本發(fā)明涉及一種外泌體、其制備方法及其在制備治療肺癌的藥物中的應用，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：隨著惡性腫瘤對人類生存健康的威脅日益嚴重，腫瘤診療的新模式、新方法也在不斷涌現(xiàn)。外泌體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制中扮演著重要角色，其在腫瘤學中是一個新興研究領(lǐng)域，近年來取得了很多突破，在腫瘤治療上具有較好前景。外泌體(exosome)是由多種活細胞分泌的囊泡小體，其中含有蛋白質(zhì)和rna等多種關(guān)鍵組分，外泌體在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，包括惡性腫瘤。外泌體可以用于腫瘤的免疫治療，rao等人的研究表明(raoetal，hepatology，2016)，腫瘤細胞來源的外泌體可以通過dc介導的免疫反應起到抑制肝癌動物模型和人類腫瘤生長的作用。另有研究證明(katakowskietal，cellmolecularneurobiology，2016)，由于外泌體直徑較小，可透過血腦屏障進入腦部血循環(huán)，外泌體可以將抗腫瘤的rna和蛋白質(zhì)帶入，對腦部原發(fā)性腫瘤發(fā)揮治療作用。此外，自然殺傷t細胞(nk細胞)也可以通過釋放含有穿孔素和顆粒酶的外泌體發(fā)揮直接抗腫瘤作用(luginietal，journalofimmunology，2012)。與腫瘤的免疫細胞治療相比，外泌體治療具有一定優(yōu)勢。helmlinger等人的研究表明(helmlingeretal，naturemedicine，1997)，對實體腫瘤進行免疫細胞治療的作用效果不顯著很大程度上是由于腫瘤的酸性微環(huán)境所引起；fischer等人的體外研究試驗也表明(fischeretal，clinicalimmunology，2000)，如果細胞外環(huán)境的ph為酸性，nk細胞和lak細胞的穿孔素/顆粒酶釋放，以及fas/fasl作用都會被抑制，這意味著這些免疫細胞無法充分發(fā)揮其細胞毒作用。然而有研究證實(parolinietal，journalofbiologicalchemistry，2009)，對于外泌體而言，酸性環(huán)境更有助于外泌體被腫瘤細胞攝取吸收，以進一步發(fā)揮外泌體的抗腫瘤生物學活性。以上說明，利用外泌體制備抗腫瘤藥物具有很大的應用前景。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-inducedkillercells，cik細胞)是由人外周血或臍帶血等來源的單個核細胞在體外用多種細胞因子與cd3抗體共同培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)細胞。cik細胞同時具有t淋巴細胞的抗腫瘤活性和nk細胞的非mhc限制性殺腫瘤活性的特點，被認為是腫瘤過繼免疫治療的新希望(朱子杰等人，醫(yī)藥衛(wèi)生：全文版，2016)?；A(chǔ)和臨床研究均表明，cik細胞在多種腫瘤的治療過程中均表現(xiàn)出一定療效，但關(guān)于cik細胞通過外泌體發(fā)揮治療作用還未見報道。krn7000是從海綿組織中分離得到的一種α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galactosylceramide)，其具有廣泛的生物活性。研究表明，krn7000是一種選擇性cdld蛋白的配體，通過活化nk細胞促進干擾素γ(ifn-γ)和白介素4(il-4)的釋放(馮俊娜等人，有機化學，2015)，在抗腫瘤、抗病毒、延緩或預防顯性糖尿病的發(fā)病等方面均發(fā)揮作用。但krn7000對于外泌體的作用未見報道。三磷酸腺苷(atp)在細胞內(nèi)提供代謝需要的能量，從而支持細胞的功能，如蛋白質(zhì)合成、細胞膜合成、細胞分化等。研究表明，atp可以誘導人巨噬細胞和嚙齒類動物胸腺細胞死亡(takenouchietal.，immunologyletters，2015)。p2x7受體是atp門控陽離子通道受體，其中p2x7受體信號通路與il-1β、il-6、cox-2等多種炎癥因子的生成和釋放相關(guān)，在多種疾病的發(fā)病過程中起到了至關(guān)重要的作用(guetal.，americanjournalofphysiology-cellphysiology，2000)。然而atp對于外泌體的作用仍未見到有相關(guān)研究。綜上，cik細胞來源外泌體的抗腫瘤活性仍未被充分證實。此外，將krn7000和atp協(xié)同作用于cik細胞的培養(yǎng)及其對cik細胞來源外泌體的活性作用未見報道。如何使用經(jīng)濟高效的方法在體外制備具有治療腫瘤活性的外泌體，并提高其臨床應用性，仍有待進一步研究。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種外泌體及其制備方法，該制備方法能夠提高外泌體的抗肺部腫瘤活性。