本發(fā)明涉及一種瑞鮑迪苷d的提取方法，具體涉及一種從甜菊糖苷精制母液中提取高純度瑞鮑迪苷d的方法。

背景技術：

甜菊糖苷中的主要糖苷有甜菊苷（st）和瑞鮑迪苷a（ra），其他已知糖苷包括瑞鮑迪苷b（rb）、瑞鮑迪苷c（rc）、瑞鮑迪苷d（rd）、瑞鮑迪苷f（rf）、杜克苷a、甜茶苷和甜菊雙糖苷。

近年來研究發(fā)現，甜菊糖苷中口感最好的成分不是甜度最高的ra，而是rd，rd的甜度大約是蔗糖的150倍，口感好，無苦澀味，但是，rd在甜葉菊中的含量很低，僅1%左右，因此，想要高回收率的提取高純度的rd較為困難。

cn102060892a公開了一種甜菊糖甙rd的提純方法，是將母液糖料液流過大孔吸附樹脂，再用乙醇洗脫，分段收集洗脫液，濃縮，干燥，精制，得到rd。但是，由于大孔樹脂的吸附選擇性差，通過分段洗脫，通過確定臨界點的方法收集rd的可操作性較低，rd難以富集，因此，rd的收率不高。

cn102406113a公開了一種ra和rd復配甜菊糖的制備方法，是以甜葉菊為原料，通過水提取，大孔樹脂吸附，洗脫，脫色，結晶，重結晶等步驟，得到ra和rd的混合產品。但是，該方法無法獲得高含量的rd。

cn103709215a公開了一種從甜菊糖結晶母液糖中提取萊鮑迪甙d的方法，是將甜菊糖母液糖用水和甲醇保溫，攪拌，反復結晶，得到rd產品。但是，該方法因結晶次數過多，收率較低，且rd的純度僅50%左右。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是，克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種所得產品純度、收率高，產品附加值高，綠色環(huán)保，成本低，適用于工業(yè)化生產的從甜菊糖苷精制母液中提取高純度瑞鮑迪苷d的方法。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案如下：一種從甜菊糖苷精制母液中提取高純度瑞鮑迪苷d的方法，包括以下步驟：

（1）結晶除雜：將甜菊糖苷精制母液加入醇溶液中，加熱溶解，冷卻析晶，過濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液減壓濃縮至無醇，在濃縮液中加入反相硅膠，混合均勻，干燥至恒重，得拌樣硅膠；

（3）裝柱：在空層析柱中，先裝入反相硅膠，再在反相硅膠上裝入步驟（2）所得拌樣硅膠；

（4）洗脫：用洗脫劑對步驟（3）裝柱后的層析柱進行洗脫，收集目標洗脫流出液，濃縮，干燥，得瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得瑞鮑迪苷d粗品用有機溶劑或水加熱溶解，冷卻，析晶，過濾，干燥，得瑞鮑迪苷d精品。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述甜菊糖苷精制母液中瑞鮑迪苷d的質量含量為5～30%（更優(yōu)選6～10%）。本發(fā)明所述甜菊糖苷精制母液來源于以甜葉菊提取物為原料，用有機溶劑結晶制備高純瑞鮑迪苷a（ra）、甜菊苷（st）時所產生的母液。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述醇溶液的用量為甜菊糖苷精制母液質量的4～20倍（更優(yōu)選5～10倍）。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述醇溶液中的醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇等中的一種或幾種，醇溶液的體積濃度為50～99%。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述加熱溶解的溫度為40～60℃。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述冷卻析晶的溫度為10～25℃，時間為12～24h。

