本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗凋亡細(xì)胞系及其建立方法，以及該抗凋亡的細(xì)胞系的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞凋亡在細(xì)胞的生理和病理中發(fā)揮著重要的作用。然而在生物工程中，細(xì)胞凋亡卻有著負(fù)面的影響。在蛋白的表達(dá)或者病毒的包裝中，尤其是在表達(dá)一些促凋亡蛋白或者包裝攜帶促凋亡基因的病毒時(shí)，常常由于宿主細(xì)胞的凋亡無(wú)法獲得高的蛋白或病毒產(chǎn)量。雖然已有一些方法可以對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生一定的抑制效果，包括sirna干擾bax和bak基因以及通過(guò)鋅指核酸酶敲除bax和bak基因等，但是這些方法都不太徹底，效果并不理想。caspase3、caspase6、caspase7和aif1是細(xì)胞凋亡途徑中的最后的執(zhí)行分子，因此通過(guò)敲除這四個(gè)基因有可能使細(xì)胞獲得抗凋亡效果，目前還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。

crispr/cas技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的第三代基因編輯技術(shù)，與前兩代基因編輯技術(shù)(鋅指核酸酶技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù))相比，crispr/cas技術(shù)更加的簡(jiǎn)單易行、成本低，而且非常適用于多基因編輯。crispr/cas對(duì)基因組進(jìn)行靶向的切割后，細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接途徑對(duì)斷裂位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，從而造成靶位點(diǎn)的突變。將cas9核酸內(nèi)切酶與多個(gè)sgrna同時(shí)轉(zhuǎn)入到靶細(xì)胞就可以實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)敲除。

綜上，crispr/cas技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)的四個(gè)執(zhí)行分子caspase3、caspase6、caspase7和aif1進(jìn)行敲除，從而獲得具有抗凋亡能力的細(xì)胞。使蛋白表達(dá)或病毒包裝的效率得到提高。尤其是對(duì)于促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或者攜帶促凋亡相關(guān)基因的病毒包裝具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述抗細(xì)胞系存在的技術(shù)難題，本發(fā)明的目的在于，提供一種抗凋亡細(xì)胞系及其建立方法，并將該抗凋亡的細(xì)胞系應(yīng)用于蛋白的表達(dá)以及腺病毒包裝、腺相關(guān)病毒包裝以及慢病毒包裝。

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：

一種抗凋亡細(xì)胞系，其特征在于，在真核細(xì)胞中缺失了caspase3、caspase6、caspase7、aif1中的三個(gè)或四個(gè)基因。

根據(jù)本發(fā)明，所述的真核細(xì)胞是hek293細(xì)胞或hek293t細(xì)胞。

所說(shuō)的缺失是指在hek293細(xì)胞或hek293t細(xì)胞的編碼區(qū)發(fā)生了基因突變，造成該基因功能的喪失，突變類(lèi)型是缺失堿基、插入堿基、堿基替換中的任意一種或2-3種突變類(lèi)型的組合。

根據(jù)本發(fā)明，所述的真核細(xì)胞是hek293細(xì)胞，在hek293細(xì)胞中敲除caspase3、caspase6、caspase7和aif1四個(gè)基因。

上述抗凋亡細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，由下述步驟組成：

(1)篩選靶向caspase3、caspase6、caspase7和aif1基因外顯子區(qū)的sgrna

從ncbi查找caspase3、caspase6、caspase7和aif1四個(gè)基因的基因組序列，分別在每個(gè)基因的外顯子區(qū)選擇四個(gè)sgrna結(jié)合位點(diǎn)并設(shè)計(jì)相應(yīng)的sgrna引物，將sgrna引物退火后連接到sgrna表達(dá)載體，與cas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到hek293細(xì)胞后，收集基因組dna通過(guò)t7e1檢測(cè)每個(gè)sgrna的切割效率，從靶向每個(gè)基因的sgrna中挑選一個(gè)效率最高的待用；

(2)構(gòu)建攜帶cas9、sgrna、puromycin表達(dá)元件的真核表達(dá)載體

將篩選獲得的靶向caspase3基因的sgrna表達(dá)元件、cas9表達(dá)元件、puromycin表達(dá)元件依次插入到真核表達(dá)載體，獲得pcas9-casp3sgrna-puromycin。將靶向caspase6、caspase7和aif1的sgrna表達(dá)元件串聯(lián)，與cas9表達(dá)元件、puromycin表達(dá)元件依次插入到真核表達(dá)載體，獲得pcas9-ccasgrnas-puromycin；

(3)建立caspase3敲除的真核細(xì)胞系

將pcas9-casp3sgrna-puromycin轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用puromycin篩選24-48小時(shí)，進(jìn)行克隆化，獲得caspase3敲除的真核細(xì)胞系；

(4)建立caspase3、caspase6、caspase7和aif1敲除的真核細(xì)胞系

將pcas9-ccasgrnas-puromycin轉(zhuǎn)染caspase3敲除的細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用puromycin篩選24-48小時(shí)，進(jìn)行克隆化，獲得caspase3、caspase6、caspase7和aif1敲除的真核細(xì)胞系。

本發(fā)明采用crispr/cas介導(dǎo)的靶向基因修飾技術(shù)在hek293細(xì)胞或hek293t細(xì)胞中敲除caspase3、caspase6、caspase7和aif1中的三個(gè)基因或四個(gè)基因，根據(jù)申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)表明，所建立的抗凋亡的細(xì)胞系能夠應(yīng)用于蛋白的表達(dá)以及腺病毒包裝、腺相關(guān)病毒包裝以及慢病毒包裝。

附圖說(shuō)明

圖1是sgrna表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是sgrna切割效率t7e1檢測(cè)結(jié)果。

圖3是pu6/ccasgrnas結(jié)構(gòu)及構(gòu)建過(guò)程圖示。

圖4是同時(shí)攜帶sgrna、cas9、puromycin的多基因打靶載體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5是cccakohek293細(xì)胞系基因組測(cè)序結(jié)果。

圖6是cccakohek293細(xì)胞系蛋白水平檢測(cè)。

圖7是cccakohek293細(xì)胞系抗凋亡能力檢測(cè)結(jié)果。

圖8是bax蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果。

圖9是攜帶bax基因的腺病毒包裝結(jié)果。

圖10是攜帶bax基因的慢病毒包裝結(jié)果。

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例是較優(yōu)的例子，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。

具體實(shí)施方式

為了提高多基因敲除的效果，申請(qǐng)人構(gòu)建了攜帶篩選基因的靶向多基因敲除載體，即將cas9、多個(gè)sgrna、以及篩選基因同時(shí)插入到同一個(gè)真核表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)染后，通過(guò)篩選基因的篩選使攜帶多基因敲除載體的細(xì)胞得到富集，從而提高多基因打靶效率。

上述抗凋亡細(xì)胞系的建立方法，包括篩選靶向caspase3、caspase6、caspase7和aif1四個(gè)基因的sgrna，構(gòu)建攜帶cas9、靶向caspase3、caspase6、caspase7和aif1四個(gè)基因的sgrna、篩選基因的多基因敲除載體，將多基因敲除載體導(dǎo)入細(xì)胞用篩選基因篩選，將篩選后的細(xì)胞克隆化，克隆化的細(xì)胞克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。并且證明了該抗凋亡細(xì)胞系能夠在蛋白表達(dá)和病毒包裝中的應(yīng)用。

以下是發(fā)明人給出的具體實(shí)施例。

實(shí)施例1：

以下是以caspase3、caspase6、caspase7和aif1敲除的hek293細(xì)胞系cccakohek293為例的具體實(shí)例。

1、cccakohek293細(xì)胞系結(jié)構(gòu)如下

該hek293細(xì)胞系的caspase3、caspase6、caspase7和aif1四個(gè)基因編碼區(qū)dna基因組序列發(fā)生了變化，發(fā)生變化的基因組序列分別位于caspase3的第8個(gè)外顯子、caspase6的第5個(gè)外顯子、caspase7的第8個(gè)外顯子、aif1的第11個(gè)外顯子，其它基因組序列與野生型hek293細(xì)胞相同。

