.4的緩沖溶液中對藥物（5-氟尿嘧啶）的釋放性能。如圖8所示，對于5-氟尿嘧啶，在ph=1.2和ph=7.4緩沖溶液中，達到平衡時累積釋放率分別為61.2%和84%。說明對藥物的累積釋放率，在堿性介質(zhì)中比在酸性介質(zhì)中大，而且大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠比海藻酸鈉凝膠珠的累積釋放率大。

綜上所述，本發(fā)明以大豆分離蛋白和海藻酸鈉為原料，通過無毒且生物相容的交聯(lián)劑得到的復(fù)合凝膠珠，具有良好的溶脹性、響應(yīng)性和離子強度敏感性以及可生物降解性。載藥性能測試表明，相對海藻酸鈉凝膠珠，復(fù)合大豆分離蛋白后的凝膠珠對藥物分子的載藥量和包封率都有較大的提高，溶脹性能更好。藥物釋放性能測試表明，復(fù)合大豆分離蛋白后的凝膠珠對藥物的累積釋放率明顯大于海藻酸鈉凝膠珠。因此可作為高分子藥物載體應(yīng)用于醫(yī)用領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的宏觀形貌。

圖2為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的掃描電鏡圖

圖3為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的紅外圖譜。

圖4為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的x-射線衍射圖譜。

圖5為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的溶脹性測試曲線圖。

圖6為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的ph響應(yīng)性測試曲線圖。

圖7為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的鹽敏感性測試曲線圖。。

圖8為大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠的藥物釋放曲線圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明大豆分離蛋白復(fù)合海藻酸鈉凝膠珠的制備及其藥物釋放性能做進一步說明。

實施例1

（1）取一定量大豆分離蛋白，分散到1.5mol/l的naoh溶液中，得到含量為0.01g/ml的大豆分離蛋白分散液。

（2）取10ml大豆分離蛋白分散液（含大豆分離蛋白0.1g），向其中加入5ml海藻酸鈉水溶液（濃度為0.01g/ml，含海藻酸鈉0.05g），室溫下攪拌混合均勻，得大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液。

（3）將大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液慢速滴注到50ml氯化鈣的甲醇溶液（濃度0.1mol/l）中，靜置80min；再加入20ml六偏磷酸鈉的水溶液（濃度1mmol/l，含六偏磷酸鈉0.0184g），常溫下交聯(lián)反應(yīng)50min后傾出溶劑，分離出凝膠珠，并用蒸餾水洗滌至洗出液為中性，吸干游離水分，得到粒徑較為均勻的含水大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠；干燥后得到大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠。

該復(fù)合凝膠珠對藥物分子（5-氟尿嘧啶）的載藥量和包封率分別為15%和3.6%。在ph=7.4緩沖溶液中，累積釋放率可達78%。

實施例2

（1）取一定量大豆分離蛋白，分散到濃度1.5mol/l的koh溶液中，得到含量為0.05g/ml的大豆分離蛋白分散液。

（2）取10ml大豆分離蛋白分散液（含大豆分離蛋白0.5g），向其中加入5ml海藻酸鈉水溶液（濃度為0.1g/ml，含海藻酸鈉0.5g），室溫下攪拌混合均勻，得大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液。

（3）將大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液慢速滴注到25ml氯化鈣的甲醇溶液（濃度0.7mol/l）中，靜置20min；再加入15ml六偏磷酸鈉的水溶液（濃度10mmol/l，含0.0918g六偏磷酸鈉），常溫下交聯(lián)反應(yīng)10min后傾出溶劑，分離出凝膠珠，并用蒸餾水洗滌至洗出液為中性，吸干游離水分，得到粒徑較為均勻的含水大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠；干燥后得到大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠。

該復(fù)合凝膠珠對藥物分子（5-氟尿嘧啶）的載藥量和包封率分別為20%和4.8%。在ph=7.4緩沖溶液中，累積釋放率可達80%。

實施例3

（1）取一定量大豆分離蛋白，分散到濃度1.0mol/l的naoh溶液中，得到含量為0.1g/ml的大豆分離蛋白分散液。

（2）取10ml大豆分離蛋白分散液（含大豆分離蛋白1g），向其中加入40ml海藻酸鈉水溶液（濃度為0.05g/ml，含海藻酸鈉2g），室溫下攪拌混合均勻，得大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液。

（3）將大豆分離蛋白/海藻酸鈉混合液慢速滴注到40ml氯化鈣的甲醇溶液（濃度0.4mol/l）中，靜置50min；再加入30ml含1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的水溶液（濃度5mmol/l，含交聯(lián)劑0.0288g），常溫下交聯(lián)反應(yīng)30min后傾出溶劑，分離出凝膠珠，并用蒸餾水洗滌至洗出液為中性，吸干游離水分，得到粒徑較為均勻的含水大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠；干燥后得到大豆分離蛋白-海藻酸鈉復(fù)合凝膠珠。

該復(fù)合凝膠珠對藥物分子（5-氟尿嘧啶）的載藥量和包封率分別為18%和4.3%。在ph=7.4緩沖溶液中，累積釋放率可達83%。