本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種新型黃酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雞血七，來源于金星蕨科新月蕨屬披針新月蕨[abacopterispenangiana(hook.)ching.]植物的根莖，又名雞血蓮，散血蓮等；是湘西北土家族的民間常用中藥；具有活血調(diào)經(jīng)，散瘀止痛，除濕等功效；主治月經(jīng)不調(diào)，崩漏，跌打損傷，風(fēng)濕痹痛，水腫等病癥。

目前，尚未有從雞血七中提取得到具有抗凝血、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖或細(xì)胞保護(hù)功能的新化合物的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，從雞血七中提取一種新型黃酮類化合物，所述化合物可以有效抗凝血、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖或保護(hù)細(xì)胞，且其中的化合物i和ii可作為天然紅色色素使用，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

具體而言，本發(fā)明所述化合物選自結(jié)構(gòu)i～v中的一種或多種：

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的化合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用乙酸乙酯-甲醇為流動相進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物進(jìn)行分離、純化，即得。

具體而言，所述化合物i可采用如下方法制備而成：

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為10～1：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為5～3：1的二氯甲烷-甲醇洗脫，將所得產(chǎn)物用體積比為1：5～1：1的石油醚-二氯甲烷-甲醇洗脫，再將所得產(chǎn)物上樣于sephadexlh-20柱用體積比1:1的氯仿-甲醇洗脫，即得化合物i；

或：

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為10～1：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為8～2：1的二氯甲烷-甲醇洗脫，將所得產(chǎn)物用體積比為5～1：1的氯仿-甲醇洗脫，將所得產(chǎn)物用體積比8～5：1的二氯甲烷-甲醇洗脫，再將所得產(chǎn)物通過半制備hplc以55％乙腈-水為流動相進(jìn)行洗脫，即得化合物i。

具體而言，所述化合物ii可采用如下方法制備而成：

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為10～1：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為5～3：1的二氯甲烷-甲醇洗脫，將所得產(chǎn)物用體積比為3～0：1的二氯甲烷-甲醇洗脫，再將所得產(chǎn)物上樣于sephadexlh-20柱用體積比1:1的氯仿-甲醇洗脫，即得化合物ii。

具體而言，所述化合物iii可采用如下方法制備而成：

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為100～20：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為8～3：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物用體積比為1～0：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物上樣于sephadexlh-20柱用體積比1:1的氯仿-甲醇洗脫，即得化合物iii。

具體而言，所述化合物iv可采用如下方法制備而成：

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為100～20：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為10～5：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物用體積比為10～8：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物用體積比為20～10：1的二氯甲烷-甲醇洗脫，即得化合物iv；

或?yàn)椋?/p>

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為100～20：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為3～0：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物用體積比為3～0：1的氯仿-甲醇洗脫，將所得產(chǎn)物用體積比為5～3：1的氯仿-甲醇洗脫，再將所得產(chǎn)物用體積比為5：1的氯仿-甲醇洗脫，即得化合物iv。

具體而言，所述化合物v可采用如下方法制備而成：

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為100～20：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為20～10：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物用體積比為20～10：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物用體積比為20～10：1的氯仿-甲醇洗脫，即得化合物v；

或?yàn)椋?/p>

(1)取雞血七原料，用乙醇提取，所得提取液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層，濃縮后，得浸膏；

(2)將所述浸膏上樣于硅膠柱，用體積比為100～20：1的乙酸乙酯-甲醇進(jìn)行洗脫，得提取物；

(3)將所述提取物用體積比為3～0：1的氯仿-甲醇洗脫，所得產(chǎn)物用體積比為3～0：1的氯仿-甲醇洗脫，將所得產(chǎn)物用體積比為3～1：1的氯仿-甲醇洗脫，再將所得產(chǎn)物用體積比為5～1：1的氯仿-甲醇洗脫，即得化合物v。

