本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種呼吸道常見病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

急性呼吸道感染是我國(guó)臨床多發(fā)性常見病，可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡。常見感染病原體包括病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體等，所引起疾病和疫情的病原學(xué)復(fù)雜，因此快速準(zhǔn)確多指標(biāo)的病原體檢測(cè)將為疾病的診治提供充足的依據(jù)，并為疫情的控制提供基礎(chǔ)。

目前，常用的呼吸道病原檢測(cè)技術(shù)包括病原體抗原檢測(cè)和核酸檢測(cè)兩個(gè)方面。酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)和免疫試紙條等方法是目前主要的基于蛋白的檢測(cè)方法，該類方法使用方便、快速，但缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，并且隨著抗原蛋白的變異，容易出現(xiàn)假陰性；同時(shí)抗原檢測(cè)易受到多種因素的影響，造成假陽(yáng)性。而基于核酸的檢測(cè)方法是目前最普遍、最準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)方法主要包括pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)和基于分子雜交的基因芯片技術(shù)。目前仍以pcr技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其常用的技術(shù)方法包括普通定性pcr、巢式pcr、多重pcr、熒光定量pcr等方法。普通定性pcr方法檢測(cè)效率低，尤其檢測(cè)多基因?qū)ο髸r(shí)更加費(fèi)時(shí)費(fèi)力；巢式pcr雖然提高了檢測(cè)的靈敏度，但同樣存在檢測(cè)效率的問(wèn)題；熒光定量pcr方法靈敏度高，但其成本高，并且需要特殊檢測(cè)儀器，同時(shí)單管的檢測(cè)指標(biāo)數(shù)也很有限。多重pcr方法可以在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可以實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增與檢測(cè)，其技術(shù)難點(diǎn)是要避免pcr過(guò)程中多條引物間的交聯(lián)反應(yīng)，并且各擴(kuò)增子的最佳反應(yīng)條件要一致，目前常規(guī)設(shè)計(jì)的多重pcr檢測(cè)能力大概是10個(gè)指標(biāo)左右，更優(yōu)的多重引物設(shè)計(jì)方案會(huì)顯著提高方法的多指標(biāo)檢測(cè)能力?；蛐酒悄壳胺浅?shí)用的病原體檢測(cè)技術(shù)，它可以和多重pcr技術(shù)配合使用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病原體的多重?cái)U(kuò)增和多指標(biāo)檢測(cè)，該技術(shù)對(duì)多重引物和探針的靈敏度和特異性要求很高，合理的引物和探針設(shè)置是關(guān)鍵。

目前呼吸道病原體檢測(cè)需要解決如下幾方面的問(wèn)題：一是病原體種類多樣，已發(fā)現(xiàn)的常見病原體有二十幾種，其中半數(shù)以上是rna病毒，同時(shí)還包括多種dna病毒、支原體、衣原體和細(xì)菌。復(fù)雜的病原學(xué)要求檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多達(dá)20個(gè)指標(biāo)以上的平行檢測(cè)，并且具有同時(shí)檢測(cè)核酸rna和核酸dna的能力。二是絕大多數(shù)呼吸道病原體具有快速進(jìn)化的特點(diǎn)，同一類病原體對(duì)應(yīng)的是一大組不同的變異基因，并且有能力在短時(shí)間內(nèi)突變出新的變異基因。這種特點(diǎn)給臨床檢測(cè)帶來(lái)了非常大的挑戰(zhàn)，要求檢測(cè)技術(shù)對(duì)一大組變異基因具有很好的覆蓋度，并且具有容忍基因變異的能力。三是呼吸道疾病是臨床多發(fā)性常見病，發(fā)病快，并且有集中爆發(fā)的特點(diǎn)，這要求檢測(cè)技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)可以同時(shí)處理多個(gè)臨床樣本，具備快速檢測(cè)和高通量檢測(cè)的能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過(guò)使用多重特異性保守簡(jiǎn)并引物組合和探針組合解決常規(guī)引物和探針對(duì)高突變病原體檢測(cè)覆蓋率低的問(wèn)題，解決多達(dá)20種以上呼吸道病原體單反應(yīng)體系平行檢測(cè)的問(wèn)題，同時(shí)解決多重引物和探針之間非特異性交叉反應(yīng)的問(wèn)題，克服現(xiàn)有技術(shù)單反應(yīng)體系檢測(cè)指標(biāo)較少，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺陷，提供一種操作簡(jiǎn)單，快速靈敏，檢測(cè)通量大的呼吸道病原體基因檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明呼吸道常見病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測(cè)試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)以下病原體中的一種或多種：流感病毒a型、流感病毒b型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人類偏肺病毒、鼻病毒a型、鼻病毒b型、鼻病毒c型、博卡病毒、腺病毒、冠狀病毒229e、冠狀病毒hku-1、冠狀病毒nl63、冠狀病毒oc43、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)桿菌和肺炎鏈球菌；