發(fā)生變化的基因組序列如下：

caspase3allelea(exon8)：

catccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgacaagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgagtccttttcctttgacgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatgctcacaaaagaactctatttttatcactaaagaaatggttggttggtggttttttttagtttgtatgccaagtgagaagatggtatatttggtactgtatttccctctcattttgacctactctcatgctgcagagggtactttaagacatactccttccatcaaatagaaccactatgaagctacctcaaacttccagtcaggtagttgcaattgaattaaattaggaataaataaaaatggatactggtgcagtcattatgagaggcaatgattgttaatttacagctttcatgattagcaagttacagtgatgctgtgctatgaattttcaagtaattgtgaaaaagttaaacattgaagtaatgaatttttatgatattccccccacttaagactgtgtattctagttttgtcaaactgtagaaatgatgatgtggaagaacttaggcatctgtgggcatggtcaaaggctcaaacctttattttagaattgatatacacggatgacttaactgcatttttagaccatttatctgggattatggttttgtgatgtttgtcctgaacacttttgttgtaaaaaaataataataatgtttaatattgagaaagaaactaatattttatgtgagagaaagtgtgagcaaactaacttgacttttaaggctaaaacttaacattcatagaggggtggagttttaactgtaaggtgctacaatgcccctggatctaccagcataaatatcttctgatttgtccctatgcatatcagttgagcttcatataccagcaatatatctgaagagctattatataaaaaccccaaactgttgattattagccaggtaatgtgaataaattctataggaacatatgaaaatacaacttaaataataaacagtggaatataaggaaagcaataaatgaatgggctgagctgcctgtaacttgagagtagatggtttgagcctgagcagagacatgactcagcctgttccatgaaggcagagccatggaccacgcaggaagggcctacagcccatttctccatacgcactggtatgtgtggatgatgctgccagggcgccatcgccaagtaagaaagtgaagcaaatcagaaacttgtgaagtggaaatgttctaaaggtggtgaggcaataaaaatcatagtactctttgtagcaaaattcttaagtatgttattttctgttgaagtttacaatcaaaggaaaatagtaatgttttatactgtttactgaaagaaaaagacctatgagcacataggactctagacggcatccagccggaggccagagctgagccctcagcccgggaggcaggctccaggcctcagcaggtgcggagccgtcactgcaccaagtctcactggctgtcagtatgacatttcacgggagatttcttgttgctcaaaaaatgagctcgcatttgtcaatgacagtttcttttttcttactagacctgtaacttttgtaaatacacatagcatgtaatggtatcttaaagtgtgtttctatgtgacaattttgtacaaatttgttattttccatttttatttcaaaatatacattcaaacttaaaatta。

caspase3alleleb(exon8)：

gttattattcttggcgaaatttcaaaggatggctcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgacaagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgagtccttttcctttgacgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatgctcacaaaagaactctatttttatcactaaagaaatggttggttggtggttttttttagtttgtatgccaagtgagaagatggtatatttggtactgtatttccctctcattttgacctactctcatgctgcagagggtactttaagacatactccttccatcaaatagaaccactatgaagctacctcaaacttccagtcaggtagttgcaattgaattaaattaggaataaataaaaatggatactggtgcagtcattatgagaggcaatgattgttaatttacagctttcatgattagcaagttacagtgatgctgtgctatgaattttcaagtaattgtgaaaaagttaaacattgaagtaatgaatttttatgatattccccccacttaagactgtgtattctagttttgtcaaactgtagaaatgatgatgtggaagaacttaggcatctgtgggcatggtcaaaggctcaaacctttattttagaattgatatacacggatgacttaactgcatttttagaccatttatctgggattatggttttgtgatgtttgtcctgaacacttttgttgtaaaaaaataataataatgtttaatattgagaaagaaactaatattttatgtgagagaaagtgtgagcaaactaacttgacttttaaggctaaaacttaacattcatagaggggtggagttttaactgtaaggtgctacaatgcccctggatctaccagcataaatatcttctgatttgtccctatgcatatcagttgagcttcatataccagcaatatatctgaagagctattatataaaaaccccaaactgttgattattagccaggtaatgtgaataaattctataggaacatatgaaaatacaacttaaataataaacagtggaatataaggaaagcaataaatgaatgggctgagctgcctgtaacttgagagtagatggtttgagcctgagcagagacatgactcagcctgttccatgaaggcagagccatggaccacgcaggaagggcctacagcccatttctccatacgcactggtatgtgtggatgatgctgccagggcgccatcgccaagtaagaaagtgaagcaaatcagaaacttgtgaagtggaaatgttctaaaggtggtgaggcaataaaaatcatagtactctttgtagcaaaattcttaagtatgttattttctgttgaagtttacaatcaaaggaaaatagtaatgttttatactgtttactgaaagaaaaagacctatgagcacataggactctagacggcatccagccggaggccagagctgagccctcagcccgggaggcaggctccaggcctcagcaggtgcggagccgtcactgcaccaagtctcactggctgtcagtatgacatttcacgggagatttcttgttgctcaaaaaatgagctcgcatttgtcaatgacagtttcttttttcttactagacctgtaacttttgtaaatacacatagcatgtaatggtatcttaaagtgtgtttctatgtgacaattttgtacaaatttgttattttccatttttatttcaaaatatacattcaaacttaaaatta。

caspase6allelea(exon5)：

tgtcaactgttagccacgcagatgccgattgctttgtgtgtgtcttcctgagccatgggatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaacgaaggcaatcacatttatgcatatgatgctaaaatcgaaattcagacattaactggcttgttcaaaggagacaagtgtcacagcctggttggaaaacccaagatatttatcattcag。

caspase6alleleb(exon5)：

tgtcaactgttagccacgcagatgccgattgctttgtgtgtgtcttcctgagcaaggcaatcacatttatgcatatgatgctaaaatcgaaattcagacattaactggcttgttcaaaggagacaagtgtcacagcctggttggaaaacccaagatatttatcattcag。

caspase7allelea(exon8)：

gtatgggaacagacaaagatgccgaggcgctcttcaagtgcttccgaagcctgggttttgacgtgattgtctataatgactgctcttgtgccaagatgcaagatctgcttaaaaaag。

caspase7alleleb(exon8)：

gtatgggcgttcgaacggaacagacaaagatgccgaggcgctcttcaagtgcttccgaagcctgggttttgacgtgattgtctataatgactgctcttgtgccaagatgcaagatctgcttaaaaaag。

aif1allelea(exon11)：

agggggttaaggtgatgcccaatgctattgtgcaatccgttggagtcagcagtggcaagttacttatcaagctgaaagacggcaaggaagg。

aif1alleleb(exon11)：

agggggttaaggtgatgcccaatgctattgtgcaatccgttggagtcagcagtggcaagttacttatcaagctgaaagacggccccgagagacacagggactctgccctgcagtgtggaaggcatgtgtgccccggccccactgctgacttggggatgcaggtctgcacctgggggaagtgcccggggcctatgctggaagg。

發(fā)生變化的dna序列也可位于caspase3、caspase6、caspase7、aif1基因的其它編碼區(qū)。

2、cccakohek293細(xì)胞系的構(gòu)建過(guò)程如下

(1)sgrna的設(shè)計(jì)和篩選

在金斯瑞生物科技有限公司將puc19(addgene購(gòu)買(mǎi))載體中的bsai酶切位點(diǎn)通過(guò)pcr定點(diǎn)突變，獲得puc19/bm。

在華大基因公司合成以下引物：

embhlfor：aattacgcgtggtaccttgaattcttactagtttagatct；

embhlreverse：agctagatctaaactagtaagaattcaaggtaccacgcgt；

將p1/p2在室溫退火后，與經(jīng)過(guò)hindiii和ecori酶切處理的puc19/bm載體連接，獲得puc19/bm-embhl。

在華大基因公司合成u6-sgrnabackbonedna片段，序列如下：

ggtaccaatctagaaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。

將u6-sgrnabackbone用kpni和spei酶切后與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的puc19/bm-embhl載體連接，獲得sgrna表達(dá)載體pu6-sgrna，載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖1。