除非特殊限定，本發(fā)明所述洗脫時(shí)采用的固定相均為硅膠柱。

本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)所述化合物在制備抗凝血、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞保護(hù)藥物和保健品中的應(yīng)用；所述細(xì)胞保護(hù)優(yōu)選為抑制過氧化氫致細(xì)胞損傷。

本發(fā)明同時(shí)保護(hù)所述化合物i和化合物ii在制備食品、藥品、保健品和化妝品中的應(yīng)用。具體而言，可將化合物i和/或化合物ii作為天然紅色添加劑添加到食品、藥品、保健品和化妝品中。

本發(fā)明的新型黃酮類化合物采用簡便的方法從雞血七中提取得到。所述化合物可以有效抗凝血、抗血管平滑肌細(xì)胞增殖或保護(hù)細(xì)胞，且其中的化合物i和ii是天然紅色色素，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1～圖8分別為化合物1的uv譜、ir譜、ms譜、¹³c-nmr譜、¹h-nmr譜、hsqc譜、hmbc譜以及¹h-¹hcosy譜；

圖9～圖16分別為化合物2的uv譜、ir譜、ms譜、¹³c-nmr譜、¹h-nmr譜、hsqc譜、hmbc譜以及¹h-¹hcosy譜；

圖17～圖24分別為化合物3的uv譜、ir譜、ms譜、¹³c-nmr譜、¹h-nmr譜、hsqc譜、hmbc譜以及¹h-¹hcosy譜；

圖25～圖32分別為化合物4的uv譜、ir譜、ms譜、¹³c-nmr譜、¹h-nmr譜、hsqc譜、hmbc譜以及¹h-¹hcosy譜；

圖33～圖40分別為化合物4的uv譜、ir譜、ms譜、¹³c-nmr譜、¹h-nmr譜、hsqc譜、hmbc譜以及¹h-¹hcosy譜；

圖41為化合物3對血管緊張素ii誘導(dǎo)的血管平滑肌肌細(xì)胞增殖影響示意圖；其中，*p<0.05與正常組比較，^#p<0.05,^##p<0.01與模型組比較；

圖42為化合物3對過氧化氫誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞的保護(hù)作用示意圖；*p<0.05，^#p<0.05，^##p<0.01與模型組比較。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種黃酮類化合物，具體結(jié)構(gòu)如下：

所述化合物的表征圖譜如圖1～圖8所示；具體信息如下：

紅色粉末，(c0.50,meoh)；

hresi-ms給出[m+h]⁺m/z459.1661(calcdforc24h27o9，459.1655)，可以確定該化合物分子式為c24h26o9，不飽和度為12；

uv譜顯示在347nm、524nm處有最大吸收；

ir譜顯示：羥基(3413cm^-1)，羰基(1601cm^-1)和苯環(huán)(1641，1498cm^-1)；

¹³c-nmr譜顯示24個(gè)碳信號：即一組黃酮類結(jié)構(gòu)，一個(gè)葡萄糖，一個(gè)甲氧基和兩個(gè)甲基的信號；從¹h-nmr譜中可知，六個(gè)芳香氫：δh8.64(1h，dd，7.6hz)，7.89(2h，dd，8.9hz)，7.10(2h，dd，8.9hz)，6.81(1h，dd，7.6hz)；一個(gè)糖的端基質(zhì)子：δh5.42(d，7.6hz)，一個(gè)甲氧基：δh3.75(3h，s)，兩個(gè)甲基：δh2.78(3h，s)，2.38(3h，s)，見表1；

在¹h-¹hcosy譜上，h-3與h-4相關(guān)，h-2'(6')與h-3'(5')相關(guān)，證實(shí)了一維氫譜偶合信號的相關(guān)；