試劑盒內(nèi)設(shè)有呼吸道病原體的引物組合和探針組合，同時(shí)設(shè)有人gapdh基因內(nèi)源對(duì)照以及陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的呼吸道常見病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測(cè)試劑盒由引物組合、探針組合、基因芯片、輔料和配液構(gòu)成。

本發(fā)明特征在于引物組合為一組或多組多重特異性保守區(qū)簡(jiǎn)并引物(multiplexspecificconserveddegenerateprimer，其中簡(jiǎn)并位點(diǎn)的核苷酸表示為r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝c/g，w＝a/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)，各對(duì)引物的堿基序列5’-3’如下，其中反向引物5’端帶cy5熒光基團(tuán)標(biāo)志：

流感病毒a型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gctttyacngadgarggagcaa，

反向引物：cy5-5’-aysycaaytgcatttttgacatcct；

流感病毒b型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gccaattcgagcagctgaaactg，

反向引物：cy5-5’-tccgtracyagtctaattgtctcyctc；

副流感病毒1型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：tcaaacttaatcactcaaggatgtgyagat，

反向引物：cy5-5’-agaaaytrccggktttaratcaggatacat；

副流感病毒2型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：acaatgtaatrcttggagattgyctygat，

反向引物：cy5-5’-gcttttscgattgattccatcacttagg；

副流感病毒3型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：tggcataatgtgytatcaagaccagg，

反向引物：cy5-5’-tcyartatracagatgayacaatgctycct；

副流感病毒4型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：wgctcttagratcattgaagttgatgca，

反向引物：cy5-5’-gcwargctrataggcaaatcyctgg；

人類偏肺病毒，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：ygargtmaatgcractgtrgca，

反向引物：cy5-5’-gcygarctyacaaaytttgayacca；

鼻病毒a型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gccggaggabtcaargygag，

反向引物：cy5-5’-tagacctggcagatgaggct；

鼻病毒b型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：cyccactagtytggtcgatgaggct，

反向引物：cy5-5’-ntcacaaycaagcacatgcrrgtctt；

鼻病毒c型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：cacyggygacrgtgrygtagc，

反向引物：cy5-5’-ccatcccryaattrctcrttacgac；

博卡病毒，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：actgctactgagattgcagctc，

反向引物：cy5-5’-gcagtatccgttttcgtgaagtgta；

腺病毒，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：agacacctacttcagtmtkgggaa，

反向引物：cy5-5’-ggcacraagcgcagcrtcag；

冠狀病毒229e，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：aacgtttcagaactagaaagggca，

反向引物：cy5-5’-tgtaggytcagttttagcaccatcaa；

冠狀病毒hku-1，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：cctggtacgattytgcctcaagg，

反向引物：cy5-5’-acgaktattgggtccacgtgat；

冠狀病毒nl63，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gccaaaggttttccacagyttgc，

反向引物：cy5-5’-ctgctcaatgaacttaggaaggttctt；

冠狀病毒oc43，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：cattgtcgatcgggacccaa，

反向引物：cy5-5’-trctggatgtgcgcgaagta；

呼吸道合胞病毒a型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gcaaatayaccatccaacggagc，

反向引物：cy5-5’-yccagtgaatttrtgattrgcatcttctg；

呼吸道合胞病毒b型，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gggcaaatacaaaratggctcttagc，

