本申請為發(fā)明名稱：長效干擾素及其制備方法和用途，申請?zhí)枺?013101771115，申請日：2013年5月15日的分案。

本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及長效干擾素及制備方法和用途，具體涉及用于抗病毒、抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的長效干擾素及制備方法和用途。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了干擾素（interferon）是人和動物的細(xì)胞在受細(xì)菌、病毒感染或核苷酸等刺激物的誘導(dǎo)下分泌的一組具有抗病毒等活性的多功能糖蛋白；是最早用于疾病臨床治療的細(xì)胞因子(pestkas,langerja,fisherpb,weinsteinib,ortaldoj,herbermanrb:sympfundamcancerres1984,37:261-281;guttermanju:cytokinetherapeutics:procnatlacadsciusa1994,91(4):1198-1205)。所述干擾素主要有α干擾素、β干擾素、γ干擾素和ω干擾素等類型，根據(jù)干擾素產(chǎn)生的細(xì)胞來源、受體、氨基酸結(jié)構(gòu)及對酸耐受程度的不同，可將干擾素分為i型干擾素和ii型干擾素，其中i型干擾素包括α干擾素、β干擾素和ω干擾素；i型干擾素被稱為抗病毒干擾素，其生物學(xué)效應(yīng)主要以抗病毒為主，同時具有抑制細(xì)胞生長，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等生物活性。所述γ干擾素屬于ii型干擾素，抗病毒活性較i型干擾素弱，其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)和參與組織相容性抗原的表達，又稱為免疫干擾素(stewartwe,2nd,wiranowska-stewartm,koistinenv,cantellk:virology1979,97(2):473-476.)。

研究公開了β干擾素是由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的，與α干擾素識別相同受體且具有類似生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)；天然人β干擾素是由第9號染色體上單一基因編碼的分子量約為23千道爾頓的糖蛋白；其前體分子由21個氨基酸的信號肽序列和166個氨基酸的β干擾素分子組成，含有3個半胱氨酸和一個糖基鏈，其中位于第31、141位的半胱氨酸可形成二硫鍵，對于β干擾素生物活性的維持具有重要作用(markdf,lusd,creaseyaa,yamamotor,linls:procnatlacadsciusa1984,81(18):5662-5666)。

研究顯示，β干擾素具有廣譜的抗病毒活性，但其抑制病毒增殖的作用機理因病毒種類的不同而有所差異，如β干擾素可抑制口炎皰疹病毒對細(xì)胞的吸附而發(fā)揮抗病毒效用；通過抑制病毒脫衣殼和病毒核酸的轉(zhuǎn)錄而抑制單純皰疹病毒和流感病毒的增殖(kumarm,liuh,riceap:plosone2012,7(7):e41251)；通過阻斷病毒蛋白的合成而抗皰疹病毒；通過抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒單純皰疹病毒成熟病毒顆粒的釋放而行使抗病毒功能；β干擾素還可通過誘導(dǎo)組織細(xì)胞產(chǎn)生蛋白激酶、磷酸二酯酶等抗病毒蛋白而抑制病毒復(fù)制和增殖，通過誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化來增強對病毒的吞噬作用。有研究發(fā)現(xiàn)，β干擾素還具有抗sars病毒的活性，是唯一一種在感染后仍具有抗病毒效用的干擾素(subramaniangm,moorepa,gowenbb,olsenal,barnarddl,paragasj,hoganrj,sidwellrw:chemotherapy2008,54(3):176-180)；此外，β干擾素還廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒所引起的病毒性肝炎、流行性病毒性腦炎、單純皰疹病毒角膜炎和病毒性心肌炎等病毒性感染疾病的治療(morikawah,kozukar,fujiih,iwais,enomotom,tamoria,saitos,kawadan:hepatolres2013)。