從ncbi查找caspase3、caspase6、caspase7、aif1四個(gè)基因的基因組序列，編號(hào)如下：caspase3(ac_000136)、caspase6(ng_029187)、caspase7(nc_000010)、aif1(ng_013217)，分別在每個(gè)基因的編碼區(qū)選擇四個(gè)sgrna結(jié)合位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，序列如下：

humancaspase3sgrna1for：accgttgtggaattgatgcgtga；

humancaspase3sgrna1reverse：aaactcacgcatcaattccacaa；

humancaspase3sgrna2for：accgtattcttggcgaaattcaa；

humancaspase3sgrna2reverse：aaacttgaatttcgccaagaata；

humancaspase3sgrna3for：accgcttacccgggttaaccgaa；

humancaspase3sgrna3reverse：aaacttcggttaacccgggtaag；

humancaspase3sgrna4for：accgacccgggttaaccgaaagg；

humancaspase3sgrna4reverse：aaaccctttcggttaacccgggt；

humancaspase6sgrna1for：accgaaagcaatcggcatctgcg；

humancaspase6sgrna1reverse：aaaccgcagatgccgattgcttt；

humancaspase6sgrna2for：accgtcttcctgagccatggcga；

humancaspase6sgrna2reverse：aaactcgccatggctcaggaaga；

humancaspase6sgrna3for:accgattgccttcgccatggctc；

humancaspase6sgrna3reverse：aaacgagccatggcgaaggcaat；

humancaspase6sgrna4for:accgaatgtgattgccttcgcca；

humancaspase6sgrna4reverse:aaactggcgaaggcaatcacatt；

humancaspase7sgrna1for：accgcaggtatgggcgttcgaaa；

humancaspase7sgrna1reverse:aaactttcgaacgcccatacctg；

humancaspase7sgrna2for:accggacaatcacgtcaaaaccc；

humancaspase7sgrna2reverse：aaacgggttttgacgtgattgtc；

humancaspase7sgrna3for:accgaagcacttgaagagcgcct；

humancaspase7sgrna3reverse：aaacaggcgctcttcaagtgctt；

humancaspase7sgrna4for：accgttcaagtgcttccgaagcc；

humancaspase7sgrna4reverse：aaacggcttcggaagcacttgaa；

humanaif1sgrna1for：accgccccgaatacctcagcaac；

humanaif1sgrna1reverse：aaacgttgctgaggtattcgggg；

humanaif1sgrna2for：accgaagctgaaagacggcagga；

humanaif1sgrna2reverse：aaactcctgccgtctttcagctt；

humanaif1sgrna3for：accgctggagcccaatgttgagt；

humanaif1sgrna3reverse：aaacactcaacattgggctccag；

humanaif1sgrna4for:accgctcagattttggtggcttc；

humanaif1sgrna4reverse：aaacgaagccaccaaaatctgag；

將引物兩兩退火形成sgrna寡聚核苷酸，將退火形成的sgrna寡聚核苷酸鏈與bsai酶切處理的sgrna表達(dá)載體pu6-sgrna連接，獲得相應(yīng)的sgrna表達(dá)質(zhì)粒pu6/casp3sgrna1、pu6/casp3sgrna2、pu6/casp3sgrna3、pu6/casp3sgrna4、pu6/casp6sgrna1、pu6/casp6sgrna2、pu6/casp6sgrna3、pu6/casp6sgrna4、pu6/casp7sgrna1、pu6/casp7sgrna2、pu6/casp7sgrna3、pu6/casp7sgrna4、pu6/aif1sgrna1、pu6/aif1sgrna2、pu6/aif1sgrna3、pu6/aif1sgrna4。

在華大基因公司合成cas9表達(dá)元件cmv-cas9-sv40pa和puro-t2a-mcherry表達(dá)元件cmv-puro-t2a-mcherry，序列如下：

cmv-cas9-sv40pa：

acgcgtgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatgccaccatggacaagaagtactccattgggctcgatatcggcacaaacagcgtcggctgggccgtcattacggacgagtacaaggtgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcataaagaagaacctcattggcgccctcctgttcgactccggggagacggccgaagccacgcggctcaaaagaacagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgcaggagatctttagtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggaggagtcctttttggtggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgtggacgaggtggcgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgtagacagtactgataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaaatttcggggacacttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaaactctttatccaactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgcatccggagttgacgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcgaaaacctcatcgcacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgccctgtcactcgggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaagcttcaactgagcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcggcgaccagtacgcagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgagtgatattctgcgagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaagcgctatgatgagcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaactgcctgagaagtacaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacattgacggcggagcaagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaatggacggcaccgaggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcgcactttcgacaatggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcctcaggcggcaagaggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaatcctcacatttcggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgcgtggatgactcgcaaatcagaagagaccatcactccctggaacttcgaggaagtcgtggataagggggcctctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcctaacgaaaaggtgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacgagctcaccaaggtcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggagagcagaagaaagctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaacagctcaaagaagactatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagtggaggatcgcttcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaagacaaggacttcctggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcacccttacgttgtttgaagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctcttcgacgacaaagtcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtcaagaaaactgatcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttcttaagtccgatggatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcacctttaaggaggacatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtcttcacgagcacatcgctaatcttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggtcgtggatgaactcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagatggcccgagagaaccaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagaggattgaagagggtataaaagaactggggtcccaaatccttaaggaacacccagttgaaaacacccagcttcagaatgagaagctctacctgtactacctgcagaacggcagggacatgtacgtggatcaggaactggacatcaatcggctctccgactacgacgtggatcatatcgtgccccagtcttttctcaaagatgattctattgataataaagtgttgacaagatccgataaaaatagagggaagagtgataacgtcccctcagaagaagttgtcaagaaaatgaaaaattattggcggcagctgctgaacgccaaactgatcacacaacggaagttcgataatctgactaaggctgaacgaggtggcctgtctgagttggataaagccggcttcatcaaaaggcagcttgttgagacacgccagatcaccaagcacgtggcccaaattctcgattcacgcatgaacaccaagtacgatgaaaatgacaaactgattcgagaggtgaaagttattactctgaagtctaagctggtctcagatttcagaaaggactttcagttttataaggtgagagagatcaacaattaccaccatgcgcatgatgcctacctgaatgcagtggtaggcactgcacttatcaaaaaatatcccaagcttgaatctgaatttgtttacggagactataaagtgtacgatgttaggaaaatgatcgcaaagtctgagcaggaaataggcaaggccaccgctaagtacttcttttacagcaatattatgaattttttcaagaccgagattacactggccaatggagagattcggaagcgaccacttatcgaaacaaacggagaaacaggagaaatcgtgtgggacaagggtagggatttcgcgacagtccggaaggtcctgtccatgccgcaggtgaacatcgttaaaaagaccgaagtacagaccggaggcttctccaaggaaagtatcctcccgaaaaggaacagcgacaagctgatcgcacgcaaaaaagattgggaccccaagaaatacggcggattcgattctcctacagtcgcttacagtgtactggttgtggccaaagtggagaaagggaagtctaaaaaactcaaaagcgtcaaggaactgctgggcatcacaatcatggagcgatcaagcttcgaaaaaaaccccatcgactttctcgaggcgaaaggatataaagaggtcaaaaaagacctcatcattaagcttcccaagtactctctctttgagcttgaaaacggccggaaacgaatgctcgctagtgcgggcgagctgcagaaaggtaacgagctggcactgccctctaaatacgttaatttcttgtatctggccagccactatgaaaagctcaaagggtctcccgaagataatgagcagaagcagctgttcgtggaacaacacaaacactaccttgatgagatcatcgagcaaataagcgaattctccaaaagagtgatcctcgccgacgctaacctcgataaggtgctttctgcttacaataagcacagggataagcccatcagggagcaggcagaaaacattatccacttgtttactctgaccaacttgggcgcgcctgcagccttcaagtacttcgacaccaccatagacagaaagcggtacacctctacaaaggaggtcctggacgccacactgattcatcagtcaattacggggctctatgaaacaagaatcgacctctctcagctcggtggagacagcagggctgaccccaagaagaagaggaaggtgtgacaccgcggggagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcasggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcccggctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctcttgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgaggtcgactctagtccccgcggtggcggtaccgaattcactagt。