反向引物：cy5-5’-tgyttttgyacatcataattgggagtgtc；

肺炎支原體，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：ggcccatactcctacgggag，

反向引物：cy5-5’-gcgactgctggcacatagtt；

肺炎衣原體，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：tgtaaagcactttcgcctgggaa，

反向引物：cy5-5’-caccctccgtattaccgcagct；

嗜肺軍團(tuán)桿菌，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gataagttgtcttatagcattggtgccga，

反向引物：cy5-5’-ctttcatttgytgytcggttaaagcca；

肺炎鏈球菌，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：gctggaagaaaatcgctgabaagtg，

反向引物：cy5-5’-ggtttgaggtagtaccarcctgtt；

內(nèi)源對(duì)照gapdh基因，反向引物5’端帶cy5標(biāo)志：

正向引物：atcttccaggagcgagatcc，

反向引物：cy5-5’-agggggcagagatgatgac；

并且，探針組合為順序固定于基因芯片表面的一條或多條核酸探針，包括呼吸道病原體特異性保守簡(jiǎn)并探針、gapdh內(nèi)源對(duì)照探針，陽(yáng)性雜交點(diǎn)探針和陰性雜交點(diǎn)探針，其中簡(jiǎn)并位點(diǎn)的核苷酸表示為r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝c/g，w＝a/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)，各探針的5’端做氨基標(biāo)志(nh2)，各條探針的堿基序列5’-3’如下：

