本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮?01410495099.7的母案的分案申請(qǐng)，該母案的申請(qǐng)日為2014年9月25日，發(fā)明名稱為“一種腫瘤細(xì)胞廣譜高活性啟動(dòng)子及其用途”。

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤細(xì)胞廣譜高活性啟動(dòng)子及其用途。所述啟動(dòng)子為人工合成的嵌合啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中具有廣譜的高活性。本發(fā)明還涉及含有該啟動(dòng)子的重組載體、重組病毒、以及所述啟動(dòng)子控制治療基因用于基因治療的用途。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是rna聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段dna序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活化rna聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。

根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類：組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。

哺乳動(dòng)物中常用的組成型啟動(dòng)子包括病毒來源：鼠或人巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子(分別簡(jiǎn)稱mcmv與hcmv)、猴空泡病毒sv40啟動(dòng)子；人基因組天然來源：ef1α啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子(ubiquitin，簡(jiǎn)稱ubi)、β-actin啟動(dòng)子、pgk-1啟動(dòng)子、rosa26啟動(dòng)子、hsp70啟動(dòng)子、gapdh啟動(dòng)子、eif4a1啟動(dòng)子、egr1啟動(dòng)子、ferh啟動(dòng)子、sm22α啟動(dòng)子、endothelin-1啟動(dòng)子等。

哺乳動(dòng)物常用組織特異性啟動(dòng)子有：b29啟動(dòng)子(b細(xì)胞特異性)、cd14啟動(dòng)子(單個(gè)核細(xì)胞特異性)、cd43啟動(dòng)子(淋巴細(xì)胞及血小板特異性)、cd45及inf-β啟動(dòng)子(造血細(xì)胞特異性)、cd68啟動(dòng)子(巨噬細(xì)胞特異性)、desmin及myoglobin啟動(dòng)子(肌肉細(xì)胞特異性)、cd105及cd102啟動(dòng)子(內(nèi)皮細(xì)胞特異性)、gfap啟動(dòng)子(星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性)、gpiib啟動(dòng)子(巨核細(xì)胞特異性)、surfactantproteinb啟動(dòng)子(肺特異性)、nse啟動(dòng)子(成熟神經(jīng)元細(xì)胞特異性)、alb啟動(dòng)子(肝特異性)等。

常用腫瘤特異性啟動(dòng)子有：afp啟動(dòng)子(肝癌特異性)、cckar啟動(dòng)子(胰腺癌特異性)、psa啟動(dòng)子(前列腺癌特異性)、tyr啟動(dòng)子(黑色素瘤特異性)、htert啟動(dòng)子/cea啟動(dòng)子/survivin啟動(dòng)子/cxcr4啟動(dòng)子/cox-2/l-plastin啟動(dòng)子/epididymisprotein4啟動(dòng)子/e2f1啟動(dòng)子(腫瘤廣譜特異性)等。

常用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有：基于四環(huán)素(tet)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(包括tet-on或tet-off)、脫皮激素類誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、fk506調(diào)控系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、納巴霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、ru486誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。

在腫瘤基因治療中，維持外源基因的高效穩(wěn)定表達(dá)非常重要。然而，一些病毒來源的組成型啟動(dòng)子盡管瞬時(shí)表達(dá)活性較高(如cmv啟動(dòng)子)，但容易因表觀遺傳修飾而被關(guān)閉表達(dá)；而一些人源天然組成型啟動(dòng)子或腫瘤特異性啟動(dòng)子雖然表達(dá)穩(wěn)定，但表達(dá)活性相對(duì)較弱，難以滿足基因治療需求。因而，研究人員又設(shè)計(jì)構(gòu)建了一系列人工嵌合啟動(dòng)子，它們包含了一些順式調(diào)控元件，主要包括能發(fā)揮穩(wěn)定表達(dá)作用的啟動(dòng)子核心序列，以及能增強(qiáng)表達(dá)效率的上游增強(qiáng)子或下游內(nèi)含子，代表者是嵌合啟動(dòng)子cag(包含人cmv增強(qiáng)子-雞β-actin啟動(dòng)子-兔β-globin內(nèi)含子)，廣泛應(yīng)用于外源基因的表達(dá)。

尚需要開發(fā)適合在腫瘤細(xì)胞內(nèi)廣譜高效表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子，其在一系列腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)活性高于cag啟動(dòng)子，且序列穩(wěn)定(不會(huì)在原核細(xì)胞及真核細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生序列丟失)，并能夠適用于驅(qū)動(dòng)外源基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗(yàn)和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，設(shè)計(jì)構(gòu)建了一系列新型嵌合啟動(dòng)子，并從中篩選獲得一個(gè)能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)廣譜高效表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子序列穩(wěn)定，不會(huì)隨著其在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移而發(fā)生序列丟失現(xiàn)象，并且能夠穩(wěn)定地表達(dá)驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)。由此提供了下述發(fā)明：