cmv-puro-t2a-mcherry：

agatctgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatatggtgagcaagggcgaggaagacaacatggctatcatcaaagagttcatgcggttcaaggtccacatggagggctctgtcaacgggcacgagtttgaaatagaaggggaaggggaggggcggccctacgaaggaacccaaaccgccaagctgaaggttaccaaaggcgggcccctgccctttgcctgggacatactgtcccctcagtttatgtacggctctaaagcctatgttaaacatcctgccgatatacccgattatctgaagctctcttttccagaaggatttaaatgggagcgggtcatgaatttcgaggatggcggcgtggtgaccgtgacccaggattctagcctccaggatggggagtttatatataaggtgaagctgcggggaaccaatttcccaagcgacgggcctgtgatgcagaagaagacaatgggttgggaggccagctctgaacggatgtatcctgaggatggagccctgaagggtgagattaaacagaggctgaagctcaaggacggcggccattatgatgccgaagtaaaaacaacttacaaggctaagaagccagtccagctccccggcgcatataatgtcaatatcaaactggacattacttctcataatgaggactacacaatcgtggagcaatacgagcgggccgaaggcaggcattctaccggagggatggacgagctgtacaaggagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccccgggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtggacccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaactagt。

將cmv-puro-t2a-mcherry用bglii和spei酶切，與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的puc19/bm-embhl載體連接獲得puc19/puro-t2a-mcherry。將cmv-cas9-sv40pa用mlui和spei酶切，與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的puc19/puro-t2a-mcherry載體連接，獲得的載體命名為pcas9。

將1×10⁶hek293細(xì)胞鋪到60mm培養(yǎng)皿，24小時(shí)后取6μgpcas9與3μgsgrna表達(dá)質(zhì)粒(即以下質(zhì)粒之一：pu6/casp3sgrna1、pu6/casp3sgrna2、pu6/casp3sgrna3、pu6/casp3sgrna4、pu6/casp6sgrna1、pu6/casp6sgrna2、pu6/casp6sgrna3、pu6/casp6sgrna4、pu6/casp7sgrna1、pu6/casp7sgrna2、pu6/casp7sgrna3、pu6/casp7sgrna4、pu6/aif1sgrna1、pu6/aif1sgrna2、pu6/aif1sgrna3、pu6/aif1sgrna4)通過(guò)磷酸鈣共沉淀共轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，用天根基因組提取試劑盒提取基因組dna，通過(guò)t7e1assay分析每個(gè)sgrna的切割效率。

t7e1assay步驟如下：以提取的基因組dna為模板，分別擴(kuò)增caspase3、caspase6、caspase7和aif1sgrna切割位點(diǎn)附近約100-2000bp的dna片段，引物序列如下：

aif1dnadetectionfor：aattcctggaagtgctg；

aif1dnadetectionreverse：gctaagggaaagtggtt；

caspase3dnadetectionfor：cacattcgtccttcagcatca；

p38caspase3dnadetectionreverse：accaccaaccaaccatttct；

caspase6dnadetectionfor：cctggctacatggcaaaac；

caspase6dnadetectionreverse：acagggagtagcacattgg；

caspase7dnadetectionfor：ggaaccttggctttgatggg；

caspase7dnadetectionreverse：ggccatggtgggcggatcg；

pcr產(chǎn)物進(jìn)行變性退火，瓊脂糖凝膠電泳回收后，取500ngpcr產(chǎn)物，0.5μlt7e1酶，37攝氏度處理30分鐘，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖2。電泳圖片中較小條帶與較大條帶灰度值的比值反映出sgrna切割效率，比值越高，切割效率越高。

依據(jù)t7e1檢測(cè)結(jié)果，分別選擇casp3sgrna3、casp6sgrna3、casp7sgrna1、aif1sgrna2用于進(jìn)一步研究。

(2)多基因打靶載體的構(gòu)建

將pu6/casp3sgrna3用kpni和spei酶切與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pcas9載體連接，獲得同時(shí)攜帶cas9、casp3sgrna、puromycin的打靶載體pcas9-casp3sgrna。

將pu6/aif1sgrna2用kpni和spei酶切并回收片段，與經(jīng)過(guò)kpni和xbai酶切處理的pu6/casp6sgrna3連接獲得pu6/casgrnas，將pu6/casp7sgrna1用kpni和spei酶切并回收片段，與經(jīng)過(guò)kpni和xbai酶切處理的pu6/casgrnas載體連接，獲得pu6/ccasgrnas，該載體結(jié)構(gòu)及構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)附圖3。

將pu6/ccasgrnas用kpni和spei酶切并回收片段，與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pcas9載體連接，獲得同時(shí)攜帶cas9、casp6sgrna、casp7sgrna、aif1sgrna、puromycin的多基因打靶載體pcas9-ccasgrnas，該載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖4。

(3)cccakohek293細(xì)胞系的建立

將1×10⁶hek293細(xì)胞鋪到60mm培養(yǎng)皿，24小時(shí)后，將12μgpcas9-casp3sgrna通過(guò)磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加入puromycin至終濃度1μg/ml篩選48小時(shí)，之后將篩選的細(xì)胞進(jìn)行克隆化，獲得caspase3敲除的hek293細(xì)胞casp3^-/-hek293。

將1×10⁶casp3^-/-hek293細(xì)胞鋪到60mm培養(yǎng)皿，24小時(shí)后，將12μgpcas9-ccasgrnas通過(guò)磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染casp3^-/-hek293，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加入puromycin至終濃度1μg/ml篩選48小時(shí)。將篩選后的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行克隆化，挑選10-50個(gè)克隆，提取基因組后對(duì)sgrna切割位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序并通過(guò)westernblot進(jìn)行蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，四個(gè)基因的sgrna切割位點(diǎn)均發(fā)生突變的克隆即為cccakohek293細(xì)胞系，附圖5顯示了clone7的測(cè)序結(jié)果，圖中可見(jiàn)四個(gè)基因的sgrna切割位點(diǎn)附近均發(fā)生了不同類(lèi)型的突變，造成了該基因的功能喪失。附圖6顯示了clone7的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果，圖中可見(jiàn)四個(gè)基因所編碼的蛋白均檢測(cè)不到表達(dá)。

3、cccakohek293細(xì)胞系抗凋亡檢測(cè)

1×10⁶cccakohek293鋪于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24小時(shí)后，將6μgbax表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到cccakohek293中，16小時(shí)后收集細(xì)胞用annexin染色后進(jìn)行流式檢測(cè)，hek293用同樣的方法處理作為對(duì)照組。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖7，結(jié)果可見(jiàn)cccakohek293細(xì)胞系與hek293細(xì)胞相比具有更好的抗凋亡能力。

4、cccakohek293細(xì)胞系在bax蛋白表達(dá)中的應(yīng)用

以人cdna文庫(kù)為模板，pcr擴(kuò)增獲得bax基因，同時(shí)在bax基因的3＇端引入flag標(biāo)簽，引物序列如下：

baxkpnixhoifor：aggtaccctcgagatggacgggtccggggag；

bax-flagxbainotireverse：

agcggccgctctagattacttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgcccatcttcttccag；

用kpni和noti酶切并回收bax基因片段，與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pcdna3.1(+)(addgene購(gòu)買(mǎi))連接，獲得pcdna3.1/bax-flag。