流感病毒a型探針：

nh2-5’-gadgarggagcaathgtdggmgaaatytcaccattrccttctyttccaggacatactdd；

流感病毒b型探針：

nh2-5’-ctgaaactgcgrtgggagtcytatcccaatttggtcaagagcaccgattatcaccagaa；

副流感病毒1型探針：

nh2-5’-yagatatagggaagtcrtaycaggttttacaattaggttayatatcyttaaattcagat；

副流感病毒2型探針：

nh2-5’-crrcatctraycagtatttakcaatggggataatacaacaatctgctgcrgvrtttcca；

副流感病毒3型探針：

nh2-5’-caaygaatgtccatggggacaytcatgyccrgatggrtgyataacrggagtrtatachg；

副流感病毒4型探針：

nh2-5’-ccrcmrgattatacattaacyattaayccaagrtctggctgggatgayatcaagatcag；

人類偏肺病毒探針：

nh2-5’-tygaygartayagyaaaytdgahtttgayaarytnacrgtytgygadgtwaaaacagtt；

鼻病毒a型探針：

nh2-5’-drrrgtgygcaggcagccacgcaggctrgaacactgtyrccagtggggddyttcyagcc；

鼻病毒b型探針：

nh2-5’-yyagcctgcgtggcggccarcccagcdyhtgctgggacgcchwttyahdgacatggtgy；

鼻病毒c型探針：

nh2-5’-aagrchbkmrtgygctavnhrtgabtcctccggcccctgaatgcggctaatcytaamcc；

博卡病毒探針：

nh2-5’-acractgtactctgacaggatttaaacaaaaatggaatttagataaaattccaaacyca；

腺病毒探針：

nh2-5’-aartttagraaccccacrgtggcgccyacccacgatgtgaccaccgaycgyagccagcg；

冠狀病毒229e探針：

nh2-5’-grgtggatttgycacccaagytryatttttattatcttggcacaggaccycataaagmt；

冠狀病毒hku-1探針：

nh2-5’-ctattatgttgaaggctcaggaaggtctgcttctaatagycgrccaggttcacgttctc；

冠狀病毒nl63探針：

nh2-5’-arttgattccyaatcaggctgcdttattctttgatagtgaggttagcactgawgaagtg；

冠狀病毒oc43探針：

nh2-5’-tagygatgaggctattycgactaggtttccgcctggyacggtactccctcagggttact；

呼吸道合胞病毒a型探針：

nh2-5’-ayactcctaaytaygatgtrcagaaacacatyaayaakytatgtggcatgttattaatc；

呼吸道合胞病毒b型探針：

nh2-5’-aggatcagctgctgtcatycagcaaatayrcyattcaacgtagyacaggagataatatt；

肺炎支原體探針：

nh2-5’-gcagcagtagggaatttttcacaatgagcgaaagcttgatggagcaatgccgcgtgaac；

肺炎衣原體探針：

nh2-5’-taatatccaatygatttgagcgtaccrggtaaagaagcaccggctaactccgtgccagc；

嗜肺軍團(tuán)桿菌探針：

nh2-5’-ttgggraagaaytttaaraatcaaggcatwgatgttaryccggaagcawtggctaaagg；

肺炎鏈球菌探針：

nh2-5’-tactatttyraygwagaaggtgccatgaagacaggctgggtcaagtacaaggacachtg；

內(nèi)源對(duì)照gapdh基因探針：

nh2-5’-tccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtctt；

陽(yáng)性雜交點(diǎn)探針：

nh2-5’-ccctcgggttaatgcgcgattgtcaccacacgttgcgagttatgttgctgcggagatgg；

陰性雜交點(diǎn)探針：

nh2-5’-gatcgtcgttgggctttagatttctcttataggctcggtcggcgcctctcgccccgagc；

本發(fā)明中所述基因芯片為表面固定有探針陣列的固相支持介質(zhì)，所述固相支持介質(zhì)為玻璃片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。

本發(fā)明中所述呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒由引物組合、探針組合、基因芯片、輔料和配液組成，輔料為一步法逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑(onesteprt-pcrreagent)、超純水(ultrapurewater)和5’端帶cy5標(biāo)志的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈dna，5’端帶cy5標(biāo)志的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈dna的堿基順序?yàn)閏y5-5′-ccatctccgcagcaacataactcgcaacgtgtggtgacaatcgcgcattaacccgaggg-3’。

本發(fā)明中所述呼吸道常見病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測(cè)試劑盒由引物組合、探針組合、基因芯片、輔料和配液組成，配液為芯片點(diǎn)樣液、芯片清洗液、雜交液、清洗液i和清洗液ii。

上述方案中，所述芯片點(diǎn)樣液為50％dmso；芯片清洗液為5xssc(20xssc：3mnacl，0.3mna3citrate·2h2o，ph7.0)，0.2％sds；雜交液為5xssc，0.1％sds；清洗液i為0.5xssc，0.1％sds；清洗液ii為0.05xssc。

本發(fā)明設(shè)計(jì)采用經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的多重特異性保守簡(jiǎn)并引物(multiplexspecificconserveddegenerateprimer)進(jìn)行目標(biāo)序列擴(kuò)增。呼吸道病原體種類多樣，已發(fā)現(xiàn)的常見病原體有二十幾種，并且大多數(shù)是高度易突變的病原體，如流感病毒、鼻病毒和冠狀病毒等，序列變異大，進(jìn)化迅速，即使同一類病原體內(nèi)部也存在多種不同變異株。針對(duì)呼吸道病原體種類多，變異快的特征，本發(fā)明在多重引物設(shè)計(jì)中解決兩方面技術(shù)問(wèn)題：一是設(shè)計(jì)特異性保守簡(jiǎn)并引物，保證引物在不同類病原體間的特異性，尤其是在不同亞型病原體間的特異性，同時(shí)設(shè)計(jì)保證引物在同一類病原體不同變異株間的保守性和檢測(cè)覆蓋度，引物采用特異性保守簡(jiǎn)并引物，即可以涵蓋同一類病原體的多種變異類型，對(duì)目標(biāo)基因的位點(diǎn)突變具有很強(qiáng)適應(yīng)性，同時(shí)又可以有效地避免非特異性擴(kuò)增，尤其適合檢測(cè)高突變多亞型的病原體。二是設(shè)計(jì)解決多達(dá)20種以上病原體單反應(yīng)體系多重?cái)U(kuò)增的問(wèn)題，通過(guò)引物間的相互匹配設(shè)計(jì)，避免引物間的相互交聯(lián)。