本發(fā)明的目的還在于提供上述外泌體在制備治療肺癌的藥物中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明首先提供了一種外泌體的制備方法，其包括以下步驟：(1)培養(yǎng)第0天，將臍血單個核細胞按1×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)基中，以1000u/ml的添加量加入人重組干擾素γ，于37℃、5％co2條件下進行培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)第1天，以50ng/ml的添加量加入抗cd3單克隆抗體、以300u/ml的添加量加入人重組白介素2，刺激細胞的生長和增殖；(3)培養(yǎng)第3天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(4)培養(yǎng)第7天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(5)培養(yǎng)第14天，在無血清培養(yǎng)基中加入atp儲存液使atp的終濃度達到4mm，孵育30分鐘后，收獲細胞培養(yǎng)液的上清液并提取得到所述外泌體；該方法還包括：在步驟(2)中以35ng/ml的添加量加入krn7000，在步驟(4)中加入krn7000和atp儲存液，krn7000的添加量為70ng/ml，atp的終濃度為4mm；或者，在步驟(1)中以35ng/ml的添加量加入krn7000，在步驟(4)中加入krn7000和atp儲存液，krn7000的添加量為35ng/ml，atp的終濃度為4mm；或者，在步驟(2)中以35ng/ml的添加量加入krn7000，在步驟(4)中以35ng/ml的添加量加入krn7000；或者，在步驟(1)中以35ng/ml的添加量加入krn7000。在上述制備方法，所采用的無血清培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域常用的無血清培養(yǎng)基；“據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液”中的半量換液可以根據(jù)常規(guī)方式進行，一般是在第3、5、7、9、11、13天進行；如果沒有特殊說明，所有的濃度、添加量均以無血清培養(yǎng)基的體積為基準進行計算，半量換液之后補加人重組白介素2時也是以無血清培養(yǎng)基的總體積為基準進行計算。在本發(fā)明提供的外泌體的制備方法中，細胞由臍血單個核細胞誘導獲得，其中在細胞培養(yǎng)的過程中加入krn7000、atp儲存液，可以有效增強外泌體的細胞毒性作用，大大增強其殺傷腫瘤細胞的作用效果。根據(jù)本發(fā)明的第一種優(yōu)選技術(shù)方案，上述制備方法可以包括以下具體步驟：(1)培養(yǎng)第0天，將臍血單個核細胞按1×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)基中，以1000u/ml的添加量加入人重組干擾素γ，于37℃、5％co2條件下進行培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)第1天，以50ng/ml的添加量加入抗cd3單克隆抗體、以300u/ml的添加量加入人重組白介素2、以35ng/ml的添加量加入krn7000，刺激細胞的生長和增殖；(3)培養(yǎng)第3天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(4)培養(yǎng)第7天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2、以70ng/ml的添加量加入krn7000，并加入atp儲存液使atp的終濃度達到4mm；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并補加300u/ml的人重組白介素2；(5)培養(yǎng)第14天，在培養(yǎng)基中加入atp儲存液使atp的終濃度達到4mm，孵育30分鐘后，收獲細胞培養(yǎng)液的上清液并提取得到所述外泌體。根據(jù)本發(fā)明的第二種優(yōu)選技術(shù)方案，上述制備方法可以包括以下具體步驟：(1)培養(yǎng)第0天，將臍血單個核細胞按1×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)基中，以1000u/ml的添加量加入人重組干擾素γ、以35ng/ml的添加量加入krn7000，于37℃、5％co2條件下進行培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)第1天，以50ng/ml的添加量加入抗cd3單克隆抗體、以300u/ml的添加量加入人重組白介素2，刺激細胞的生長和增殖；(3)培養(yǎng)第3天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(4)培養(yǎng)第7天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2、以35ng/ml的添加量加入krn7000，并加入atp儲存液使atp的終濃度達到4mm；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(5)培養(yǎng)第14天，在培養(yǎng)基中加入atp儲存液使atp的終濃度達到4mm，孵育30分鐘后，收獲細胞培養(yǎng)液的上清液并提取得到所述外泌體。