在hmbc譜中，4′-och3(δh3.75，s)與c-4′(δc162.3)相關(guān)，說明甲氧基連在c-4′位上；h-2′或6′(δh7.89，dd，8.9hz)與c-2(δc158.2)，c-3′或c-5′(δc114.8)，c-4′(δc162.3)相關(guān)；h-3′或5′(δh7.10，dd，8.9hz)與c-1′(δc124.1)，c-4′(δc162.3)相關(guān)；說明b環(huán)是連在c-2位上的4′位甲氧基取代的苯環(huán)。h-1″(δh5.42，d，7.6hz)與c-5(δc151.4)相關(guān)，說明糖連在c-5位上；6-ch3(δh2.78，s)與c-5(δc151.4)、c-6(δc128.3)、c-7(δc183.2)相關(guān)；8-ch3(δh2.38，s)與c-7(δc183.2)、c-8(δc109.2)、c-9(δc153.9)、相關(guān)，說明a環(huán)6、8位是甲基取代，7位是羰基。h-3(δh6.82，d，7.6hz)與c-2(δc158.2)、c-10(δc118.4)、c-1′(δc124.1)相關(guān)，h-4(δh8.65，d，7.6hz)與c-2(δc158.2)、c-5(δc151.4)、c-9(δc153.9)相關(guān)，說明c環(huán)上3和4位無取代。

綜上所述，鑒定該化合物為6,8-dimethyl-5-hydroxy-2-(4'-methoxy-phenyl)-benzopyran-5-o-β-d-glucopyranoside，即6,8-二甲基-5-羥基-2-(4′-甲氧基苯環(huán))-苯并吡喃-5-o-β-d-葡萄糖。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種黃酮類化合物，具體結(jié)構(gòu)如下：

所述化合物的表征圖譜如圖9～圖16所示；具體信息如下：

紅色粉末，(c1.38,meoh)，hresims給出[m+h]⁺m/z501.1817(calcdforc26h29o10，501.1761)，可以確定分子式為c26h28o10，不飽和度為13。uv譜顯示在512nm處有最大吸收。ir譜顯示：羥基(3364cm^-1)，羰基(1729cm^-1)和苯環(huán)(1647，1601，1499cm^-1)。

比較化合物1，¹³c-nmr譜中，多了一個(gè)δc170.4(羰基)和δc20.4(甲基)。在hmbc譜中，h-6″(δh4.26，dd)與羰基(δc170.4)相關(guān)，說明羰基連在c-6″位上；6″-ch3(δh1.89，s)與羰基(δc171.2)相關(guān)，說明甲基連在羰基位上。

綜上所述，鑒定該化合物為6,8-dimethyl-5-hydroxy-2-(4'-ethoxy-phenyl)-benzopyran-5-o-β-d-6-acety-glucopyranoside，即6,8-二甲基-5-羥基-2-(4′-甲氧基苯環(huán))-苯并吡喃-5-o-β-d-6-乙?；咸烟?。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種黃酮類化合物，具體結(jié)構(gòu)如下：

所述化合物的表征圖譜如圖圖17～圖24所示；具體信息如下：

白色粉末，(c1.75,meoh)，hresims給出[m+h]⁺m/z479.1916(calcdforc24h31o10，479.1917)，可以確定分子式為c24h30o10，不飽和度為10。uv譜顯示在273nm處有最大吸收。ir譜顯示：羥基(3400cm^-1)和苯環(huán)(1604，1569，1460cm^-1)。

¹³c-nmr譜顯示24個(gè)碳信號，即一組黃酮類結(jié)構(gòu)，一個(gè)葡萄糖和一個(gè)甲氧基的信號。從¹h-nmr譜可知，芳香環(huán)氫信號：δh8.06(d，8.9hz，h-2′和h-6′)，6.96(d，8.9hz，h-3′和h-5′)，構(gòu)成一組ax系統(tǒng)。δh3.34(dd，h-α)，δh3.20(m，h-α)，δh3.06(2h，dd，h-β)，構(gòu)成兩組-ch2-片段。一個(gè)糖端基氫信號：δh4.66(d，7.6hz，h-1″)。一個(gè)甲氧基信號：δh3.85(s,4′-och3)。兩個(gè)甲基信號：δh2.08(s,5-ch3)和δh2.18(s,3-ch3)。在¹h-¹hcosy譜中，h-α和h-β有相關(guān)，h-2′(δh8.06)和h-3′(δh6.96)有相關(guān)，證實(shí)了一維氫譜偶合信號的相關(guān)。