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種分離的多核苷酸，其包含如下元件：

hcmv增強(qiáng)子、β-actin啟動(dòng)子和mcmv增強(qiáng)子；

具體地，其還包含ubi增強(qiáng)子；更具體地，ubi增強(qiáng)子位于上述3種元件的下游；

具體地，上述4種元件各自獨(dú)立地為1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或3個(gè)以上；

具體地，所述多核苷酸具有啟動(dòng)子功能。

根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其依次包含：

hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子+mcmv增強(qiáng)子，或者

mcmv增強(qiáng)子+hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子；

優(yōu)選地，其依次包含：

hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子+mcmv增強(qiáng)子+ubi增強(qiáng)子，或者

mcmv增強(qiáng)子+hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子+ubi增強(qiáng)子。

根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中：

hcmv增強(qiáng)子的核苷酸序列如seqidno：17所示；

β-actin啟動(dòng)子的核苷酸序列如seqidno：18所示；

mcmv增強(qiáng)子的核苷酸序列如seqidno：19或seqidno：20所示；優(yōu)選為seqidno：20；

ubi增強(qiáng)子的核苷酸序列如seqidno：21所示。

根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其各個(gè)元件之間有或沒有連接序列或者剪接位點(diǎn)；具體地，在mcmv增強(qiáng)子和/或hcmv增強(qiáng)子和/或ubi增強(qiáng)子的上游和下游分別有剪接供體和剪接受體；更具體地，所述剪接供體的核苷酸序列如seqidno：22所示；所述剪接受體的核苷酸序列如seqidno：23所示。

剪接供體(splicedonor，sd)：aaaacaggtaagtcc(seqidno：22)

剪接受體(spliceacceptor，sa)：gcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag(seqidno：23)

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，不拘于理論的限制，啟動(dòng)子后面的增強(qiáng)子序列兩端含有剪切位點(diǎn)，保證在轉(zhuǎn)錄后，位于啟動(dòng)子下游的增強(qiáng)子序列能被準(zhǔn)確剪切掉，不影響目的蛋白的翻譯；其余元件直接連接。

本發(fā)明的另一方面涉及一種分離的多核苷酸，其包含或者為選自如下的a－e中任意一組的多核苷酸：

a.seqidno：1－seqidno：4中任一序列所示的多核苷酸；

b.與seqidno：1－seqidno：4中任一序列互補(bǔ)的多核苷酸；

c.在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的多核苷酸雜交并具有啟動(dòng)子功能的多核苷酸；

d.對(duì)上述a或b所示多核苷酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾并具有啟動(dòng)子功能的多核苷酸；和

e.與上述a或b所示多核苷酸具有至少90％同一性并具有啟動(dòng)子功能的多核苷酸；

具體地，a或b中的多核苷酸具有啟動(dòng)子功能。

本發(fā)明的上述多核苷酸為啟動(dòng)子；具體地，是嵌合啟動(dòng)子。

seqidno：1-seqidno：4的具體序列如下：

cac啟動(dòng)子(含hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子+mcmv增強(qiáng)子)：

ggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccctgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttcgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag(seqidno：1)

cacu啟動(dòng)子(含hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子+mcmv增強(qiáng)子-ubi增強(qiáng)子)：

ggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccctgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttcggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag(seqidno：2)

ccau啟動(dòng)子(含mcmv增強(qiáng)子+hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子+ubi增強(qiáng)子)：

actgagtcattagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttcggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag(seqidno：3)

4cau啟動(dòng)子(含mcmv增強(qiáng)子+hcmv增強(qiáng)子+mcmv增強(qiáng)子+hcmv增強(qiáng)子+β-actin啟動(dòng)子+ubi增強(qiáng)子)：

ctgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttcggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccactgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttcggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag(seqidno：4)

典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約tm－5℃(低于探針tm5℃)；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在tm以下約5－10℃；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針tm以下約10－20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在tm以下約20－25℃。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6×ssc＝極低嚴(yán)緊性；3×ssc＝低至中等嚴(yán)緊性；1×ssc＝中等嚴(yán)緊性；0.5×ssc＝高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。

對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。sambrook等(sambrook,j.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，coldspringharborpress,plainview,n.y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。

為便于說明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括：用5×ssc、0.5％sds、1.0mmedta(ph8.0)溶液預(yù)洗；在50-65℃下在5×ssc中雜交過夜；隨后用含0.1％sds的2×、0.5×和0.2×ssc在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60－65℃或65－70℃。

在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其具有與seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

在本發(fā)明中，所述對(duì)seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2－45個(gè)，或者不超過2－30個(gè)，或者不超過3－20個(gè)，或者不超過4－15個(gè)，或者不超過5－10個(gè)，或者不超過6－8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。