根據(jù)本發(fā)明的第三種優(yōu)選技術(shù)方案，上述制備方法可以包括以下具體步驟：(1)培養(yǎng)第0天，將臍血單個核細胞按1×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)基中，以1000u/ml的添加量加入人重組干擾素γ，于37℃、5％co2條件下進行培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)第1天，以50ng/ml的添加量加入抗cd3單克隆抗體、以300u/ml的添加量加入人重組白介素2、以35ng/ml的添加量加入krn7000，刺激細胞的生長和增殖；(3)培養(yǎng)第3天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(4)培養(yǎng)第7天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2、以35ng/ml的添加量加入krn7000；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(5)培養(yǎng)第14天，在培養(yǎng)基中加入atp儲存液使atp的終濃度達到4mm，孵育30分鐘后，收獲細胞培養(yǎng)液的上清液并提取得到所述外泌體。根據(jù)本發(fā)明的第四種優(yōu)選技術(shù)方案，上述制備方法可以包括以下具體步驟：(1)培養(yǎng)第0天，將臍血單個核細胞按1×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)基中，以1000u/ml的添加量加入人重組干擾素γ、以35ng/ml的添加量加入krn7000，于37℃、5％co2條件下進行培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)第1天，以50ng/ml的添加量加入抗cd3單克隆抗體、以300u/ml的添加量加入人重組白介素2，刺激細胞的生長和增殖；(3)培養(yǎng)第3天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(4)培養(yǎng)第7天，半量換液并以300u/ml的添加量加入人重組白介素2；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并以300u/ml的添加量補加人重組白介素2；(5)培養(yǎng)第14天，在培養(yǎng)基中加入atp儲存液使atp的終濃度達到4mm，孵育30分鐘后，收獲細胞培養(yǎng)液的上清液并提取得到所述外泌體。在上述的制備方法中，優(yōu)選地，外泌體的提取按照以下步驟進行：收集20ml所述細胞培養(yǎng)液的上清液，于2000×g離心30min，取上清液，棄去細胞碎片等沉淀；于4℃、10000×g離心60min，得到含外泌體的濃縮液；將所述含外泌體的濃縮液于4℃、100000×g離心60min，收集底部沉淀；將所得沉淀采用pbs緩沖液重懸，再次于100000×g離心60min，收集底部沉淀，即為外泌體；將所得外泌體用2ml的pbs緩沖液重懸，采用0.22μm濾膜過濾除菌，并于-80℃儲存。本發(fā)明還提供了一種外泌體，其是由上述制備方法制備的。該外泌體能夠有效促進小細胞肺癌細胞的死亡。本發(fā)明還提供了上述外泌體在制備治療肺癌的藥物中的應用，優(yōu)選地，所述肺癌為小細胞肺癌。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所提供的制備方法得到的外泌體具有抗肺部腫瘤活性，具有殺傷肺癌細胞的作用。本發(fā)明所提供的制備方法是高效地在體外制備外泌體的方法，可以有效增強外泌體的細胞毒性作用，進一步增強其抗肺部腫瘤活性。附圖說明圖1a-圖1j為流式細胞術(shù)檢測結(jié)果。圖2為細胞培養(yǎng)增殖曲線。圖3為外泌體特異性標志物cd63表達水平的柱狀圖。圖4為外泌體fasl表達水平的柱狀圖。圖5為外泌體穿孔素表達水平的柱狀圖。圖6為nci-h446細胞死亡百分比的柱狀圖。具體實施方式為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更清楚的理解，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行以下詳細說明，但不能理解為對本發(fā)明的可實施范圍的限定。實施例1cik細胞的培養(yǎng)1.