（一）技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生化行業(yè)領(lǐng)域，特別涉及一種硫酸乙酰肝素的制備方法。
（二）
背景技術(shù)：
硫酸乙酰肝素是一種天然的糖胺聚糖，與肝素鈉結(jié)構(gòu)類似，但是硫酸乙酰肝素分子量較小，乙酰化程度高，硫酸基含量較少，抗凝活性緩和。硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者腎臟保護(hù)，是今年來研究最熱的粘多糖類生化藥物。
傳統(tǒng)工藝從肝素鈉精品副產(chǎn)物中提取，肝素鈉精品副產(chǎn)物的主要成分是硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素、肝素鈉。因?yàn)檫@幾種物質(zhì)性質(zhì)相似，采用傳統(tǒng)的離子交換層析和有機(jī)溶劑分級沉淀方法難以將硫酸乙酰肝素純化。
（三）
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種硫酸乙酰肝素的制備方法。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種硫酸乙酰肝素的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：
（1）溶解:將原料肝素鈉副產(chǎn)物加入純化水溶解成10-15%（w/w)的溶液；
（2）酶解：溶解液保持溫度35-40℃，加入硫酸皮膚素酶、硫酸軟骨素酶、肝素酶，攪拌反應(yīng)3-4小時(shí)；
(3)沉淀：酶解液加入1.1-1.3倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置8小時(shí)，收集硫酸乙酰肝素粗品沉淀物；
(4）氧化:將硫酸乙酰肝素粗品沉淀物加入純化水溶解成10-15%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph至9.5-11.5，溫度25-45℃，向溶液中加入0.1-0.3體積倍量過氧化氫，氧化12-16小時(shí)；
(5)過濾:將氧化后的液體調(diào)ph至5.0-6.5，通過微孔濾膜過濾；
(6)醇沉:將上述步驟（5）所得濾液中加入1.1-1.3倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置沉淀4小時(shí)；
(7)溶解過濾:將上清液抽去，沉淀加入純化水溶解成15-20%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph5.0-6.5，用微孔濾膜過濾，收集濾液；
(8)干燥:將步驟（7）所得濾液加入凍干盤內(nèi)、干燥，即可得到硫酸乙酰肝素。
上述硫酸皮膚素酶的添加量為0.2-0.4g/kg肝素鈉副產(chǎn)物。
上述硫酸軟骨素酶的添加量為0.2-0.4g/kg肝素鈉副產(chǎn)物。
上述肝素酶的添加量為0.1-0.2g/kg肝素鈉副產(chǎn)物。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用對肝素鈉副產(chǎn)物進(jìn)行酶解、沉淀，得到硫酸乙酰肝素粗品。然后進(jìn)行氧化、干燥獲得硫酸乙酰肝素?？朔肆蛩嵋阴８嗡睾土蛩崞つw素、硫酸軟骨素、肝素鈉難以分離的難題，提高了硫酸乙酰肝素的收率和純度；并且本方法操作簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合規(guī)?；a(chǎn)。
（四）具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
一種硫酸乙酰肝素的制備方法，采用如下步驟：
(1)溶解:肝素鈉副產(chǎn)物1.2kg加入純化水12kg溶解成10%（w/w)的溶液。
（2）酶解：溶解液保持溫度35-40℃，加入硫酸皮膚素酶0.26g、硫酸軟骨素酶0.26g、肝素酶0.12g，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。
(3)沉淀：酶解液加入1.2倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置8小時(shí)，收集硫酸乙酰肝素粗品沉淀物。
(4）氧化:沉淀加入純化水溶解成10%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph至9.8，溫度25-45℃，向溶液中加入0.2體積倍量過氧化氫，氧化14小時(shí)；
(5)過濾:調(diào)ph至5.5，微孔濾膜過濾；
(6)醇沉:濾液中加入1.2倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置沉淀4小時(shí)；
(7)溶解過濾:將上清液抽去，沉淀加入純化水溶解成16%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph5.5，用微孔濾膜過濾，收集濾液；
(8)干燥:將濾液加入凍干盤內(nèi)、干燥，即可得到硫酸乙酰肝素。
實(shí)施例2：
一種硫酸乙酰肝素的制備方法，采用如下步驟：
(1)溶解:肝素鈉副產(chǎn)物1.4kg加入純化水12kg溶解成11.7%（w/w)的溶液；
（2）酶解：溶解液保持溫度35-40℃，加入硫酸皮膚素酶0.32g、硫酸軟骨素酶0.30g、肝素酶0.18g，攪拌反應(yīng)3小時(shí)；
(3)沉淀：酶解液加入1.2倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置8小時(shí)，收集硫酸乙酰肝素粗品沉淀物；
(4）氧化:沉淀加入純化水溶解成10%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph至9.8，溫度25-45℃，向溶液中加入0.22體積倍量過氧化氫，氧化15小時(shí)；
(5)過濾:調(diào)ph至5.5，微孔濾膜過濾；
(6)醇沉:濾液中加入1.3倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置沉淀4小時(shí)；