在本發(fā)明中，所述對(duì)seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與seqidno：1-seqidno：4的參考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在seqidno：1-seqidno：4的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5％的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5％。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。

在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如blast和blast2.0算法，它們分別描述在altschul等(1977)nucl.acid.res.25：3389-3402和altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，blast和blast2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行blast分析的軟件可以通過國(guó)立生物技術(shù)信息中心(ncbi)為公眾所獲得。

在本發(fā)明中，所述與seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括與seqidno：1-seqidno：4所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的blast分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、優(yōu)選至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在本發(fā)明中，所述與seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有與seqidno：1-seqidno：4所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

本發(fā)明的再一方面涉及一種核酸構(gòu)建體，包含本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，以及可操作地連接的外源基因；具體地，所述外源基因選自p53、gm-csf、il-2、il-12、il-24、trail、p16、tk、ifnγ、tnfα、rb、sirpα等中的任意一種或多種；具體地，所述外源基因?yàn)閟eqidno：12所示p53和/或seqidno：4所示gm-csf。

本發(fā)明的再一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體；具體地，所述重組載體為重組病毒載體；具體地，所述重組載體為本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體與pdc315質(zhì)?；騭g655經(jīng)重組得到的重組載體。

適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如：puc18、puc19、pmd18-t、pmd19-t、pgm-t載體、pdc315系列載體等。

適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，真核表達(dá)質(zhì)粒、重組病毒載體等。

所述真核表達(dá)質(zhì)粒包括但不限于，例如：pcdna3系列載體、pcdna4系列載體、pcdna5系列載體、pcdna6系列載體、prl系列載體、pdc315系列載體等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核表達(dá)質(zhì)粒為pdc315載體。

所述重組病毒載體包括但不限于，例如：重組腺病毒載體、重組腺相關(guān)病毒載體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組單純皰疹病毒載體、重組痘苗病毒載體等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組病毒載體為重組腺病毒載體。

本發(fā)明的又一方面還涉及一種含有本發(fā)明的啟動(dòng)子或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的載體的重組細(xì)胞。具體地，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于，例如：原代肝癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞株(huh7、hep3b、hepg2、plc/prf/5、smmc-7721、bel-7404、bel7402、bel-7405、l2.2.15、mhcc97-l、mhcc97-h、qgy-7701、hcclm3、sk-hep-1)；原代肺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞株(a549、nci-h460、nci-h446、nci-h1299、nci-h292、nci-h23)；原代胃癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞株(sgc-7901、bgc-823、hgc-27)；原代結(jié)腸癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞株(ht29、colo205、sw620)；原代乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞株(mcf-7、mda-mb-453、mda-mb-468、htb-122、htb-133、sk-br3、t-47d)；原代宮頸癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞株(sk-ov3、ho-8910、hela)；原代黑色素瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞株(a375、a431)；原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(a172、u251)；原代骨肉瘤細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞株(u2os)；原代淋巴瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞株(raji、jurkat、k562)；原代胰腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞株(panc-1、bxpc-3、su-86.86)；原代前列腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞株(pc-3、du145)；原代膀胱癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞株(t24)；原代鼻咽癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞株(cne-1)等。

本發(fā)明的再一方面涉及將本發(fā)明的多核苷酸(啟動(dòng)子)或本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法；所述方法包括病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法為病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，更具體地為腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明的再一方面涉及一種藥用組合物，其包含本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者本發(fā)明的重組載體，以及可選的藥學(xué)上可接受的輔料。

本發(fā)明的再一方面涉及選自如下的(1)或(2)的用途：

(1)本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者本發(fā)明的重組載體在制備治療和/或預(yù)防和/或輔助治療癌癥或者抗腫瘤的藥物中的用途；具體地，所述癌癥或者腫瘤為肺癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；

(2)本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者本發(fā)明的重組載體在制備抑制腫瘤細(xì)胞的藥物或者試劑中的用途；具體地，所述腫瘤細(xì)胞為如下腫瘤的細(xì)胞：肺癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具體的實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為選自hep3b、huh7、hepg2、plc/prf/5、bel-7404、h460和h1299細(xì)胞中的任意一種。

本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防和/或輔助治療癌癥或者腫瘤的方法，包括使用有效量的本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者本發(fā)明的重組載體或者本發(fā)明的藥用組合物的步驟；具體地，所述癌癥或者腫瘤為肺癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。

本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外抑制腫瘤細(xì)胞的方法，包括使用有效量的本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者本發(fā)明的重組載體或者本發(fā)明的藥用組合物的步驟；具體地，所述腫瘤細(xì)胞為如下腫瘤的細(xì)胞：肺癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具體的實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞為選自hep3b、huh7、hepg2、plc/prf/5、bel-7404、h460和h1299細(xì)胞中的任意一種。