臍血單個核細胞提?。喝「嗡乜鼓迈r臍血，采用ficoll-hypaque法分離臍血單個核細胞(cbmnc)。將臍血與磷酸鹽緩沖液(pbs溶液)等體積混合，并按1∶1的體積比緩慢加入到ficoll-hypaque(購自ge公司)中，于20℃、400×g離心25min；小心吸取離心管中的cbmnc條帶層，用pbs溶液重懸，并于200×g離心15min；去除上清液，將沉淀用pbs溶液重懸，并于200×g離心15min，即獲得臍血單個核細胞。2.細胞培養(yǎng)：按照不同分組，將上述cbmnc進行重懸培養(yǎng)，分組情況及各種成分的添加量(atp對應的是終濃度)、加入時機見表1。其中：各組均采用無血清培養(yǎng)基(購自lonza公司)，在其中加入人重組干擾素γ(rhifn-γ，購自北京四環(huán)生物制藥有限公司)、人重組白介素2(rhil-2，購自北京四環(huán)生物制藥有限公司)、抗cd3單克隆抗體(購自peprotech公司)；并根據(jù)分組不同，在培養(yǎng)體系中加入krn7000(購自abcam公司)和atp(購自sigma公司)；培養(yǎng)第0天，將cbmnc按1×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)體系中加入重組人ifn-γ；或加入重組人ifn-γ并同時加入krn7000(添加量為35ng/ml或70ng/ml)，于37℃、5％(體積濃度)co2條件下進行培養(yǎng)；24h后，即培養(yǎng)第1天，加入cd3單克隆抗體和重組人il-2；或在加入重組人il-2的同時加入krn7000(添加量為35ng/ml或70ng/ml)，刺激細胞的生長和增殖；培養(yǎng)第3天，半量換液并加入重組人il-2；或在加入重組人il-2的同時加入atp儲存液，使atp達到表1所示的終濃度；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并補加重組人il-2；培養(yǎng)第7天，半量換液并加入重組人il-2；或在加入重組人il-2的同時加入krn7000(添加量為35ng/ml或70ng/ml)；或在加入重組人il-2的同時加入krn7000(添加量為35ng/ml或70ng/ml)和atp儲存液，使atp達到表1所示的終濃度；根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，每隔一天進行半量換液，并補加重組人il-2；培養(yǎng)第14天，部分分組在培養(yǎng)基中加入atp儲存液使atp達到4mm的終濃度，孵育30分鐘后，即收獲細胞培養(yǎng)的上清液并按實施例2中的操作提取外泌體，其為cik細胞來源的外泌體，細胞部分進行流式細胞檢測(如圖1a-圖1j所示，分別對應分組a-j)并繪制增殖曲線(圖2)。表1細胞培養(yǎng)分組將需要檢測的細胞懸液分別取細胞數(shù)1×106的目的細胞至各個流式管。設(shè)置離心力為350g，離心時間為5min進行離心。離心結(jié)束后，平穩(wěn)取出離心管，棄去上清液，加入100μlpbs溶液重懸細胞。分別將每組細胞懸液添加相應帶熒光標簽的抗體進行染色，添加抗體后避光孵育20min。孵育結(jié)束后每個流式管添加2mlpbs溶液，設(shè)置離心力為350g，離心時間為5min進行離心洗滌。離心結(jié)束后，棄去上清液，每管添加500μlpbs，于1h內(nèi)上流式細胞儀檢測。流式細胞儀上樣時，使用對照組分別對各個電壓進行調(diào)節(jié)，使添加cd3抗體組的細胞均調(diào)節(jié)位于cd56陰性部分，同理添加cd56抗體組的細胞均位于cd3陰性部分，未添加抗體組的細胞均位于cd3/cd56雙陰性門中，調(diào)節(jié)完成后對檢測組進行上樣檢測。流式檢測分析時于fsc/ssc中圈取淋巴細胞設(shè)門，對淋巴細胞群進行cd3/cd56分析，其中cik細胞為cd3+/cd56+雙陽性部分。細胞觀察形態(tài)學及繪制增殖曲線：在培養(yǎng)過程中，每天觀察細胞培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化，在倒置顯微鏡下觀察細胞的狀態(tài)、體積、胞漿和胞核變化。于培養(yǎng)的第3、7、9、11、14天用臺盼藍染色計數(shù)不同培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時間的活細胞數(shù)(具體數(shù)據(jù)見表2)，繪制增殖曲線。表2cik細胞培養(yǎng)在不同時間下的增殖個數(shù)實施例2cik細胞來源外泌體的提取和鑒定1.外泌體的提取對按照表1中的分組得到的細胞培養(yǎng)液分別提取外泌體，具體為：收集上述細胞培養(yǎng)液上清液20ml，于2000×g離心30min，取上清液，棄去細胞碎片等沉淀；于4℃、10000×g離心60min，得到含外泌體的濃縮液；將上述濃縮液于4℃、100000×g離心60min，收集底部沉淀；將所得沉淀采用pbs緩沖液重懸，再次于100000×g離心60min，收集底部沉淀，即為cik細胞外泌體；將所得外泌體用2ml的pbs緩沖液重懸，采用0.22μm濾膜過濾除菌，并于-80℃儲存。