分別將1×10⁶cccakohek293細(xì)胞和hek293細(xì)胞鋪到60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24小時(shí)后，將12μgpcdna3.1/bax-flag通過(guò)磷酸鈣共沉淀分別轉(zhuǎn)染cccakohek293細(xì)胞和hek293細(xì)胞，72小時(shí)后，收集細(xì)胞提取蛋白，用抗flag單克隆抗體進(jìn)行westernblot檢測(cè)，以gapdh作為內(nèi)參，比較cccakohek293細(xì)胞和hek293細(xì)胞中bax蛋白的表達(dá)。附圖8顯示了bax蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平，圖中可見(jiàn)cccakohek293細(xì)胞中bax蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)高于hek293組。

5、cccakohek293細(xì)胞系在腺病毒包裝中的應(yīng)用

將用kpni和noti酶切回收的bax基因片段與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的腺病毒e1區(qū)穿梭載體pshuttle-cmv(addgene購(gòu)買(mǎi))連接，獲得pshuttle/cmv-bax。將12μgpshuttle/cmv-bax和8μg腺病毒骨架載體padeasy-1(addgene購(gòu)買(mǎi))混合后用2μlpaci酶切線性化，轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞(atcc購(gòu)買(mǎi))進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)染7-8天后顯微鏡下可見(jiàn)腺病毒病灶，即攜帶bax的腺病毒成功包裝。出現(xiàn)病灶后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融三次后離心取上清感染新的60mm培養(yǎng)皿中的hek293細(xì)胞。如此反復(fù)擴(kuò)增至10個(gè)150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的hek293細(xì)胞后，收集病毒，通過(guò)cscl2密度梯度離心純化腺病毒。用4moiad-bax感染cccakohek293細(xì)胞，用同樣滴度的病毒感染hek293作為對(duì)照，72小時(shí)后收集病毒感染u87細(xì)胞，24小時(shí)后收集細(xì)胞提取基因組，通過(guò)realtime-pcr檢測(cè)ad-bax的擴(kuò)增效果。附圖9顯示了攜帶bax基因的腺病毒ad-bax包裝效率，與對(duì)照組hek293細(xì)胞相比，cccakohek293細(xì)胞具有更高的包裝效率。

6、cccakohek293細(xì)胞系在慢病毒包裝中的應(yīng)用

將猿猴病毒40大t抗原基因(sv40larget)通過(guò)kpni和noti位點(diǎn)克隆到pcdna3.1(+)載體，獲得pcdna3.1/larget。取8μgpcdna3.1/larget通過(guò)磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染到1×10⁶cccakohek293細(xì)胞后用400μg/mlg418篩選7-20天獲得穩(wěn)定表達(dá)sv40larget的細(xì)胞系cccakohek293t。

用xhoi和xbai酶切步驟3中所獲得的bax基因并回收，與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的慢病毒載體plenti-puro(addgene購(gòu)買(mǎi))連接，獲得攜帶bax基因的慢病毒載體plenti/bax。

取3μg的plenti/bax、3μg的prsv-rev(addgene購(gòu)買(mǎi))、3μg的pmdlg/prre(addgene購(gòu)買(mǎi))通過(guò)磷酸鈣共沉淀共轉(zhuǎn)染1×10⁶cccakohek293t細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞上清感染u87(1×10⁶)細(xì)胞，感染24小時(shí)后收集細(xì)胞通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)bax從而反應(yīng)慢病毒的包裝滴度。hek293t作為對(duì)照。附圖10顯示了攜帶bax基因的慢病毒的包裝結(jié)果。圖中可看出在cccakohek293t細(xì)胞中的病毒包裝量明顯高于對(duì)照組hek293t。

7、cccakohek293細(xì)胞系在腺相關(guān)病毒包裝中的應(yīng)用

將攜帶trail基因的腺相關(guān)病毒質(zhì)粒與腺相關(guān)病毒輔助質(zhì)粒通過(guò)磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染cccakohek293細(xì)胞系，72小時(shí)候收集細(xì)胞獲取病毒。

實(shí)施例2：

以caspase3、caspase6、caspase7敲除的hek293t細(xì)胞系ccckohek293t為例，該ccckohek293t細(xì)胞系結(jié)構(gòu)如下：

該hek293t細(xì)胞系的caspase3、caspase6、caspase7三個(gè)基因編碼區(qū)dna序列發(fā)生了變化，發(fā)生變化的基因組序列分別位于caspase3的第5個(gè)外顯子、caspase6的第6個(gè)外顯子、caspase7的第7個(gè)外顯子，其它基因組序列與野生型hek293t細(xì)胞相同。

發(fā)生變化的基因組序列如下：

caspase3allelea：

gaatgacatctcggtctggtacagatgtcgtgatgcagcaaacctcagggaaacattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaaaatgatcttacacgtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatg。

caspase3alleleb：

gaatgacatctcggtctggtacagatgtcgatgcagcaaacctcagggaaattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaaaatgatcttacacgtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatg。

caspase6allelea：

gcatgtcggggaaaccagcacgaccagtcattcctttggatgtagtagataatcagacagagaagttggacaccaacataactgaggtggatgcagcctccgtttacacgctgcctgctggagctgacttcctcatgtgttactctgttgcagaag。

caspase6alleleb：

gcatgtcggggaaaccagcacgatgtgccagtcattcctttggatgtagtagataatcagacagagaagttggacaccaacataactgaggtggatgcagcctccgtttacacgctgcctgctggagctgaatgtgttactctgttgcagaag。

caspase7allelea：

cccctgactctggaactttaatttcaccagtaagaagaagaaaaatgtcaccatgcgatccatcaagaccacccgggaccgagtgcctacatatcagtacaacatgaattttgaaaagctgggcaaatgcatcataataaacaacaagaactttgataaagtgacag。

caspase7alleleb：

cccctgactctggaactttatatttcaccagtaagaagaagaaaaatgtcaccatgcgatccatcaagaccacccgggaccgagtgcctacatatcagtacaacatgaattttgaaaagctggcatcataataaacaacaagaactttgataaagtgacag。

發(fā)生變化的基因組dna序列也可位于caspase3、caspase6、caspase7基因的其它編碼區(qū)。

實(shí)施例3：

以caspase3、caspase6、aif1敲除的hek293細(xì)胞系cca1kohek293為例，該cca1kohek293細(xì)胞系結(jié)構(gòu)如下：

該hek293細(xì)胞系的caspase3、caspase6、aif1三個(gè)基因編碼區(qū)dna序列發(fā)生了變化，發(fā)生變化的基因組序列分別位于caspase3的第4個(gè)外顯子、caspase6的第2個(gè)外顯子、aif1的第10個(gè)外顯子，其它基因組序列與野生型hek293細(xì)胞相同。

發(fā)生變化的基因組序列如下：

caspase3allelea：

aaagatcatacatggaagcgaatcaatggactcatccctggacaacagttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtataataattaataataagaattttcataaaagcactg。

caspase3alleleb：

aaagatcatacatggaagcgaatcaatggactctggaatatccctggacttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtataataattaataataagaattttcataaaagcactg。

caspase6allelea：

tttttaataggtggaagaaaacatgacagaaacagatgccttctataaaag。

caspase6alleleb：

tttttaataggtggggaagaaaacatgacagaaacagatgcttctataaaag。

aif1allelea：

ctcgagccttgggcaagaagtgattcaactcttccccgagaaaggaaatatgggaaagatcctccccgaatacctcagcaactggaccatggaaaaagtcagacgag。

aif1alleleb：

ctcgagccttgggcacagaagtgattcaactcttccccgagaaaggaaatatgggaaagatcctccccgaatacctcagcaactggaccatggaaaaagtcgacgag。

發(fā)生變化的基因組dna序列也可位于caspase3、caspase6、aif1基因的其它編碼區(qū)。

實(shí)施例4：

以caspase3、caspase7、aif1敲除的hek293細(xì)胞系cca2kohek293為例，該cca2kohek293細(xì)胞系結(jié)構(gòu)如下：