本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸在作為啟動(dòng)子中的用途。

本發(fā)明的再一方面涉及一種分離的多核苷酸，其包含或者為seqidno：20所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明還涉及該多核苷酸在制備啟動(dòng)子中的用途；具體地，所述啟動(dòng)子為具有啟動(dòng)子功能的前面本發(fā)明中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由該多核苷酸制備的啟動(dòng)子序列穩(wěn)定，不會(huì)隨著其在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移而發(fā)生序列丟失現(xiàn)象，并且能夠穩(wěn)定地表達(dá)驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)。

actgagtcattagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttc(seqidno：20)

在本發(fā)明中，術(shù)語“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，例如，啟動(dòng)子被置于所述基因的核酸序列的特定位置，例如啟動(dòng)子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高轉(zhuǎn)錄水平的任何核酸序列，或者，可設(shè)計(jì)本發(fā)明所述啟動(dòng)子和基因以便下調(diào)特定核酸序列。也就是通過將啟動(dòng)子與反義方向的基因相連來實(shí)現(xiàn)。

所述“可操作地連接”可以通過基因重組的手段實(shí)現(xiàn)，具體地，所述核酸構(gòu)建體為重組核酸構(gòu)建體。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述基因?yàn)闊晒馑孛?luciferase)基因；在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述基因?yàn)槿祟恜53基因和gm-csf基因粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)基因。

本發(fā)明的啟動(dòng)子(多核苷酸)可以以單拷貝和/或多拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明提供了一種新的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子不僅能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)廣譜高效表達(dá)外源基因，而且其在一系列腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)活性高于cag啟動(dòng)子，且序列穩(wěn)定(不會(huì)在原核細(xì)胞及真核細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生序列丟失)。該啟動(dòng)子可適用于驅(qū)動(dòng)外源基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。

附圖說明

圖1：pdc315-ccau-rluc的載體圖譜。

圖2：應(yīng)用腺病毒雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定各啟動(dòng)子的活性。

圖3：11r-p53-2a-gm-csf表達(dá)框的模式圖。

圖4：病毒sg655-gmp3穿梭載體p74-tp-gmp3的載體圖譜。

圖5：病毒sg655-gmp3感染293細(xì)胞后表達(dá)p53的westernblotting檢測(cè)圖?？瞻祝锤腥静《镜?93細(xì)胞；1，2，3，4，5,6分別代表不同的病毒克??；ad-p53，感染ad-p53病毒。

圖6：不同克隆(1#－6#)病毒sg655-gmp3感染293細(xì)胞后表達(dá)hgm-csf的定量檢測(cè)。

圖7：sg655-gmp對(duì)肝癌細(xì)胞huh7的體外殺傷活性圖。

圖8：sg655-mgmp抑制huh7移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：攜帶各啟動(dòng)子核苷酸序列表達(dá)載體的構(gòu)建

1.根據(jù)psi-check2質(zhì)粒(購(gòu)自promega公司)中海腎熒光素酶(renillaluciferase，簡(jiǎn)稱rluc)基因的編碼序列，在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)pcr特異性擴(kuò)增引物(上游引物f1，加ecori限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；下游引物r1，加sali限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。f1與r1的序列如下：

f1:gccgaattcgccaccatgacttcgaaagt(seqidno：5)，其中小寫字母代表ecori酶切位點(diǎn)

r1：tgtgtcgacttattgttcatttttgagaactcgct(seqidno：6)，其中小寫字母代表sali酶切位點(diǎn)。

以psi-check2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出rluc基因編碼序列，經(jīng)ecori+sali雙酶切，裝入同樣經(jīng)ecori+sali雙酶切的腺病毒穿梭載體pdc315(購(gòu)自北京本元正陽公司，含腺病毒左臂、腺病毒包裝信號(hào)、長(zhǎng)末端重復(fù)序列)，獲得pdc315-cmv-rluc載體(pdc315含cmv啟動(dòng)子)。

2.按seqidno：1-seqidno：4所示核苷酸序列，并在其上游引入xbai，在其下游引入酶切位點(diǎn)ecori，委托上海捷瑞生物公司合成，裝入經(jīng)xbai+ecori雙酶切的pdc315-cmv-rluc載體(替換原pdc315-cmv-rluc載體中的cmv啟動(dòng)子)，分別命名為pdc315-cac-rluc、pdc315-cacu-rluc、pdc315-ccau-rluc(具體載體圖譜見圖1)、pdc315-4cau-rluc。