2.外泌體的鑒定①外泌體的形態(tài)學觀察：將上述所得到的外泌體溶液充分混勻，經(jīng)脫水、干燥、粘樣、導電處理，在掃描電鏡下觀察微粒形態(tài)：各組cik細胞外泌體直徑約均為50-100nm，符合外泌體特征；各組外泌體的形態(tài)沒有顯著的差異，表明krn7000和atp應用于cik細胞的培養(yǎng)時，對cik細胞外泌體的形態(tài)沒有顯著的影響。實驗結(jié)果還表明，h組和g組的外泌體密度高于其他各組，而d組和e組的外泌體密度低于其他各組，表明在第0天或第1天加入小劑量的krn7000(35ng/ml)，第7天加入krn7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入atp激活，同時在第14天再次加入atp激活，可以有效增加外泌體的密度；而當?shù)?天或第1天加入大劑量的krn7000(70ng/ml)，第7天與第14天重復與h組或g組相同的操作時，反而使外泌體密度降低；若不于第7天加入krn7000并加入atp激活，則各組外泌體密度與對照組a組相比沒有明顯的差異。②外泌體標志物cd63檢查：采用蛋白免疫印跡法檢測外泌體的特異表達蛋白cd63的表達情況。采用ripa裂解液(購自碧云天生物技術(shù)有限公司)對各組cik細胞外泌體進行蛋白裂解30min，采用勻漿器(型號ikat10)進行蛋白勻漿(15s×3次)；靜置30min后，將上述勻漿液于4℃、12000g離心15分鐘；采用bca試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)有限公司)進行蛋白定量，將總蛋白濃度調(diào)至同一水平；加入5×上樣緩沖液(16％甘油、20％-巰基乙醇、2％十二烷基磺酸鈉、0.05％溴酚藍)，煮沸5min；將上述溶液上樣，于80v電壓經(jīng)縮膠電泳約30min，于120v電壓經(jīng)分離膠電泳約60min；經(jīng)電轉(zhuǎn)移(250ma，2h)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜(購自millipore)，采用封閉液(含5％bsa的tbst溶液)于室溫封閉1h。將上述pvdf膜分別與兔抗人cd63抗體(購自abcam)于4℃孵育過夜后，采用tbst洗膜3次；之后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔igg二抗于室溫孵育1h后，采用tbst洗膜3次；加入ecl化學發(fā)光底物(購自abcam)，采用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(bio-rad)進行檢測。實驗結(jié)果表3和圖3所示。各實驗組外泌體的cd63表達均顯著高于cik組(p＜0.01)，說明cik細胞外泌體高表達外泌體特異性蛋白cd63，符合外泌體的特征。與a組比較發(fā)現(xiàn)，g組和h組的cd63改變倍數(shù)顯著增高(p＜0.05)；d組和e組雖然沒有統(tǒng)計學差異，但有降低的趨勢；b、c、f、i、j組與a組相比有一定量的增加，但均沒有統(tǒng)計學差異。這些結(jié)果表明，在第0天或第1天加入小劑量的krn7000(35ng/ml)，第7天加入krn7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入atp激活，同時在第14天再次加入atp激活，可以有效增加外泌體特異性蛋白的表達量；而當?shù)?天或第1天加入大劑量的krn7000(70ng/ml)，第7天與第14天重復與h組或g組相同的操作時，反而使外泌體特異性蛋白表達量降低；若不于第7天加入krn7000并加入atp激活，則各組外泌體特異性蛋白的改變不顯著。表3外泌體特異性標志物的表達量分組cd63改變倍數(shù)值標準差cik組1.000.31a組12.30*2.11b組12.67*2.33c組13.53*1.97d組11.81*2.16e組12.18*3.10f組14.76*1.92g組16.97*#1.44h組17.71*#2.21i組14.51*1.89j組13.28*1.41實施例3krn7000和atp對cik細胞外泌體細胞毒性蛋白表達的影響采用蛋白質(zhì)免疫法檢測外泌體中fasl和穿孔素(perforin)的水平：采用ripa裂解液對各組外泌體進行蛋白裂解30min，采用勻漿器進行蛋白勻漿(15s×3次)；靜置30min后，將上述勻漿液于4℃、12,000g離心15分鐘；采用bca試劑盒進行蛋白定量，將總蛋白濃度調(diào)至同一水平；加入5×上樣緩沖液，煮沸5min；將上述溶液上樣，于80v電壓經(jīng)縮膠電泳約30min，于120v電壓經(jīng)分離膠電泳約60min；經(jīng)電轉(zhuǎn)移(250ma，2h)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf膜，采用封閉液于室溫封閉1h；將上述pvdf膜分別與兔抗fasl抗體、兔抗穿孔素抗體(購自abcam)于4℃孵育過夜后，采用tbst洗膜(10min×3次)；之后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔igg二抗于室溫孵育1h后，采用tbst洗膜(10min×3次)；加入ecl化學發(fā)光底物，采用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行檢測。