步驟（1）中，析晶過濾后的濾渣中含有高含量的ra和st，可用現有技術對這兩種原料進行提取。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述減壓濃縮的溫度為60～90℃，真空度為-0.06～-0.09mpa。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述干燥的溫度為60～90℃。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述反相硅膠的用量為濃縮液質量的1～2倍。拌樣的目的是使物料能和反相硅膠充分吸附；若反相硅膠的用量過少，則物料無法完全吸附；若反相硅膠的用量過多，則易造成浪費并增加洗脫的難度。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述反相硅膠的類型為c4、c8或c18等中的一種或幾種。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述反相硅膠的用量為拌樣硅膠質量的1～20倍（更優(yōu)選5～15倍）。先加入反相硅膠的目的是，提供一個緩沖區(qū)域，使洗脫過程中各種成分在反相硅膠中保留不同的時間。若反相硅膠的用量過少，則各種成分保留的相對時間太接近，無法達到分離的目的；若反相硅膠的用量過多，則易造成浪費并增加洗脫劑的用量。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述層析柱的高徑比為5～20:1。若高徑比過小，則分離的效果差；若高徑比過大，將增加洗脫劑的用量和洗脫的時間。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述洗脫劑的用量為2～10bv，洗脫的流速為0.5～2.0bv/h。所述1bv=1個柱床體積。所述目標洗脫流出液是通過薄層層析檢測含有瑞鮑迪苷d的洗脫流出液段。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述洗脫劑為體積濃度40～95%（更優(yōu)選50～80%）的甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、乙腈、乙酸、丙酮、乙酸乙酯溶液或水等中的一種或幾種。

優(yōu)選地，步驟（4）中，濃縮至無溶劑，干燥至恒重。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述有機溶劑或水的用量為瑞鮑迪苷d粗品質量的4～20倍（更優(yōu)選4.5～10倍）。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述有機溶劑為體積濃度40～95%（更優(yōu)選60～90%）的甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮或乙酸乙酯溶液等中的一種或幾種。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述加熱溶解的溫度為40～60℃。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述析晶的溫度為10～25℃，時間為12～24h。

本發(fā)明方法的原理為：由于甜菊糖苷精制母液中rd的含量普遍不高，用醇溶解后難以達到rd可以結晶的濃度，rd不會結晶析出，而其它雜質成分，如ra和st的含量高，則可以在醇溶液中大量結晶析出，先將析出的雜質過濾之后，絕大部分rd就留在了結晶母液中，由此提高了rd的含量，降低了后續(xù)反相硅膠柱層析的難度。反相硅膠的特性之一是在洗脫過程中，極性大的成分先流出，極性小的成分后流出，rd是所有甜菊糖苷中極性最大的，因此，在反相硅膠柱的洗脫中是最先流出的，由此可以高效的將rd和其它糖苷分離，最后通過重結晶，得到高純度的rd精品。

本發(fā)明方法的有益效果如下：

（1）本發(fā)明方法可以從廉價的甜菊糖苷精制母液中提取出高純度的rd，所得rd精品呈白色結晶性粉末，經高效液相色譜法檢測，rd的純度可高達99.0wt%，rd的最終收率可高達92.4%，提高了甜葉菊資源的利用率；

（2）本發(fā)明方法原料天然，所采用的物理提取方式，生產過程綠色環(huán)保，成本低，產品純凈、無污染，rd的售價是原料的10倍以上，產品附加值高，適用于工業(yè)化生產。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明實施例所使用的甜菊糖苷精制母液來源于湖南華誠生物資源股份有限公司以甜葉菊提取物為原料，用有機溶劑結晶制備高純ra、st時所產生的母液，經高效液相色譜外標法檢測，rd的質量含量為6.5%；本發(fā)明實施例所使用的c4、c8和c18反相硅膠均購于大連依利特分析儀器有限公司；本發(fā)明實施例所使用的原料或化學試劑，如無特殊說明，均通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

實施例1

（1）結晶除雜：將100g甜菊糖苷精制母液加入500g體積濃度為80%的乙醇溶液中，在40℃下，加熱溶解，然后再在25℃下，冷卻析晶16h，過濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液在65℃，真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮至無醇，得60g濃縮液，在60g濃縮液中加入c4反相硅膠60g，混合均勻，在70℃下，干燥至恒重，得100g拌樣硅膠；