3.根據(jù)pcaggs載體(購(gòu)自addgene質(zhì)粒庫)中cag啟動(dòng)子的序列，在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)pcr特異性擴(kuò)增引物(上游引物f2，加nhei限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；下游引物r2，加ecori限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。f2與r2的序列如下：

f2:gccgctagctctagttattaatagtaatcaatt(seqidno：7)，其中小寫字母代表nhei酶切位點(diǎn)

r2：tgtgaattctttgccaaaatgatgagacagcac(seqidno：8)，其中小寫字母代表ecori酶切位點(diǎn)。

以pcaggs質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出cag啟動(dòng)子核苷酸序列，經(jīng)nhei+ecori雙酶切，裝入經(jīng)xbai+ecori雙酶切的pdc315-rluc載體(替換原pdc315-cmv-rluc載體中的cmv啟動(dòng)子)，分別命名為pdc315-cag-rluc。

4.將如上各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh5α細(xì)菌后，委托上海生工對(duì)各啟動(dòng)子的dna序列進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cac、cacu、4cau啟動(dòng)子的dna序列存在不同程度的丟失現(xiàn)象(不同細(xì)菌克隆存在差異)，序列丟失主要發(fā)生在mcmv增強(qiáng)子區(qū)段中；而cmv、cag、ccau啟動(dòng)子的序列保持穩(wěn)定。

實(shí)施例2：攜帶各啟動(dòng)子核苷酸序列的腺病毒雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建

1.根據(jù)psi-check2質(zhì)粒(購(gòu)自promega公司)中螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase，簡(jiǎn)稱fluc)基因的編碼序列，在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)pcr特異性擴(kuò)增引物(上游引物f3，加ecori限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；下游引物r3，加sali限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。f3與r3的序列如下：

f3:gccgaattcgccaccatggaagacgcc(seqidno：9)，其中小寫字母代表ecori酶切位點(diǎn)；

r3：tgtgtcgacttacacggcgatctttccgc(seqidno：10)，其中小寫字母代表sali酶切位點(diǎn)。

以psi-check2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出fluc基因編碼序列，經(jīng)ecori+sali雙酶切，裝入同樣經(jīng)ecori+sali雙酶切的pentr12^tm載體(購(gòu)于invitrogen公司，由hcmv啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)，含有λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的attl1和attl2序列)，獲得pentr12-fluc載體。將pentr12-fluc質(zhì)粒和ppe3質(zhì)粒(購(gòu)自加拿大microbixbiosystems公司，含有λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的attr1和attr2序列，ccdb基因，以及5型腺病毒右臂)共同轉(zhuǎn)化bj5183細(xì)菌，通過lr反應(yīng)重組獲得攜帶fluc基因及5型腺病毒右臂的骨架質(zhì)粒ppe3-fluc。

2.分別將pdc315-cmv-rluc、pdc315-cag-rluc、pdc315-cac-rluc、pdc315-cacu-rluc、pdc315-ccau-rluc、pdc315-4cau-rluc與ppe3-fluc通過lipofectamine共轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞株(購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，atcc)，其具體方法參見gibcobrl公司的操作說明。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，即得攜帶各啟動(dòng)子核苷酸序列的腺病毒雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，分別命名為ad-cmv-2luc、ad-cag-2luc、ad-cac-2luc、ad-cacu-2luc、ad-ccau-2luc、ad-4cau-2luc。

以上重組腺病毒在hek293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒，然后利用50％組織培養(yǎng)感染劑量(tcid50)法測(cè)定病毒滴度(方法參見美國(guó)qbiogene公司的adeasytm操作手冊(cè))。

3.提取以上腺病毒的基因組，委托上海生工對(duì)各啟動(dòng)子的dna序列進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cac、cacu、4cau啟動(dòng)子的dna序列同樣存在不同程度的丟失現(xiàn)象(不同病毒克隆存在差異)，序列丟失也主要發(fā)生在mcmv增強(qiáng)子區(qū)段中；而cmv、cag、ccau啟動(dòng)子的序列保持穩(wěn)定。

實(shí)施例3：利用攜帶腺病毒雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定各啟動(dòng)子的活性

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的低代數(shù)hek293、hep3b、huh7、hepg2、plc/prf/5、bel-7404、h460、h1299細(xì)胞株(均購(gòu)自atcc)分別按1×10⁴cells/孔鋪96孔板，置37℃、5％co2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)；按病毒感染復(fù)數(shù)moi＝5，分別感染ad-cmv-2luc、ad-cag-2luc、ad-cac-2luc、ad-cacu-2luc、ad-ccau-2luc、ad-4cau-2luc等6種重組病毒每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；然后置37℃、5％co2孵箱培養(yǎng)；24小時(shí)后，裂解細(xì)胞，通過雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自promega公司)，置于酶標(biāo)儀中測(cè)定rluc的酶活性，以fluc的酶活性為內(nèi)參，獲得rluc/fluc的相對(duì)比值。具體操作步驟按試劑盒說明書完成。