該hek293細(xì)胞系的caspase3、caspase7、aif1三個(gè)基因編碼區(qū)dna序列發(fā)生了變化，發(fā)生變化的基因組序列分別位于caspase3的第6個(gè)外顯子、caspase7的第8個(gè)外顯子、aif1的第12個(gè)外顯子，其它基因組序列與野生型hek293細(xì)胞相同。

發(fā)生變化的基因組序列如下：

caspase3allelea：

tttctaaagaagatcacagcaagcagttttgtttgtgtgcttctgagccatggtgaagaaggaataatttttggaacaaatggacctgttgacctgaaaaaaataacaaactttttcagaggggatcgttgtagaagtctaactggaaaacccaaacttttcattattcag。

caspase3alleleb：

tttctaaagaagatcacagcaaaaggagcagttttgtttgtgtgcttctgagccatggtgaagaaggaataatttttggaacaaatggacctgttgacctgaaaaaaataacaaactttttcagaggggatcggatagaagtctaactggaaaacccaaacttttcattattcag。

caspase7allelea：

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caspase7alleleb：

gtatgggcgttcgaaagatgccgaggcgctcttcaagtgcttccgaagcctgggttttgacgtgattgtctataatgactgctcttgtgccaagatgcaagatctgcttaaaaaag。

aif1allelea：

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aif1alleleb：

gtagaaactgaccacatagtggcagctgtgggcctggagcccaatgttgagttggccaagactggtggcctggaaatagactcagattttggtggcttccgggtaaatgatggaaacagagctacaagcacgctctaacatctgggtg。

發(fā)生變化的基因組dna序列也可位于caspase3、caspase7、aif1基因的其它編碼區(qū)。

實(shí)施例5：

以caspase6、caspase7、aif1敲除的hek293細(xì)胞系cca3kohek293為例，該cca3kohek293細(xì)胞系結(jié)構(gòu)如下：

該hek293細(xì)胞系的caspase6、caspase7、aif1三個(gè)基因編碼區(qū)dna序列發(fā)生了變化，發(fā)生變化的基因組序列分別位于caspase6的第3個(gè)外顯子、caspase7的第7個(gè)外顯子、aif1的第11個(gè)外顯子，其它基因組序列與野生型hek293細(xì)胞相同。

發(fā)生變化的基因組序列如下：

caspase6allelea：

agaaatgtttgatccggcaagtacaaaatggaccacaggaggagaggaattgctttaatcttcaatcatgagaggttcttttggcacttaacactgccagaaaggcggggcacctgcgcagatagagacaatcttacccgcag。

caspase6alleleb：

agaaatgtttgatccggcagaaaagtacaaaatggaccacaggaggagaggaattgctttaatcttcaatcatgagaggttcttttggcacttaacactgccagaaaggcggggcacctgcgcagataagacaatcttacccgcag。

caspase7allelea：

cccctgactctggaactttatatttcaccagtaagaagaagaaaaatgtcaccatgcgatccatcaagaccacccgggaccgagtgcctacatatcagtacaatgaattttgaaaagctgggcaaatgcatcataataaacaacaagaactttgataaagtgacag。

caspase7alleleb：

cccctgactctggaactttatatttcaccagtaagaagaagaaaaatgtcaccatgcgatccatcaagaccacccgggaccgagtgcctacatatcagtacaacatgaattttgaaaagctggtgcatcataataaacaacaagaactttgataaagtgacag。

aif1allelea：

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aif1alleleb：

agggggttaaggtgatgcccaatgctattgtgcagttcaatccgttggagtcagcagtggcaagttacttatcaagctgaaagacggcaggaag。

發(fā)生變化的基因組dna序列也可位于caspase6、caspase7、aif1基因的其它編碼區(qū)。

實(shí)施例6：

以cccakohek293細(xì)胞系在bak蛋白表達(dá)中的應(yīng)用為例。

以人cdna文庫(kù)為模板，pcr擴(kuò)增獲得bak基因，用kpni和noti酶切并回收bak基因片段，與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pcdna3.1(+)(addgene購(gòu)買(mǎi))連接，獲得pcdna3.1/bak。

分別將1×10⁶cccakohek293細(xì)胞和hek293細(xì)胞鋪到60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24小時(shí)后，將12μgpcdna3.1/bak通過(guò)磷酸鈣共沉淀分別轉(zhuǎn)染cccakohek293細(xì)胞和hek293細(xì)胞，72小時(shí)后，收集細(xì)胞提取蛋白。

用于表達(dá)該蛋白的細(xì)胞系也可以是ccckohek293、cca1kohek293、cca2kohek293、cca3kohek293、cca4kohek293細(xì)胞系中的任意一種。

實(shí)施例7：

以攜帶bak基因的腺病毒在cccakohek293細(xì)胞中的包裝為例。

將用kpni和noti酶切回收的bak基因片段與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的腺病毒e1區(qū)穿梭載體pshuttle-cmv(addgene購(gòu)買(mǎi))連接，獲得pshuttle/cmv-bak。將12μgpshuttle/cmv-bak和8μg腺病毒骨架載體padeasy-1(addgene購(gòu)買(mǎi))混合后用2μlpaci酶切線性化，轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞(atcc購(gòu)買(mǎi))進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)染7-8天后顯微鏡下可見(jiàn)腺病毒病灶，即攜帶bak的腺病毒成功包裝。出現(xiàn)病灶后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融三次后離心取上清感染新的60mm培養(yǎng)皿中的hek293細(xì)胞。如此反復(fù)擴(kuò)增至10個(gè)150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的hek293細(xì)胞后，收集病毒，通過(guò)cscl2密度梯度離心純化腺病毒。

用于包裝該病毒的細(xì)胞系也可以是ccckohek293、cca1kohek293、cca2kohek293、cca3kohek293、cca4kohek293細(xì)胞系中的任意一種。

實(shí)施例8：

以攜帶trail基因的慢病毒在cccakohek293細(xì)胞中的包裝為例。

將猿猴病毒40大t抗原基因(sv40larget)通過(guò)kpni和noti位點(diǎn)克隆到pcdna3.1(+)載體，獲得pcdna3.1/larget。取8μgpcdna3.1/larget通過(guò)磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染到1×10⁶cccakohek293細(xì)胞后用400μg/mlg418篩選7-20天獲得穩(wěn)定表達(dá)sv40larget的細(xì)胞系cccakohek293t。

用xhoi和xbai酶切trail基因并回收，與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的慢病毒載體plenti-puro(addgene購(gòu)買(mǎi))連接，獲得攜帶trail基因的慢病毒載體plenti/trail。

取3μgplenti/trail、3μgprsv-rev(addgene購(gòu)買(mǎi))、3μgpmdlg/prre(addgene購(gòu)買(mǎi))通過(guò)磷酸鈣共沉淀共轉(zhuǎn)染1×10⁶cccakohek293t細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞上清獲得攜帶trail的慢病毒。

用于包裝該病毒的細(xì)胞系也可以是ccckohek293、cca1kohek293、cca2kohek293、cca3kohek293、cca4kohek293細(xì)胞系中的任意一種。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>陜西師范大學(xué)