在hmbc譜中糖端基氫h-1″(δh4.66)與c-2(δc151.0)相關(guān)，說明糖連在c-2位；δh2.18(s，3-ch3)與c-3、c-2等相關(guān)，說明甲基連在3位上；δh2.08(s，5-ch3)與c-5、c-6等相關(guān)，說明甲基連在5位上。h-α(dd，δh3.34；m，δh3.20)與羰基碳、β-c、c-1相關(guān)；h-β(dd，δh3.06)與羰基碳、α-c、c-1、c-2相關(guān)，以上信息說明了查爾酮母核上的氫的位置。

綜合以上解析，化合物鑒定為α,β-dihydro-2,4,6-trihydroxy-4′-methoxy-3,5-dimethyl-dihydrochalcone-2-o-β-d-glucopyranoside，即2,4,6-三羥基-4′-甲氧基-3,5-二甲基二氫查爾酮。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了一種黃酮類化合物，具體結(jié)構(gòu)如下：

所述化合物的表征圖譜如圖25～圖32所示；具體信息如下：

黃色粉末，(c1.63,meoh)，hresims給出[m-na+h2o]⁺m/z485.1043(calcdforc22h22o11na，485.1060)，可以確定分子式為c22h24o12，不飽和度為11。uv譜顯示在336nm、414nm處有最大吸收。ir譜顯示：羥基(3354cm^-1)和苯環(huán)(1600，1505，1453cm^-1)。

¹³c-nmr譜顯示22個(gè)碳信號，即一組黃酮類結(jié)構(gòu)，一個(gè)葡萄糖和一個(gè)甲氧基的信號。¹h-nmr譜顯示芳香氫信號δh8.38(d，2.8hz，h-6)，7.21(d，8.7，2.8hz，h-4)，7.18(d，8.7hz，h＝3)，構(gòu)成一組abx系統(tǒng)。另一芳香環(huán)氫信號δh6.85(d，1.7hz，h-3′)，6.17(d，1.7hz，h-5′)，構(gòu)成一組ab系統(tǒng)。糖端基氫信號δh5.85(d，7.5hz，h-1″)。一個(gè)甲氧基信號δh3.74(s，4′-och3)。在¹h-¹hcosy譜中，h-6和h-4有相關(guān)，h-5'和h-3'有相關(guān)，證實(shí)了一維氫譜偶合信號的相關(guān)。

在hmbc譜中糖端基氫h-1″(δh5.85)與c-2′(δc157.5)相關(guān)，說明糖連在c-2′位；h-3′(δh5.85)與c-1′、c-4′、c-5′等相關(guān)，h-5′(δh5.85)與c-1′、c-3′、c-6′等相關(guān)；h-3(δh7.18)與c-1相關(guān)，h-4(δh7.21)與c-5相關(guān)，h-6(δh8.38)與β-c、c-3、c-4相關(guān)；h-β(δh8.07)與羰基、α-c、c-2、c-6相關(guān)。以上信息說明了查爾酮母核上的氫的位置。

綜合以上解析，化合物鑒定為α,2,5,2′,6′-pentahydroxy-4′-methoxy-chalcone-2′-o-β-d-glucopyranoside，即α,2,5,2′,6′-五羥基-4′-甲氧基-查爾酮-2′-o-β-d-葡萄糖。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了一種黃酮類化合物，為，具體結(jié)構(gòu)如下：