有研究顯示，β干擾素具有抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)；其對惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌、喉癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤具有抑制和殺傷效果。β干擾素抗腫瘤的作用機理主要包括直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖；作用于機體的免疫系統(tǒng)，提高單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡；抑制腫瘤微環(huán)境血管的生成而發(fā)揮抗腫瘤的作用等(okazakit,kagejit,kuwayamak,kitazatokt,mureh,harak,morigakir,mizobuchiy,matsuzakik,nagahiros:cancerlett2012,323(2):199-207;parkmy,kimdr,junghw,yoonhi,leejh,leect:cancergenether2010,17(5):356-364;vitaleg,zappavignas,marram,dicitorea,meschinis,condellom,aranciag,castiglionis,maronip,bendinellipetal:biotechnoladv2012,30(1):169-184;olsonmv,leej,zhangf,wanga,dongz:cancergenether2006,13(7):676-685;vankoetsveldpm,vitaleg,feeldersra,waaijersmm,sprij-mooijd,dekrijgerrr,speelej,hoflandj,lambertssw,deherderwwetal:endocrrelatcancer2013;rohmr,zhengz,kimhs,jeunghc,rhasy,chungky:melanomares2013,23(2):114-124;naiks,nacer,barbergn,russellsj:cancergenether2012,19(7):443-450)。

1993年β干擾素作為治療多發(fā)性硬化的推薦用藥在美國和歐洲被批準(zhǔn)上市，至今仍是fda批準(zhǔn)的用于多發(fā)性硬化治療唯一的生物制品類藥物，也是目前治療多發(fā)性硬化最有效的藥物(patydw,lidk:neurology1993,43(4):662-667)。

目前已上市的β干擾素主要有三種來源，分別為由人成纖維細(xì)胞經(jīng)適度刺激分泌產(chǎn)生的天然人β干擾素、由大腸桿菌表達的非糖基化重組突變型人β干擾素和由中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達的重組天然人β干擾素(rodriguezj,spearmanm,tharmalingamt,sunleyk,lodewyksc,huzeln,butlerm:jbiotechnol2010,150(4):509-518;singhab,sharmaak,mukherjeekj:molbiosyst2012,8(2):615-628)。從人成纖維細(xì)胞中分離的天然人β干擾素十分有限，產(chǎn)量很低，價格昂貴，無法滿足日益增長的臨床需求；而利用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的β干擾素雖具有同天然人β干擾素相同的結(jié)構(gòu)功能，但其生產(chǎn)成本高、周期長、條件苛刻且蛋白表達量低，同樣嚴(yán)重制約了其在臨床治療中的廣泛應(yīng)用。相比較而言，大腸桿菌作為首個用于生產(chǎn)重組蛋白的工程菌，不僅具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、轉(zhuǎn)化效率高、培養(yǎng)條件簡單、操作容易等優(yōu)點，且其遺傳背景清楚，表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其他表達系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)表達的β干擾素蛋白可占菌體總蛋白的10%~70%,且在大腸桿菌中表達的人β干擾素經(jīng)純化、復(fù)性后具有與天然β干擾素相同的生物學(xué)活性；可以滿足β干擾素大量生產(chǎn)的需求。

多年以前國內(nèi)諸多研究機構(gòu)就開始了對β干擾素的研制，陳國友等構(gòu)建了plcm182-17ser重組人β干擾素表達載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌mm294，實現(xiàn)了β干擾素的熱誘導(dǎo)表達，并探索了一種適于中試生產(chǎn)的發(fā)酵和純化方法(陳國友，蔣應(yīng)明，張意，黃欣，厲永健，施群英，王全興，張明徽，何龍，曹雪濤，基因工程人β干擾素的原核表達及純化研究.中國腫瘤生物治療雜志，2001,8(2):130-133)；中國疾病預(yù)防控制中心的李武平等使用大腸桿菌偏愛密碼子人工合成了β干擾素1b基因，構(gòu)建pbv220-ifn-β1b表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，實現(xiàn)了β干擾素的表達并進行了純化(李武平，呂宏亮，段招軍，張麗萍，劉永清，吳斌文，陳勇，張成海，衣作安，魏開坤，侯云德，干擾素-β1b的高效表達、純化及抗病毒活性研究.病毒學(xué)報，2002,18(3):240-244)；北京生物制品研究所研制的注射用重組人干擾素β1b是國內(nèi)第一個獲得臨床研究批件的β干擾素生物制品(劉建源，張振龍，楊云凱，張琰平，鄧宛明，樊曉翔，重組人干擾素-β的中試研究.生物技術(shù)通訊，2001,12(4):270-272)，目前正在進行臨床ii期研究，但是到現(xiàn)在為止尚沒有任何國產(chǎn)的β干擾素上市。