結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，在一系列啟動(dòng)子中，ccau啟動(dòng)子的活性最穩(wěn)定，分別在hek293、hep3b、huh7、hepg2、plc/prf/5、bel-7404、h460、h1299中居第2、第2、第1、第1、第1、第1、第2位；其活性分別為cag啟動(dòng)子在相應(yīng)細(xì)胞中活性的2.8、6.2、2.0、1.8、2.5、4.5、3.5、1.1倍(具體結(jié)果見圖2)。

結(jié)果還表明，本發(fā)明的啟動(dòng)子特別是ccau啟動(dòng)子能夠在多種細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)內(nèi)發(fā)揮啟動(dòng)子功能，具有廣譜性，且廣譜性高于cag啟動(dòng)子。

實(shí)施例4：重組腺病毒sg655-gmp3的構(gòu)建

參考公開號(hào)為cn103614416a的中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?01310460980，公開日為2014年03月05日)。具體步驟如下：

1.合成一段人工第一絕緣子(具體序列如seqidno：11所示)，并在其上游引入多克隆位點(diǎn)(bglii-xbai-ecori-bamhi-sali-nhei-hindiii-spei)，在其下游引入酶切位點(diǎn)(ecorv-bglii)，委托上海捷瑞生物公司合成，裝入載體片段pca13載體(bglii)位點(diǎn)之間，構(gòu)建獲得的載體命名為pca16。pca13載體購(gòu)于加拿大microbixbiosysteminc.(toronto)，是一個(gè)腺病毒穿梭載體，含有5型腺病毒左臂序列(bp22-5790)，缺失e1區(qū)342至3523bp片段，可用于克隆外源基因并與包含腺病毒右臂的載體包裝成腺病毒載體。

2.將cac啟動(dòng)子序列、seqidno：3所示ccau啟動(dòng)子序列分別裝入pca16載體中，構(gòu)建成功載體分別命名為pca20、pca21。

3.根據(jù)人11r穿膜肽p53基因(seqidno：12所示)、人gm-csf基因(簡(jiǎn)稱hgm-csf，seqidno：13)、小鼠gm-csf基因(簡(jiǎn)稱mgm-csf，seqidno：14)、furin-2a編碼序列(seqidno：15)，分別合成11r-p53-f2a-hgm-csf(簡(jiǎn)稱hgmp，見圖3)與11r-p53-f2a-mgm-csf，兩端引入酶切位點(diǎn)(ecori+sali)，委托上海捷瑞生物公司全基因合成，分別裝入pca20、pca21載體中，構(gòu)建成功載體，分別命名為pca20-hgmp、pca20-mgmp、pca21-hgmp、pca21-mgmp。

4.按seqidno：16所示序列合成一段dna長(zhǎng)序列，該序列依次包含5型腺病毒原e1a啟動(dòng)子前的一段序列、第二絕緣子、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子、e1a編碼序列、e1apolya加尾信號(hào)序列，兩端包含酶切位點(diǎn)ecori與bglii，該片段經(jīng)ecori與bglii雙酶切后連接到經(jīng)ecori與bglii雙酶切后的pxc.1載體(購(gòu)于加拿大microbixbiosysteminc)，構(gòu)建獲得的載體命名為p74-tp，該載體用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子替換了腺病毒原來e1a啟動(dòng)子，并刪除了e1b55kda與19kda編碼區(qū)序列。

5.質(zhì)粒pca20-hgmp、pca20-mgmp、pca21-hgmp、pca21-mgmp分別經(jīng)(bglii)酶切后，回收cag-hgmp-sv40polya-絕緣子、cag-mgmp-sv40polya-絕緣子、ccau-hgmp-sv40polya-絕緣子、ccau-mgmp-sv40polya-絕緣子表達(dá)框片段，將整個(gè)表達(dá)框裝入經(jīng)同樣酶切后的載體片段p74-tp(bglii)中，選擇反向連接的陽性克隆子，構(gòu)建成功載體分別命名為p74-tp-gmp2、p74-tp-mgmp2、p74-tp-gmp3(載體圖譜如圖4所示)、p74-tp-mgmp3。

6.將純化獲得的p74-tp-gmp2、p74-tp-mgmp2、p74-tp-gmp3、p74-tp-mgmp3，分別與含有腺病毒基因組右臂的骨架質(zhì)粒ppe3(購(gòu)于加拿大microbixbiosysteminc)，通過lipofectamine(購(gòu)于invitrogen公司)共轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞(購(gòu)于atcc)內(nèi)重組，獲得重組溶瘤腺病毒sg655-gmp2、sg655-mgmp2、sg655-gmp3、sg655-mgmp3。

第一絕緣子序列：

agagaaatgttctggcacctgcacttgcactggggacagcctattttgctagtttgttttgtttcgttttgttttgatggagagcgtatgttagtactatcgattcacacaaaaaaccaacacacagatgtaatgaaaataaagatattttatt(seqidno：11)