<120>一種抗凋亡細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用

<160>

<210>1

<211>1766

<212>caspase3allelea（exon8）

<213>dna

<220>

<400>

catccagtcgctttgtgccatgctgaaacagtatgccgacaagcttgaatttatgcacattcttacccgggttaaccgaaaggtggcaacagaatttgagtccttttcctttgacgctacttttcatgcaaagaaacagattccatgtattgtttccatgctcacaaaagaactctatttttatcactaaagaaatggttggttggtggttttttttagtttgtatgccaagtgagaagatggtatatttggtactgtatttccctctcattttgacctactctcatgctgcagagggtactttaagacatactccttccatcaaatagaaccactatgaagctacctcaaacttccagtcaggtagttgcaattgaattaaattaggaataaataaaaatggatactggtgcagtcattatgagaggcaatgattgttaatttacagctttcatgattagcaagttacagtgatgctgtgctatgaattttcaagtaattgtgaaaaagttaaacattgaagtaatgaatttttatgatattccccccacttaagactgtgtattctagttttgtcaaactgtagaaatgatgatgtggaagaacttaggcatctgtgggcatggtcaaaggctcaaacctttattttagaattgatatacacggatgacttaactgcatttttagaccatttatctgggattatggttttgtgatgtttgtcctgaacacttttgttgtaaaaaaataataataatgtttaatattgagaaagaaactaatattttatgtgagagaaagtgtgagcaaactaacttgacttttaaggctaaaacttaacattcatagaggggtggagttttaactgtaaggtgctacaatgcccctggatctaccagcataaatatcttctgatttgtccctatgcatatcagttgagcttcatataccagcaatatatctgaagagctattatataaaaaccccaaactgttgattattagccaggtaatgtgaataaattctataggaacatatgaaaatacaacttaaataataaacagtggaatataaggaaagcaataaatgaatgggctgagctgcctgtaacttgagagtagatggtttgagcctgagcagagacatgactcagcctgttccatgaaggcagagccatggaccacgcaggaagggcctacagcccatttctccatacgcactggtatgtgtggatgatgctgccagggcgccatcgccaagtaagaaagtgaagcaaatcagaaacttgtgaagtggaaatgttctaaaggtggtgaggcaataaaaatcatagtactctttgtagcaaaattcttaagtatgttattttctgttgaagtttacaatcaaaggaaaatagtaatgttttatactgtttactgaaagaaaaagacctatgagcacataggactctagacggcatccagccggaggccagagctgagccctcagcccgggaggcaggctccaggcctcagcaggtgcggagccgtcactgcaccaagtctcactggctgtcagtatgacatttcacgggagatttcttgttgctcaaaaaatgagctcgcatttgtcaatgacagtttcttttttcttactagacctgtaacttttgtaaatacacatagcatgtaatggtatcttaaagtgtgtttctatgtgacaattttgtacaaatttgttattttccatttttatttcaaaatatacattcaaacttaaaatta。

<210>2

<211>1807

<212>caspase3alleleb（exon8）

<213>dna

<220>

<400>

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<210>3

<211>238

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<220>

<400>

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<210>4

<211>169

<212>caspase6alleleb（exon5）

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<220>

<400>

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<210>5

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<212>caspase7allelea（exon8）

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<220>

<400>

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<210>6

<211>128

<212>caspase7alleleb（exon8）

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<220>

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<210>7

<211>91

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>8

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<220>

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<213>dna

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<210>11

<211>387

<212>u6-sgrnabackbone片段

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<220>

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<210>12

<211>23

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>13

<211>23

<212>引物humancaspase3sgrna1reverse

<213>dna

<220>

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<210>15

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<210>16

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<210>17

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<212>引物humancaspase3sgrna3reverse

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<210>21

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<212>引物humancaspase6sgrna1reverse

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<220>

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<212>引物humancaspase6sgrna3for

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<220>

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<212>引物humancaspase6sgrna3reverse

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<212>引物humancaspase6sgrna4for

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<220>

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<220>

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<210>28

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<220>

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<210>29

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<212>引物humancaspase7sgrna1reverse

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<220>

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<210>30

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<212>引物humancaspase7sgrna2for

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<220>

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<210>31

<211>23

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<220>

<400>

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<210>32

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<212>引物humancaspase7sgrna3for

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<220>

<400>

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<210>33

<211>23

<212>引物humancaspase7sgrna3reverse

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<220>

<400>

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<210>34

<211>23

<212>引物humancaspase7sgrna4for

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<220>

<400>

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<210>35

<211>23

<212>引物humancaspase7sgrna4reverse

<213>dna

<220>

<400>

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<210>36

<211>23

<212>引物aif1sgrna1for

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<220>

<400>

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<210>37

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<220>

<400>

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<210>38

<211>23

<212>引物humanaif1sgrna2for

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<220>

<400>

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<210>39

<211>23

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<220>

<400>

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<210>40

<211>23

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<220>

<400>

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<210>41

<211>23

<212>引物humanaif1sgrna3reverse

<213>dna

<220>

<400>

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<210>42

<211>23

<212>引物humanaif1sgrna4for

<213>dna

<220>

<400>

accgctcagattttggtggcttc。

<210>43

<211>23

<212>引物humanaif1sgrna4reverse

<213>dna

<220>

<400>

aaacgaagccaccaaaatctgag。

<210>44

<211>5131

<212>cas9表達(dá)元件cmv-cas9-sv40pa

<213>dna

<220>

<400>

acgcgtgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatgccaccatggacaagaagtactccattgggctcgatatcggcacaaacagcgtcggctgggccgtcattacggacgagtacaaggtgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcataaagaagaacctcattggcgccctcctgttcgactccggggagacggccgaagccacgcggctcaaaagaacagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgcaggagatctttagtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggaggagtcctttttggtggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgtggacgaggtggcgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgtagacagtactgataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaaatttcggggacacttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaaactctttatccaactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgcatccggagttgacgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcgaaaacctcatcgcacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgccctgtcactcgggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaagcttcaactgagcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcggcgaccagtacgcagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgagtgatattctgcgagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaagcgctatgatgagcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaactgcctgagaagtacaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacattgacggcggagcaagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaatggacggcaccgaggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcgcactttcgacaatggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcctcaggcggcaagaggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaatcctcacatttcggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgcgtggatgactcgcaaatcagaagagaccatcactccctggaacttcgaggaagtcgtggataagggggcctctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcctaacgaaaaggtgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacgagctcaccaaggtcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggagagcagaagaaagctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaacagctcaaagaagactatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagtggaggatcgcttcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaagacaaggacttcctggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcacccttacgttgtttgaagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctcttcgacgacaaagtcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtcaagaaaactgatcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttcttaagtccgatggatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcacctttaaggaggacatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtcttcacgagcacatcgctaatcttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggtcgtggatgaactcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagatggcccgagagaaccaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagaggattgaagagggtataaaagaactggggtcccaaatccttaaggaacacccagttgaaaacacccagcttcagaatgagaagctctacctgtactacctgcagaacggcagggacatgtacgtggatcaggaactggacatcaatcggctctccgactacgacgtggatcatatcgtgccccagtcttttctcaaagatgattctattgataataaagtgttgacaagatccgataaaaatagagggaagagtgataacgtcccctcagaagaagttgtcaagaaaatgaaaaattattggcggcagctgctgaacgccaaactgatcacacaacggaagttcgataatctgactaaggctgaacgaggtggcctgtctgagttggataaagccggcttcatcaaaaggcagcttgttgagacacgccagatcaccaagcacgtggcccaaattctcgattcacgcatgaacaccaagtacgatgaaaatgacaaactgattcgagaggtgaaagttattactctgaagtctaagctggtctcagatttcagaaaggactttcagttttataaggtgagagagatcaacaattaccaccatgcgcatgatgcctacctgaatgcagtggtaggcactgcacttatcaaaaaatatcccaagcttgaatctgaatttgtttacggagactataaagtgtacgatgttaggaaaatgatcgcaaagtctgagcaggaaataggcaaggccaccgctaagtacttcttttacagcaatattatgaattttttcaagaccgagattacactggccaatggagagattcggaagcgaccacttatcgaaacaaacggagaaacaggagaaatcgtgtgggacaagggtagggatttcgcgacagtccggaaggtcctgtccatgccgcaggtgaacatcgttaaaaagaccgaagtacagaccggaggcttctccaaggaaagtatcctcccgaaaaggaacagcgacaagctgatcgcacgcaaaaaagattgggaccccaagaaatacggcggattcgattctcctacagtcgcttacagtgtactggttgtggccaaagtggagaaagggaagtctaaaaaactcaaaagcgtcaaggaactgctgggcatcacaatcatggagcgatcaagcttcgaaaaaaaccccatcgactttctcgaggcgaaaggatataaagaggtcaaaaaagacctcatcattaagcttcccaagtactctctctttgagcttgaaaacggccggaaacgaatgctcgctagtgcgggcgagctgcagaaaggtaacgagctggcactgccctctaaatacgttaatttcttgtatctggccagccactatgaaaagctcaaagggtctcccgaagataatgagcagaagcagctgttcgtggaacaacacaaacactaccttgatgagatcatcgagcaaataagcgaattctccaaaagagtgatcctcgccgacgctaacctcgataaggtgctttctgcttacaataagcacagggataagcccatcagggagcaggcagaaaacattatccacttgtttactctgaccaacttgggcgcgcctgcagccttcaagtacttcgacaccaccatagacagaaagcggtacacctctacaaaggaggtcctggacgccacactgattcatcagtcaattacggggctctatgaaacaagaatcgacctctctcagctcggtggagacagcagggctgaccccaagaagaagaggaaggtgtgacaccgcggggagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcasggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcccggctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctcttgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgaggtcgactctagtccccgcggtggcggtaccgaattcactagt。