(7)溶解過濾:將上清液抽去，沉淀加入純化水溶解成15%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph5.5，用微孔濾膜過濾，收集濾液；
(8)干燥:將濾液加入凍干盤內(nèi)、干燥，即可得到硫酸乙酰肝素。
實(shí)施例3：
一種硫酸乙酰肝素的制備方法，采用如下步驟：
(1)溶解:肝素鈉副產(chǎn)物2.0kg加入純化水20kg溶解成10%（w/w)的溶液；
（2）酶解：溶解液保持溫度35-40℃，加入硫酸皮膚素酶0.45g、硫酸軟骨素酶0.48g、肝素酶0.21g，攪拌反應(yīng)4小時(shí)；
(3)沉淀：酶解液加入1.2倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置8小時(shí)，收集硫酸乙酰肝素粗品沉淀物；
(4）氧化:沉淀加入純化水溶解成15%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph至9.8，溫度25-45℃，向溶液中加入0.24體積倍量過氧化氫，氧化15小時(shí)；
(5)過濾:調(diào)ph至5.8，微孔濾膜過濾；
(6)醇沉:濾液中加入1.2倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置沉淀4小時(shí)；
(7)溶解過濾:將上清液抽去，沉淀加入純化水溶解成15%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph5.8，用微孔濾膜過濾，收集濾液；
(8)干燥:將濾液加入凍干盤內(nèi)、干燥，即可得到硫酸乙酰肝素。
實(shí)施例4：
一種硫酸乙酰肝素的制備方法，采用如下步驟：
(1)溶解:肝素鈉副產(chǎn)物1.2kg加入純化水8kg溶解成15%（w/w)的溶液。
（2）酶解：溶解液保持溫度35-40℃，加入硫酸皮膚素酶0.26g、硫酸軟骨素酶0.26g、肝素酶0.12g，攪拌反應(yīng)3小時(shí)。
(3)沉淀：酶解液加入1.2倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置8小時(shí)，收集硫酸乙酰肝素粗品沉淀物。
(4）氧化:沉淀加入純化水溶解成10%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph至9.5，溫度25-45℃，向溶液中加入0.1體積倍量過氧化氫，氧化14小時(shí)；
(5)過濾:調(diào)ph至5.0，微孔濾膜過濾；
(6)醇沉:濾液中加入1.2倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置沉淀4小時(shí)；
(7)溶解過濾:將上清液抽去，沉淀加入純化水溶解成16%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph5.0，用微孔濾膜過濾，收集濾液；
(8)干燥:將濾液加入凍干盤內(nèi)、干燥，即可得到硫酸乙酰肝素。
實(shí)施例5：
一種硫酸乙酰肝素的制備方法，采用如下步驟：
(1)溶解:肝素鈉副產(chǎn)物1.2kg加入純化水8kg溶解成15%（w/w)的溶液。
（2）酶解：溶解液保持溫度35-40℃，加入硫酸皮膚素酶0.26g、硫酸軟骨素酶0.26g、肝素酶0.12g，攪拌反應(yīng)4小時(shí)。
(3)沉淀：酶解液加入1.1倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置8小時(shí)，收集硫酸乙酰肝素粗品沉淀物。
(4）氧化:沉淀加入純化水溶解成15%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph至11.5，溫度25-45℃，向溶液中加入0.3體積倍量過氧化氫，氧化12小時(shí)；
(5)過濾:調(diào)ph至6.5，微孔濾膜過濾；
(6)醇沉:濾液中加入1.3倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置沉淀4小時(shí)；
(7)溶解過濾:將上清液抽去，沉淀加入純化水溶解成20%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph6.5，用微孔濾膜過濾，收集濾液；
(8)干燥:將濾液加入凍干盤內(nèi)、干燥，即可得到硫酸乙酰肝素。
實(shí)施例6：
一種硫酸乙酰肝素的制備方法，采用如下步驟：
(1)溶解:肝素鈉副產(chǎn)物1.2kg加入純化水8kg溶解成15%（w/w)的溶液。
（2）酶解：溶解液保持溫度35-40℃，加入硫酸皮膚素酶0.26g、硫酸軟骨素酶0.26g、肝素酶0.12g，攪拌反應(yīng)4小時(shí)。
(3)沉淀：酶解液加入1.3倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置8小時(shí)，收集硫酸乙酰肝素粗品沉淀物。
(4）氧化:沉淀加入純化水溶解成10%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph至11.5，溫度25-45℃，向溶液中加入0.3體積倍量過氧化氫，氧化16小時(shí)；
(5)過濾:調(diào)ph至6.0，微孔濾膜過濾；
(6)醇沉:濾液中加入1.3倍乙醇，攪拌30分鐘后靜置沉淀4小時(shí)；
(7)溶解過濾:將上清液抽去，沉淀加入純化水溶解成15%（w/w)的溶液，調(diào)節(jié)ph6.0，用微孔濾膜過濾，收集濾液；
(8)干燥:將濾液加入凍干盤內(nèi)、干燥，即可得到硫酸乙酰肝素。
本發(fā)明通過上述實(shí)施案例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不僅限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)的工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所述技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。