人穿膜肽p53基因：

atgggccgccgcaggagacgacggcgacggcgaagaagggaggagccgcagtcagatcctagcgtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaacgttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcagcatcttatccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgacagaaacacttttcgacatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccgcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgagcactgcccaacaacaccagctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatccgtgggcgtgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggatgcccaggctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactcagac(seqidno：12)

人gm-csf基因：

atgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatctctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagtga(seqidno：13)

小鼠gm-csf基因：

atgtggctgcagaatttacttttcctgggcattgtggtctacagcctctcagcacccacccgctcacccatcactgtcacccggccttggaagcatgtagaggccatcaaagaagccctgaacctcctggatgacatgcctgtcacgttgaatgaagaggtagaagtcgtctctaacgagttctccttcaagaagctaacatgtgtgcagacccgcctgaagatattcgagcagggtctacggggcaatttcaccaaactcaagggcgccttgaacatgacagccagctactaccagacatactgccccccaactccggaaacggactgtgaaacacaagttaccacctatgcggatttcatagacagccttaaaacctttctgactgatatcccctttgaatgcaaaaaaccaggccaaaaatga(seqidno：14)

furin-2a編碼序列：

cgtaaaaggcgagctcctgttaaacagactttgaattttgaccttctcaagttggcgggagacgtcgagtccaaccctgggccc(seqidno：15)

p74-tp載體構(gòu)建過渡片段序列：

gaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatccgggcccccatttcccctcccttccagctctctgccccttttggattgaagccaatatgataatgagggggtggagtttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgtgatgttgcaagtgtggcggaacacatgtaagcgacggatgtggcaaaagtgacgtttttggtgtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtagtaaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataagaggaagtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatttctagtaataaaggatcctttattttcattggatccgtgtgttggttttttgtgtgcggccgcgtaccggtcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccactcgaggacgcacgtgggttcgaatgaaaatgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgttaaagatct(seqidno：16)

實(shí)施例5：重組腺病毒sg655-gmp3的外源基因表達(dá)活性鑒定

hek293細(xì)胞(購(gòu)于atcc)按5×10⁵細(xì)胞/孔鋪在6孔板中，在37℃孵箱5％co2培養(yǎng)，第二天換無血清液體1ml，然后按moi＝5分別加入重組溶瘤腺病毒sg655-gmp3，培養(yǎng)90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液(pbs)洗兩次，將病毒洗去，與加入5％胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時(shí)后，裂解細(xì)胞收集樣品，westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p53蛋白的表達(dá)，以看家基因gapdh作為內(nèi)參。

結(jié)果如圖5所示。

結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照病毒(ad-p53，購(gòu)于深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司，表達(dá)53kda的產(chǎn)物)，重組溶瘤腺病毒sg655-gmp3能在hek293細(xì)胞中表達(dá)大小約為55kda的11r-p53融合蛋白，具體如圖5所示。

結(jié)果還表明，重組溶瘤腺病毒sg655-gmp3表達(dá)11r-p53融合蛋白的量高于對(duì)照病毒p53蛋白的表達(dá)量。

2.分別取重組溶瘤腺病毒sg655-gmp3的各個(gè)病毒克隆上清，稀釋一定倍數(shù)后用人gm-csfelisamaxdeluxe檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于biolegend公司)檢測(cè)該病毒各克隆在hek293細(xì)胞中hgm-csf蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果表明，重組溶瘤腺病毒sg655-gmp3各個(gè)克隆均能在hek293細(xì)胞中表達(dá)hgm-csf蛋白，并且表達(dá)量較高，各個(gè)克隆之間的差異不大。

實(shí)施例6：重組溶瘤腺病毒sg655-gmp3和sg655-gmp2在體外對(duì)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)

肝癌細(xì)胞株huh7(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院生化與細(xì)胞研究所)按1×10⁴細(xì)胞/孔鋪在96孔板中，在37℃孵箱5％co2培養(yǎng)，第二天按不同moi值梯度加入重組溶瘤腺病毒sg655-gmp2及sg655-gmp3(以5號(hào)克隆為例)，每個(gè)moi值設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)7天后，應(yīng)用mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，購(gòu)于sigma公司)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

結(jié)果如圖7所示。

結(jié)果表明，sg655-gmp2與sg655-gmp3對(duì)肝癌細(xì)胞具有良好的殺傷能力，且sg655-gmp3的殺傷效果優(yōu)于sg655-gmp2，表明ccau啟動(dòng)子控制治療基因的體外效果優(yōu)于cag啟動(dòng)子。

實(shí)施例7：重組溶瘤腺病毒sg655-mgmp3和sg655-mgmp2的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