所述化合物的表征圖譜如圖33～圖40所示；具體信息如下：

黃色粉末，(c33.63,meoh)，hresims給出[m+h]m/z465.1399(calcdforc22h25o11，465.1397)，可以確定分子式為c22h24o11，不飽和度為11。uv譜顯示在281nm處有最大吸收。ir譜顯示：羥基(3333cm^-1)和苯環(huán)(1649，1607，1505cm^-1)。

¹³c-nmr譜顯示22個(gè)碳信號，即黃酮類結(jié)構(gòu)，一個(gè)葡萄糖和一個(gè)甲氧基的信號。¹h-nmr譜顯示芳香氫信號δh7.65(d，2.4hz，h-6')，7.12(d，8.7，2.4hz，h-4')，7.11(d，8.7hz，h＝3')，構(gòu)成一組abx系統(tǒng)。另一芳香環(huán)氫信號δh7.06(d，2.4hz，h-6)，6.39(d，2.4hz，h-8)，構(gòu)成一組ab系統(tǒng)。糖端基氫信號δh5.38(d，j＝7.4hz，h-1″)。一個(gè)甲氧基信號δh3.68(s，7-och3)。在cosy譜中，h-6(δh7.06)和h-8(δh6.39)有相關(guān)，h-6'(δh7.65)和h-4'(δh7.12)有相關(guān)，證實(shí)了一維氫譜偶合信號的相關(guān)。另外，h-2(δh6.21)和h-3(δh3.22)相關(guān)。

在hmbc譜中糖端基氫h-1″(δh5.38)與c-5(δc161.3)相關(guān)，說明糖連在c-5位；h-6(δh7.06)與c-5、c-7、c-8、c-10等相關(guān)，h-8(δh6.39)與c-6、c-9、c-10等相關(guān)；h-6′(δh7.65)與c-2、c-2′、c-4′、c-5′相關(guān)，h-3′與c-1′、c-2′、c-5″相關(guān)；h-2(δh6.21)與c-6′相關(guān)，h-3(δh3.22)與c-2、c-4相關(guān)；以上信息說明了二氫黃酮母核上的氫的位置。

綜合以上解析，化合物鑒定為5,2′,5′-trihydroxy-7-methoxy-flavonones-5-o-β-d-glucopyranoside，即5,2′,5′-三羥基-7-甲氧基-二氫黃酮-5-o-β-d-葡萄糖。

實(shí)驗(yàn)例1：體外抗凝血實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明對化合物1～5的體外抗凝血活性進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示：化合物1～5均可延長pt和tt時(shí)間，對aptt的影響不明顯；在樣品濃度0.1g/ml～0.5g/ml范圍內(nèi)，存在一定計(jì)量依賴關(guān)系；并且在樣品濃度0.5g/ml下，抗凝血效果最顯著。

實(shí)驗(yàn)例2：mtt試驗(yàn)法檢測化合物對血管緊張素ii誘導(dǎo)的血管平滑肌肌細(xì)胞增殖影響

細(xì)胞株：血管平滑肌細(xì)胞(vsmcs)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對化合物3進(jìn)行了mtt實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明化合物3在10μmol/l和30μmol/l濃度時(shí)，具有良好的抑制血管平滑肌肌細(xì)胞增殖的活性，結(jié)果如圖41所示。

實(shí)驗(yàn)例3：mtt試驗(yàn)法檢測化合物對過氧化氫誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞的保護(hù)作用

細(xì)胞株：pc12細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對化合物3進(jìn)行了mtt實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明化合物3對過氧化氫誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，結(jié)果如圖42所示。

由以上結(jié)果可知，對化合物3具有抗血管平滑肌細(xì)胞增殖活性且對過氧化氫致?lián)p傷的pc12細(xì)胞具有保護(hù)作用。

本發(fā)明同時(shí)對化合物1、2、4、5的活性進(jìn)行了檢測，上述化合物均具有與化合物3類似的活性。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。