本發(fā)明采用基于多重特異性保守簡(jiǎn)并引物的一步法逆轉(zhuǎn)錄多重rt-pcr(one-stepreversetranscriptionpolymerasechainreaction)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)呼吸道病原體。多重rt-pcr方法是將多對(duì)引物放到同一個(gè)反應(yīng)管中，并在同一體系中依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和pcr擴(kuò)增反應(yīng)，達(dá)到單管反應(yīng)體系同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)rna/dna序列的目的。

本發(fā)明采用一組特異性保守簡(jiǎn)并探針檢測(cè)多重rt-pcr產(chǎn)物中的目標(biāo)序列。簡(jiǎn)并探針采用長(zhǎng)探針設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度為59個(gè)核苷酸，相對(duì)于短探針，長(zhǎng)探針與目標(biāo)基因的結(jié)合更牢固，檢測(cè)靈敏度更高。特異性保守簡(jiǎn)并探針5’端帶氨基(nh2)修飾，方便探針與基因芯片的結(jié)合。

本發(fā)明采用基因芯片方面進(jìn)行呼吸道病原體的分子雜交檢測(cè)，基因芯片技術(shù)基于核酸分子雜交原理。其工作過(guò)程是首先將針對(duì)各個(gè)呼吸道病原體的單鏈探針按順序排列固定于固相支持介質(zhì)表面的特定區(qū)域，形成低密度探針陣列，再將待測(cè)的多重rt-pcr產(chǎn)物與其雜交，這樣產(chǎn)物中的目標(biāo)基因序列就會(huì)和支持介質(zhì)上的探針雜交，目標(biāo)序列產(chǎn)物dna上帶有熒光基團(tuán)標(biāo)志，結(jié)合了待測(cè)dna的探針點(diǎn)就偶聯(lián)上了標(biāo)志物，在經(jīng)過(guò)相應(yīng)洗滌和熒光掃描等步驟就能讀取對(duì)應(yīng)的雜交信號(hào)，這樣一張芯片上就可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)呼吸道病原體目標(biāo)序列。

本發(fā)明的有益效果是：

1)提供呼吸道病原體多重pcr引物和檢測(cè)探針組合，解決多達(dá)20種以上病原體單反應(yīng)體系多重?cái)U(kuò)增和檢測(cè)的問(wèn)題；2)檢測(cè)探針和引物采用特異性保守簡(jiǎn)并寡核苷酸設(shè)計(jì)，提高了對(duì)目標(biāo)序列的檢測(cè)覆蓋度，尤其適合具有高突變特點(diǎn)的呼吸道病原體檢測(cè)；3)設(shè)計(jì)避免了多重體系中不同引物之間的非特異性交叉反應(yīng)；4)設(shè)計(jì)避免了引物與樣本中潛在的非目標(biāo)序列間的非特異性擴(kuò)增；5)設(shè)計(jì)避免探針與非目標(biāo)序列產(chǎn)物dna的非特異性雜交；6)操作簡(jiǎn)單，經(jīng)過(guò)一次樣本前處理，單管rt-pcr擴(kuò)增，單芯片雜交就可以同步檢測(cè)樣本中多種呼吸道病原體，具有平行分析和多重判斷的特點(diǎn)；7)檢驗(yàn)對(duì)象完備，包含了22種常見的呼吸道病原體，并且可以很方便的加入新的檢測(cè)序列；8)試劑盒采用了基因芯片的檢測(cè)方式，提高了系統(tǒng)的多指標(biāo)平行檢測(cè)能力；9)試劑盒操作簡(jiǎn)單，便捷，適用于呼吸道病原體的大規(guī)模檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1-3為本發(fā)明用于檢測(cè)呼吸道病原體樣本基因芯片雜交結(jié)果，其中：

圖1為芯片探針?lè)植寄Ｊ綀D；

圖2為22份呼吸道樣本檢測(cè)結(jié)果圖；

圖3為23份陽(yáng)性對(duì)照(22種病原體標(biāo)準(zhǔn)核酸分子和1種gapdh內(nèi)源對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)核酸分子)和1份陰性對(duì)照(h2o)檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