由于物種差異，人類gm-csf基因?qū)π∈骴c細(xì)胞與巨噬細(xì)胞無刺激活性。為研究該病毒的體內(nèi)功能，本發(fā)明同時(shí)構(gòu)建了攜帶小鼠gm-csf基因的實(shí)驗(yàn)性溶瘤病毒sg655-mgmp。本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉，人類gm-csf基因?qū)θ祟恉c細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的具有良好的刺激活性。因而，對(duì)于gm-csf這個(gè)基因而言，sg655-mgmp在小鼠體內(nèi)的功能，可以直接反映sg655-gmp在人體內(nèi)的功能。

第一步：4～6周齡balb/c裸鼠50只，平均重量22～27g，由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育中心提供，清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

第二步：體外培育人肝癌細(xì)胞huh7，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，0.25％胰酶消化，離心、收集細(xì)胞后用pbs液重懸，3000g室溫離心2分鐘，棄上清，再用pbs液重懸后離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×10⁷個(gè)/ml。

第三步：于裸鼠右肋背部皮下接種huh7細(xì)胞，0.1ml/只。接種三周左右后，可見接種部位皮下長(zhǎng)出米粒大小硬結(jié)，移植瘤模型建成。待瘤體直徑生長(zhǎng)至7-9mm時(shí)開始治療。挑選40只皮下腫瘤生長(zhǎng)至7-9mm的huh7移植瘤進(jìn)行治療，將裸鼠隨機(jī)分分為4組。給藥途徑為直接瘤內(nèi)多點(diǎn)注射。

第四步：每日觀察小鼠的生活狀態(tài)并定期測(cè)量腫瘤的體積，定期測(cè)量一次腫瘤的最長(zhǎng)徑(a)及其垂直徑(b)，按公式(a×b²)/2計(jì)算腫瘤的體積，觀察不同劑量組的療效。

結(jié)果如圖8所示。

結(jié)果表明，相對(duì)于安慰劑組(注射pbs)，兩種基因-溶瘤腺病毒sg655-mgmp均能顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)(p<0.05)；而由ccau啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)11r-p53與gm-csf基因表達(dá)的溶瘤腺病毒sg655-mgmp2相對(duì)于由cag啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的對(duì)照溶瘤腺病毒sg655-mgmp2，顯示出更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，腫瘤體積一直明顯小于對(duì)照病毒組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，具體如圖8所示。基因-溶瘤腺病毒sg655-mgmp3對(duì)肝癌動(dòng)物模型的抗腫瘤作用優(yōu)于sg655-mgmp2，表明ccau啟動(dòng)子在腫瘤基因治療中的體內(nèi)作用優(yōu)于cag啟動(dòng)子。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110>中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院

上海白澤生物科技有限公司

<120>一種嵌合強(qiáng)啟動(dòng)子及其用途

<130>idc170029

<160>23

<170>patentinversion3.2

<210>1

<211>1093

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc60

ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcca120

ttgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgta180

tcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcatta240

tgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcat300

cgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctccccccc360

ctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggc420

gggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcg480

aggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatg540

gcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgct600

gcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctc660

tgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccctgagtcattagggactttccaatgggt720

tttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaag780

tacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggg840

gtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcat900

tgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatg960

ggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgg1020

gaaagtaccgttcgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggtcct1080

gggtgacgaacag1093

<210>2

<211>1396

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc60

ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcca120

ttgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgta180

tcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcatta240

tgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcat300

cgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctccccccc360

ctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggc420

gggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcg480

aggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatg540

gcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgct600

gcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctc660

tgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccctgagtcattagggactttccaatgggt720

tttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaag780

tacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggg840

gtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcat900

tgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatg960

ggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgg1020

gaaagtaccgttcggcctccgcgccgggttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctc1080

acggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccgg1140

acgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcag1200

aaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagc1260

ggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggc1320

ggtgaacgccgatgatgcctctactaaccatgttcatgttttctttttttttctacaggt1380

cctgggtgacgaacag1396

<210>3

<211>1305

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

actgagtcattagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtg60

agtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgg120

gtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggc180

tattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaa240

agtaccgttcggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc300

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag360

ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac420

atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg480

cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg540

tattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctcccca600

tctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcag660

cgatgggggcgggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcg720

gggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtt780

tccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggc840

gggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgccc900

gccccggctctgactgaccgcgttactaaaacaggtaagtccggcctccgcgccgggttt960

tggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggc1020

gcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataag1080

actcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgact1140

ctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcg1200

gcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgatgcctctactaaccat1260

gttcatgttttctttttttttctacaggtcctgggtgacgaacag1305

<210>4

<211>2048

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaa60

tcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtcaatagggactttccattgggt120

tttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcac180

gtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgcc240

atgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaa300

acggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttcggagttccgcgttacataa360

cttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaata420

atgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggag480

tatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccc540

cctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctta600

tgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccactgagtca660

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