實驗結(jié)果表4和圖4、圖5所示。分析fasl實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與a組相比，g組和h組的fasl水平顯著增高(p＜0.01)，f組的fasl水平顯著增高(p＜0.05)；d組(p＜0.05)和e組(p＜0.01)的fasl水平顯著降低；b、c、i、j組與a組相比有一定量的增加，但均沒有統(tǒng)計學差異。分析perforin實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與a組相比，g組和h組的perforin水平顯著增高(p＜0.01)；d組perforin水平顯著降低(p＜0.05)，e組perforin水平降低，但差異未達到顯著水平(p＝0.06)；b、c、f、i、j組與a組相比有一定量的增加，但均沒有統(tǒng)計學差異。這些結(jié)果表明，在第0天或第1天加入小劑量的krn7000(35ng/ml)，第7天加入krn7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入atp激活，同時在第14天再次加入atp激活，可以有效增加cik細胞外泌體細胞毒性蛋白fasl和perforin水平；而當?shù)?天或第1天加入大劑量的krn7000(70ng/ml)，第7天與第14天重復與h組或g組相同的操作時，反而使細胞毒性蛋白fasl和perforin表達量降低；當于第1天加入小劑量的krn7000(35ng/ml)，第7天再次加入小劑量的krn7000(35ng/ml)，并于第14天加入atp激活，可以在一定程度上增加fasl水平，但不能顯著增加perforin水平，說明其細胞毒性物質(zhì)分泌的促進作用有限。表4fasl和穿孔素的表達量分組fasl改變倍數(shù)值標準差穿孔素改變倍數(shù)值標準差a組1.000.081.000.07b組1.030.210.960.16c組1.120.161.070.13d組0.82*0.230.73*0.28e組0.75**0.320.890.22f組1.20*0.191.160.12g組1.33**0.221.41**0.11h組1.32**0.151.34**0.19i組1.180.221.090.16j組1.080.131.010.11實施例4krn7000和atp對cik細胞外泌體抗肺部腫瘤生物學活性的作用采用人小細胞肺癌細胞系nci-h446與外泌體共培養(yǎng)，確定cik細胞外泌體殺傷腫瘤細胞的生物學活性；采用碘化丙啶(pi)染色的流式細胞技術(shù)檢測肺部腫瘤細胞的死亡情況：取相同體積的各組cik細胞培養(yǎng)上清液，按實施例2的方法提取外泌體，將外泌體與nci-h446細胞混合(細胞數(shù)5×103)，并于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)條件為溫度37℃、5％(體積濃度)co2；培養(yǎng)后第12小時收集培養(yǎng)物，于pbs中洗滌，并于室溫與pi(20mg/ml)孵育10min，之后于pbs中洗滌；將上述細胞與1％多聚甲醛混合，并采用流式細胞檢測技術(shù)進行分析，其中，細胞毒性表示方法為：死亡細胞數(shù)/(死亡細胞數(shù)+存活細胞數(shù))×100％。實驗結(jié)果如表5和圖6所示。d組、e組的細胞死亡率顯著高于a組(p＜0.05)，表明其殺傷腫瘤細胞的作用降低；g組(p＜0.05)和h組(p＜0.01)細胞死亡率顯著高于a組，表明其殺傷腫瘤細胞的作用增強；其他各組細胞死亡率與a組相比沒有顯著性差異。表5nci-h446細胞死亡百分比分組細胞死亡率標準差a組40.2％3.2％b組42.2％5.1％c組40.6％6.2％d組32.2％*5.9％e組29.8％*7.3％f組47.9％4.0％g組51.5％*7.1％h組52.7％**8.3％i組41.4％5.3％j組43.9％4.9％這些結(jié)果表明，在第0天或第1天加入小劑量的krn7000(35ng/ml)，第7天加入krn7000(35ng/ml或70ng/ml)并加入atp激活，同時在第14天再次加入atp激活，可以有效增強cik細胞外泌體的殺傷腫瘤細胞的活性；而當?shù)?天或第1天加入大劑量的krn7000(70ng/ml)，第7天與第14天重復與h組或g組相同的操作時，反而使cik細胞外泌體的殺傷腫瘤細胞的活性降低；若不于第7天加入krn7000并加入atp激活，則各組外泌體殺傷腫瘤細胞的作用沒有顯著差異。當前第1頁12