呼吸道常見病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測(cè)試劑盒，該試劑盒用于檢測(cè)以下病原體中的一種或多種：流感病毒a型、流感病毒b型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人類偏肺病毒、鼻病毒a型、鼻病毒b型、鼻病毒c型、博卡病毒、腺病毒、冠狀病毒229e、冠狀病毒hku-1、冠狀病毒nl63、冠狀病毒oc43、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)桿菌和肺炎鏈球菌共22種呼吸道病原體的引物組合和探針組合；同時(shí)設(shè)有人gapdh基因內(nèi)源對(duì)照以及陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。除引物和探針組合外，試劑盒中還包含基因芯片、輔料和配液。

實(shí)施例一：呼吸道常見病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測(cè)試劑盒。

1)多重特異性保守簡(jiǎn)并引物和探針的設(shè)計(jì)與制備：

從核酸數(shù)據(jù)庫(kù)下載各病原體的核酸序列，進(jìn)行多序列比對(duì)(ncbidatabase，clustalw)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果生成一條簡(jiǎn)并序列(python程序)；剔除序列中的高變異區(qū)(python程序)，并經(jīng)引物設(shè)計(jì)過(guò)程生成多對(duì)候選引物(primer3，python程序)，序列比對(duì)分析候選引物特異性，以避免與樣品中其他核酸發(fā)生交叉反應(yīng)(blast+)；之后評(píng)估不同目標(biāo)基因引物間兼容性，評(píng)估內(nèi)容包括tm值相似性、引物二聚體傾向和3’末端雜交傾向(python程序)，最終生成多重簡(jiǎn)并引物組合；再根據(jù)引物擴(kuò)增區(qū)域，使用相應(yīng)程序設(shè)計(jì)特異性保守簡(jiǎn)并探針(python程序)，再通過(guò)序列比對(duì)分析探針的特異性以避免與樣品中其他核酸發(fā)生交叉反應(yīng)(blast+)。內(nèi)源對(duì)照gapdh采用相同的設(shè)計(jì)方法。陽(yáng)性對(duì)照探針和陰性對(duì)照探針為隨機(jī)生成的59個(gè)核苷酸的寡核苷酸，并且通過(guò)序列比對(duì)避免與待檢病原體序列發(fā)生非特異性交聯(lián)。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照探針生成陽(yáng)性寡核苷酸單鏈dna，其序列為陽(yáng)性對(duì)照探針的反向互補(bǔ)序列。采用固相亞磷酰胺三酯法合成得到上述引物和探針組合以及相應(yīng)的對(duì)照序列。最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證探針和引物的性能。

2)制備基因芯片：

采用微定量噴點(diǎn)式基因芯片點(diǎn)樣儀，將各個(gè)核苷酸探針(探針用芯片點(diǎn)樣液溶解，濃度10μmol/l)分布在光學(xué)級(jí)氨基芯片上的特定位置區(qū)域。芯片置于80℃烘2小時(shí)以固定探針，固定后芯片在清洗液中清洗5分鐘，后無(wú)水乙醇洗滌，離心甩干，處理好的芯片室溫保存。芯片表面包被的探針陣列布局如圖1。

3)制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)核酸分子：

使用基因合成的方法制備各病原體和內(nèi)對(duì)照的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)核酸分子，合成區(qū)包括pcr擴(kuò)增區(qū)及上下游各150個(gè)核苷酸的區(qū)域。合成序列插入到pet-30a質(zhì)粒載體，之后經(jīng)過(guò)質(zhì)粒提取、純化和定量，并稀釋成10⁵copies/μl，用來(lái)作為多重pcr擴(kuò)增和基因芯片檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)核酸分子。

4)準(zhǔn)備pcr反應(yīng)預(yù)混液：使用superrtonesteprt-pcrkit(cwbio)，體系中含有逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、rna酶抑制劑、dntp等成分。每管反應(yīng)需準(zhǔn)備15μl反應(yīng)預(yù)混液，預(yù)混液包含：2×rt-pcr反應(yīng)緩沖液(12.5μl)、酶混合液(0.5μl)、引物混合液(2μl)，其中引物混合液中含有各病原體的擴(kuò)增引物，其中每條cy5標(biāo)志的引物濃度為3.75μmol/l，每條非標(biāo)志引物的濃度為2.5μmol/l。