<210>45

<211>1901

<212>puro-t2a-mcherry表達(dá)元件cmv-puro-t2a-mcherry

<213>dna

<220>

<400>

agatctgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatatggtgagcaagggcgaggaagacaacatggctatcatcaaagagttcatgcggttcaaggtccacatggagggctctgtcaacgggcacgagtttgaaatagaaggggaaggggaggggcggccctacgaaggaacccaaaccgccaagctgaaggttaccaaaggcgggcccctgccctttgcctgggacatactgtcccctcagtttatgtacggctctaaagcctatgttaaacatcctgccgatatacccgattatctgaagctctcttttccagaaggatttaaatgggagcgggtcatgaatttcgaggatggcggcgtggtgaccgtgacccaggattctagcctccaggatggggagtttatatataaggtgaagctgcggggaaccaatttcccaagcgacgggcctgtgatgcagaagaagacaatgggttgggaggccagctctgaacggatgtatcctgaggatggagccctgaagggtgagattaaacagaggctgaagctcaaggacggcggccattatgatgccgaagtaaaaacaacttacaaggctaagaagccagtccagctccccggcgcatataatgtcaatatcaaactggacattacttctcataatgaggactacacaatcgtggagcaatacgagcgggccgaaggcaggcattctaccggagggatggacgagctgtacaaggagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccccgggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtggacccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaactagt。

<210>46

<211>17

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>47

<211>17

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>48

<211>21

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>49

<211>20

<212>引物caspase3dnadetectionreverse

<213>dna

<220>

<400>

accaccaaccaaccatttct。

<210>50

<211>19

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>51

<211>19

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<220>

<400>

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<210>52

<211>20

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>53

<211>19

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>54

<211>31

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>55

<211>58

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<213>dna

<220>

<400>

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<210>56

<211>131

<212>實(shí)施例2中發(fā)生變化的基因組序列caspase3allelea

<213>dna

<220>

<400>

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<210>57

<211>127

<212>實(shí)施例2中發(fā)生變化的基因組序列caspase3alleleb

<213>dna

<220>

<400>

gaatgacatctcggtctggtacagatgtcgatgcagcaaacctcagggaaattcagaaacttgaaatatgaagtcaggaataaaaatgatcttacacgtgaagaaattgtggaattgatgcgtgatg。

<210>58

<211>156

<212>實(shí)施例2中發(fā)生變化的基因組序列caspase6allelea

<213>dna

<220>

<400>

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<210>59

<211>153

<212>實(shí)施例2中發(fā)生變化的基因組序列caspase6alleleb

<213>dna

<220>

<400>

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<210>60

<211>167

<212>實(shí)施例2中發(fā)生變化的基因組序列caspase7allelea

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<220>

<400>

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<210>61

<211>161

<212>實(shí)施例2中發(fā)生變化的基因組序列caspase7alleleb

<213>dna

<220>

<400>

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<210>62

<211>119

<212>實(shí)施例3中發(fā)生變化的基因組序列caspase3allelea

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<220>

<400>

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<210>63

<211>120

<212>實(shí)施例3中發(fā)生變化的基因組序列caspase3alleleb

<213>dna

<220>

<400>

aaagatcatacatggaagcgaatcaatggactctggaatatccctggacttataaaatggattatcctgagatgggtttatgtataataattaataataagaattttcataaaagcactg。

<210>64

<211>51

<212>實(shí)施例3中發(fā)生變化的基因組序列caspase6allelea

<213>dna

<220>

<400>

tttttaataggtggaagaaaacatgacagaaacagatgccttctataaaag。

<210>65

<211>52

<212>實(shí)施例3中發(fā)生變化的基因組序列caspase6alleleb

<213>dna

<220>

<400>

tttttaataggtggggaagaaaacatgacagaaacagatgcttctataaaag。

<210>66

<211>107

<212>實(shí)施例3中發(fā)生變化的基因組序列aif1allelea

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<220>

<400>

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<210>67

<211>107

<212>實(shí)施例3中發(fā)生變化的基因組序列aif1alleleb

<213>dna

<220>

<400>

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<210>68

<211>171

<212>實(shí)施例4中發(fā)生變化的基因組序列caspase3allelea

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<220>

<400>

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<210>69

<211>175

<212>實(shí)施例4中發(fā)生變化的基因組序列caspase3alleleb

<213>dna

<220>

<400>tttctaaagaagatcacagcaaaaggagcagttttgtttgtgtgcttctgagccatggtgaagaaggaataatttttggaacaaatggacctgttgacctgaaaaaaataacaaactttttcagaggggatcggatagaagtctaactggaaaacccaaacttttcattattcag。

<210>70

<211>128

<212>實(shí)施例4中發(fā)生變化的基因組序列caspase7allelea

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<400>

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<210>71

<211>116

<212>實(shí)施例4中發(fā)生變化的基因組序列caspase7alleleb

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<220>

<400>gtatgggcgttcgaaagatgccgaggcgctcttcaagtgcttccgaagcctgggttttgacgtgattgtctataatgactgctcttgtgccaagatgcaagatctgcttaaaaaag。

<210>72

<211>128

<212>實(shí)施例4中發(fā)生變化的基因組序列aif1allelea

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<220>

<400>

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<210>73

<211>148

<212>實(shí)施例4中發(fā)生變化的基因組序列aif1alleleb

<213>dna

<220>

<400>

gtagaaactgaccacatagtggcagctgtgggcctggagcccaatgttgagttggccaagactggtggcctggaaatagactcagattttggtggcttccgggtaaatgatggaaacagagctacaagcacgctctaacatctgggtg。

<210>74

<211>143

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<220>

<400>

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<210>75

<211>146

<212>實(shí)施例5中發(fā)生變化的基因組序列caspase6alleleb

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<220>

<400>75agaaatgtttgatccggcagaaaagtacaaaatggaccacaggaggagaggaattgctttaatcttcaatcatgagaggttcttttggcacttaacactgccagaaaggcggggcacctgcgcagataagacaatcttacccgcag。

<210>76

<211>166

<212>實(shí)施例5中發(fā)生變化的基因組序列caspase7allelea

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<220>

<400>

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<210>77

<211>163

<212>實(shí)施例5中發(fā)生變化的基因組序列caspase7alleleb

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<220>

<400>

cccctgactctggaactttatatttcaccagtaagaagaagaaaaatgtcaccatgcgatccatcaagaccacccgggaccgagtgcctacatatcagtacaacatgaattttgaaaagctggtgcatcataataaacaacaagaactttgataaagtgacag。

<210>78

<211>85

<212>實(shí)施例5中發(fā)生變化的基因組序列aif1allelea

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<220>

<400>

agggggttaaggtgatgcccaatgctattgtgccgttggagtcagcagtggcaagttacttatcaagctgaaagacggcaggaag。

<210>79

<211>94

<212>實(shí)施例5中發(fā)生變化的基因組序列aif1alleleb

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<220>

<400>

agggggttaaggtgatgcccaatgctattgtgcagttcaatccgttggagtcagcagtggcaagttacttatcaagctgaaagacggcaggaag。