此外，由于β干擾素的分子量小、易被腎小球的濾過作用清除，在體內(nèi)的半衰期很短（皮下給藥或肌肉注射的半衰期只有4-6小時），為了維持體內(nèi)有效的血藥濃度，需多次用藥或采用蛋白質(zhì)長效修飾技術(shù)延長β干擾素的半衰期。蛋白質(zhì)的長效化修飾手段主要包括利用peg、葡聚糖等進行化學(xué)手段修飾和采用基因工程手段表達融合蛋白進行修飾(nairnnw,shanebeckkd,wanga,graddistj,vanbruntmp,thorntonkc,grabsteink:bioconjugchem2012,23(10):2087-2097)。目前已上市的長效β干擾素主要是peg化學(xué)修飾產(chǎn)物(hux,millerl,richmans,hitchmans,glickg,lius,zhuy,crossmanm,nestorovi,gronkersetal:jclinpharmacol2012,52(6):798-808)。盡管peg修飾能有效延長β干擾素的半衰期，但由于peg修飾為化學(xué)反應(yīng)，可能導(dǎo)致β干擾素部分活性喪失；據(jù)報道peg在體內(nèi)不能有效降解，部分人群產(chǎn)生抗peg抗體，進一步限制了peg長效修飾β干擾素的應(yīng)用(garayrp,el-gewelyr,armstrongjk,garrattyg,richettep:expertopindrugdeliv2012,9(11):1319-1323)。此外采用重疊pcr技術(shù)將β干擾素cdna與人血清白蛋白cdna進行連接，得到融合基因整合到酵母表達宿主的染色體進行表達，可得到長效化的融合蛋白；利用β干擾素與人免疫球蛋白igg的fc片段進行融合表達，可獲得β干擾素-fc融合蛋白，延長β干擾素的半衰期，但由于人igg存在同種異型，多次用藥可導(dǎo)致患者體內(nèi)產(chǎn)生抗體而降低融合蛋白的治療效果(dumontja,lowsc,petersrt,bitontiaj:biodrugs2006,20(3):151-160;vallees,rakhes,reidyt,walkers,luq,sakorafasp,lows,bitontia:jinterferoncytokineres2012,32(4):178-184;zhangq,leij,dingy,cheny,qul,chens,jinj:shengwugongchengxuebao2009,25(11):1746-1752)。

所述多聚唾液酸是n-乙酰神經(jīng)氨酸通過n-連接糖苷鍵多聚形成的獨特碳水化合物，研究發(fā)現(xiàn)多聚唾液酸化多肽或蛋白質(zhì)在保持活性的前提下，修飾后可顯著降低肽類化合物水解，延長半衰期，降低免疫原性(gregoriadisg,fernandesa,mitalm,mccormackb:cellmollifesci2000,57(13-14):1964-1969)。fernandes等利用多聚唾液酸對l-天冬酰胺酶進行修飾，修飾后酶的抗原性和免疫原性均低于天冬酰胺酶，但修飾后酶抗胰蛋白酶的水解能力和體外半衰期明顯增強(fernandesai,gregoriadisg:intjpharm2001,217(1-2):215-224)；林怡等對銅鋅超氧化物歧化酶進行多聚唾液酸修飾，修飾后產(chǎn)物的穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，多聚唾液酸修飾可提高銅鋅超氧化物歧化酶的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和抗酶降解能力(wujr,liny,zhengzy,lincc,zhanxb,shenyq:biotechnollett2010,32(12):1939-1945)。此外，所述多聚唾液酸通過改變神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)黏附分子的黏附性調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，對神經(jīng)細(xì)胞功能的維持起重要作用(weberm,modemanns,schipperp,trauerh,frankeh,illesp,geigerkd,hengstlerjg,kleemannwj:neuroscience2006,138(4):1215-1223;angatak,huckabyv,ranschtb,terskikha,marthjd,fukudam:molcellbiol2007,27(19):6659-6668)。