（3）裝柱：在高徑比為15:1的空層析柱中，先裝入1000gc4反相硅膠，再在c4反相硅膠上裝入步驟（2）所得100g拌樣硅膠；

（4）洗脫：用3bv，體積濃度為70%的乙腈溶液對步驟（3）裝柱后的層析柱，在0.5bv/h的流速下，進行洗脫，通過薄層層析檢測，收集含有瑞鮑迪苷d的目標洗脫流出液，濃縮至無乙腈，干燥至恒重，得7.6g瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得7.6g瑞鮑迪苷d粗品用38g體積濃度為85%的甲醇溶液，在50℃下，加熱溶解，冷卻至室溫，在10℃下，析晶24h，過濾，干燥，得6.1g瑞鮑迪苷d精品。

本實施例所得瑞鮑迪苷d精品呈白色結晶性粉末，經高效液相色譜外標法檢測，所得瑞鮑迪苷d精品的純度為98.5wt%，瑞鮑迪苷d的最終收率為92.4%。

實施例2

（1）結晶除雜：將50g甜菊糖苷精制母液加入300g體積濃度為55%的異丙醇溶液中，在60℃下，加熱溶解，然后再在15℃下，冷卻析晶12h，過濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液在85℃，真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮至無醇，得35g濃縮液，在35g濃縮液中加入c8反相硅膠70g，混合均勻，在90℃下，干燥至恒重，得82g拌樣硅膠；

（3）裝柱：在高徑比為10:1的空層析柱中，先裝入440gc8反相硅膠，再在c8反相硅膠上裝入步驟（2）所得82g拌樣硅膠；

（4）洗脫：用5bv，體積濃度為60%的甲醇溶液對步驟（3）裝柱后的層析柱，在1bv/h的流速下，進行洗脫，通過薄層層析檢測，收集含有瑞鮑迪苷d的目標洗脫流出液，濃縮至無甲醇，干燥至恒重，得3.9g瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得3.9g瑞鮑迪苷d粗品用30g體積濃度為90%的乙醇溶液，在55℃下，加熱溶解，冷卻至室溫，在10℃下，析晶18h，過濾，干燥，得2.95g瑞鮑迪苷d精品。

本實施例所得瑞鮑迪苷d精品呈白色結晶性粉末，經高效液相色譜外標法檢測，所得瑞鮑迪苷d精品的純度為99.0wt%，瑞鮑迪苷d的最終收率為89.9%。

實施例3

（1）結晶除雜：將1kg甜菊糖苷精制母液加入8kg體積濃度為95%的甲醇溶液中，在50℃下，加熱溶解，然后再在20℃下，冷卻析晶24h，過濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液在60℃，真空度為-0.09mpa下，減壓濃縮至無醇，得650g濃縮液，在650g濃縮液中加入c18反相硅膠650g，混合均勻，在75℃下，干燥至恒重，得1.1kg拌樣硅膠；

（3）裝柱：在高徑比為20:1的空層析柱中，先裝入16.5kgc18反相硅膠，再在c18反相硅膠上裝入步驟（2）所得1.1kg拌樣硅膠；

（4）洗脫：用10bv，體積濃度為50%的乙醇溶液對步驟（3）裝柱后的層析柱，在1.5bv/h的流速下，進行洗脫，通過薄層層析檢測，收集含有瑞鮑迪苷d的目標洗脫流出液，濃縮至無乙醇，干燥至恒重，得77g瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得77g瑞鮑迪苷d粗品用380g體積濃度為60%的正丁醇溶液，在55℃下，加熱溶解，冷卻至室溫，在25℃下，析晶24h，過濾，干燥，得60g瑞鮑迪苷d精品。

本實施例所得瑞鮑迪苷d精品呈白色結晶性粉末，經高效液相色譜外標法檢測，所得瑞鮑迪苷d精品的純度為98.6wt%，瑞鮑迪苷d的最終收率為91.0%。