5)提取樣本核酸：采集待檢臨床樣本，樣本類型可以為鼻咽拭子樣本、痰液、肺灌洗液等呼吸道樣本。之后采用適當(dāng)?shù)暮怂崽崛〖夹g(shù)(如病毒基因組dna/rna提取試劑盒viraldna/rnakit，cwbio)從樣本中抽提核酸。

6)多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)：采用25μl擴(kuò)增體系，組成為：pcr反應(yīng)預(yù)混液(15μl)，樣本提取核酸(5μl)，超純水(5μl)。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)核酸分子)和陰性對(duì)照(無(wú)菌水)，并以相同的體系對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行混合操作。隨后將各反應(yīng)管按照如下程序進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增：45℃保持30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄)；95℃保持2分鐘(熱啟動(dòng))；之后進(jìn)入35個(gè)熱循環(huán)過(guò)程，94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持30秒；最后72℃保持5分鐘。

7)基因芯片雜交檢測(cè)：將芯片微陣列面朝上放入雜交設(shè)備中，在點(diǎn)陣位置加上配制好的雜交液(使用前配制，500～1000μl雜交液(5xssc，0.1％sds)中加入20μl多重pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)加入1μl濃度為2μmol/l陽(yáng)性寡核苷酸單鏈dna)，小心蓋上雜交盒上蓋，50℃雜交1小時(shí)；取出芯片，將芯片放入42℃清洗液i(0.5xssc，0.1％sds)中清洗2分鐘，之后將芯片再放入42℃清洗液ii(0.05xssc)中清洗2分鐘，離心甩干；用合適的熒光掃描儀掃描芯片(如博奧luxscan10k掃描儀)，之后根據(jù)雜交點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)行結(jié)果判讀。

實(shí)施例二：呼吸道病原體陽(yáng)性樣本檢測(cè)。

使用帶有如下病原體的呼吸道陽(yáng)性樣本，樣本類型為咽拭子采樣或肺灌洗液：流感病毒a型、流感病毒b型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人類偏肺病毒、鼻病毒a型、鼻病毒b型、鼻病毒c型、博卡病毒、腺病毒、冠狀病毒229e、冠狀病毒hku-1、冠狀病毒nl63、冠狀病毒oc43、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)桿菌和肺炎鏈球菌，共22份陽(yáng)性樣本。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(22種病原體標(biāo)準(zhǔn)核酸分子和1種gapdh內(nèi)源對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)核酸分子)和陰性對(duì)照(無(wú)菌水)，并以相同的過(guò)程實(shí)施檢測(cè)。引物和探針組合、輔料、配液以及對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的獲取見實(shí)施例一。

利用核酸提取試劑盒(病毒基因組dna/rna提取試劑盒viraldna/rnakit，cwbio)從樣本中抽提核酸，核酸最后溶于50μl核酸洗脫液。吸取5ul核酸樣本，用于多重pcr擴(kuò)增。采用25μl擴(kuò)增體系，組成為：pcr反應(yīng)預(yù)混液(15μl)，樣本提取核酸(5μl)，超純水(5μl)。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)核酸分子)和陰性對(duì)照(無(wú)菌水)，并以相同的體系對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行混合操作。隨后將各反應(yīng)管按照如下程序進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增：45℃保持30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄)；95℃保持2分鐘(熱啟動(dòng))；之后進(jìn)入35個(gè)熱循環(huán)過(guò)程，94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持30秒；最后72℃保持5分鐘。

使用基因芯片方法檢測(cè)多重pcr產(chǎn)物，具體過(guò)程同實(shí)施例一，之后根據(jù)雜交點(diǎn)的顯色情況進(jìn)行結(jié)果判讀。結(jié)果22份樣本中可分別檢測(cè)到22中呼吸道病原體的存在，同時(shí)23份陽(yáng)性對(duì)照(22種病原體標(biāo)準(zhǔn)核酸分子和1種gapdh內(nèi)源對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)核酸分子)和1份陰性對(duì)照(無(wú)菌水)雜交點(diǎn)顯色正確。檢測(cè)結(jié)果如圖2和圖3。