目前已知，重組多肽的氨基酸序列由天然存在的親水性氨基酸組成，因而可生物降解且沒有免疫原性，采用分子遺傳操作將重組多肽與治療性目的蛋白進行融合表達，可顯著延長治療性蛋白的半衰期(schellenbergerv,wangcw,geethingnc,spinkbj,campbella,tow,schollemd,yiny,yaoy,boginoetal:natbiotechnol2009,27(12):1186-1190)。目前已有研究證實重組多肽與人生長激素形成的融合蛋白、與胰高血糖素形成的蛋白均能有效延長目的蛋白的半衰期；與胰高血糖素樣肽2相比，重組多肽與其融合形成的重組蛋白在小鼠、大鼠及猴子體內(nèi)的半衰期分別為34h、38h和120h(clelandjl,geethingnc,mooreja,rogersbc,spinkbj,wangcw,altersse,stemmerwp,schellenbergerv:jpharmsci2012,101(8):2744-2754;altersse,mclaughlinb,spinkb,lachinyant,wangcw,podustv,schellenbergerv,stemmerwp:plosone2012,7(11):e50630)。此外，重組多肽與治療性蛋白融合基因可通過大腸桿菌工程菌實現(xiàn)原核表達，與人血清白蛋白和人免疫球蛋白iggfc片段真核表達相比，更具有產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢；由于其生物相容性及生物可降解性優(yōu)異，重組多肽有望成為延長藥物蛋白半衰期最理想的修飾工具(geethingnc,tow,spinkbj,schollemd,wangcw,yiny,yaoy,schellenbergerv,clelandjl,stemmerwpetal:plosone2010,5(4):e10175)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種長效干擾素及制備方法和用途，具體涉及一種用于抗病毒、抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的長效干擾素及制備方法和用途；所述的長效干擾素能減少干擾素的免疫原性，延長干擾素在體內(nèi)的半衰期。

本發(fā)明所述的長效干擾素包括多聚唾液酸修飾的干擾素和長效干擾素重組融合蛋白，其中，

所述多聚唾液酸修飾的干擾素，由活化的多聚唾液酸末端第7位的單醛基在氰基硼氫化鈉存在的情況下與干擾素反應(yīng)而成的偶聯(lián)物；其中，所述多聚唾液酸采用高碘酸鈉進行激活；所述的干擾素包括但不限于α干擾素、β干擾素等i型干擾素及γ干擾素等ii型干擾素及其同源類型；所述β干擾素的氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述長效干擾素重組融合蛋白為，由n-端干擾素與c-端天然存在的親水性非重復(fù)序列多肽融合而成的重組蛋白；其中，所述的干擾素包括但不限于α干擾素、β干擾素等i型干擾素及γ干擾素等ii型干擾素及其同源類型，優(yōu)選β干擾素；所述天然存在的親水性非重復(fù)序列多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示：

metsertyrasnleuleuglypheleuglnargserserasnpheglnserglnlysleuleutrpglnleuasnglyargleuglutyrcysleulysaspargmetasnpheaspileproglugluilelysglnleuglnglnpheglnlysgluaspalaalaleuthriletyrglumetleuglnasnilephealailepheargglnaspserserserthrglytrpasngluthrilevalgluasnleuleualaasnvaltyrhisglnileasnhisleulysthrvalleugluglulysleuglulysgluaspphethrargglylysleumetserserleu

hisleulysargtyrtyrglyargileleuhistyrleulysalalysglutyrserhiscysalatrpthrilevalargvalgluileleuargasnphetyrpheileasnargleuthrglytyrleuargasn（seqidno.1）；

所述長效干擾素重組融合蛋白中，β干擾素的氨基酸序列如seqidno.2所示：

msynllgflqrssnfqsqkllwqlngrleyclkdrmnfdipeeikqlqqfqkedaaltiyemlqnifaifrqdssstgwnetivenllanvyhqinhlktvleeklekedftrgklmsslhlkryygrilhylkakeyshcawtivrveilrnfyfinrltgylrn（seqidno.2）。

本發(fā)明還提供了編碼所述長效干擾素重組融合蛋白的親水性非重復(fù)序列多肽的核苷酸序列，如seqidno.3所示：

atgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagagtcagaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatattgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaac（seqidno.3）；

本發(fā)明中，編碼所述長效干擾素重組融合蛋白的核苷酸序列如seqidno.4所示：

atgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagagtcagaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatattgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaacggtacttctactccggaaagcggttccgcatctccaggtacttctcctagcggtgaatcttctactgctccaggtacctctcctagcggcgaatcttctactgctccaggttctaccagctctaccgctgaatctcctggcccaggttctaccagcgaatccccgtctggcaccgcaccaggttctactagctctaccgcagaatctccgggtccaggtacttcccctagcggtgaatcttctactgctccaggtacctctactccggaaagcggctccgcatctccaggttctactagctctactgctgaatctcctggtccaggtacctcccctagcggcgaatcttctactgctccaggtacctctcctagcggcgaatcttctaccgctccaggtacctcccctagcggtgaatcttctaccgcaccatgactcgag（seqidno.4）。

本發(fā)明所述長效干擾素重組融合蛋白中，所述多肽以seqidno.1所示的氨基酸序列為單位進行重復(fù)組合，與干擾素的n-端或c-端進行融合；其組合方式包括但不限于n-端干擾素和c-端親水性無重復(fù)序列多肽的組合。

本發(fā)明還提供了一種含有如seqidno.3或seqidno.4所示核苷酸序列的載體；一種含有如seqidno.3或seqidno.4所示核苷酸序列的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明所述長效干擾素能延長干擾素的體內(nèi)半衰期、同時保持干擾素的活性、降低其免疫原性；

本發(fā)明的長效干擾素進一步可制備治療抗病毒藥物、抗感染藥物、抗腫瘤藥物或免疫調(diào)節(jié)性的藥物；用于肝炎病毒、sars、單純皰疹病毒等病毒感染性疾病的治療，同時也可用于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌等惡性腫瘤及其他細(xì)胞增殖性疾病的治療。

本發(fā)明的長效干擾素重組融合蛋白可在大腸桿菌中高效表達，且制備工藝簡單，可用于大規(guī)模的藥物級融合蛋白的生產(chǎn)制備。

附圖說明

圖1為β干擾素的多聚唾液酸修飾sds-page圖譜，其中，

mmarker;1-2β干擾素interferon-β;3psa修飾后的β干擾素interferon-βmodifiedbypsa。

圖2為β干擾素-xten目的基因的pcr產(chǎn)物凝膠電泳圖譜，其中，

1marker；2-3pcr產(chǎn)物pcrproduct；4marker。

圖3為本發(fā)明中所述親水性非重復(fù)序列多肽與β干擾素融合蛋白編碼基因序列。

圖4為本發(fā)明中所述重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜，其中，

1marker；2pmd19-t-ifnβ-xtenncoi+xhoi雙酶切pmd19-t-ifnβ-xtenncoi+xhoidigestion；3pet22bncoi+xhoi雙酶切pet24bncoi+xhoidigestion；4marker。

圖5為本發(fā)明中所述重組表達載體的酶切鑒定圖譜，其中，

1marker；2-5pet22b-ifnβ-xtenncoi+xhoi雙酶切pet22b-ifnβ-xtenncoi+xhoidigestion；6marker。

圖6為本發(fā)明中采用pcr方法克隆含有ncoi和xhoi酶切位點的融合蛋白編碼基因序列，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜，其中，

m為dl5000；1為pet24b雙酶切回收產(chǎn)物；2為融合蛋白編碼基因雙酶切回收產(chǎn)物。

圖7為本發(fā)明實施例3中酶切產(chǎn)物觀察圖，其中，

m為dl5000；1為pet24b-融合蛋白編碼基因雙酶切產(chǎn)物。

圖8圖8β干擾素-xten融合蛋白誘導(dǎo)表達的sds-page圖譜，其中，

mmarker；1未誘導(dǎo)的對照untreatedcontrol；2-5誘導(dǎo)產(chǎn)物inducedproduct。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖通過具體實施例進一步說明但不限定本發(fā)明。

實施例1多聚唾液酸對重組人β干擾素的化學(xué)修飾

（1）多聚唾液酸的活化

①將多聚唾液酸按10mg多聚唾液酸/ml高碘酸鈉的比例與新鮮配制的100mm高碘酸鈉混合，置于20℃暗處攪拌5min；

②加入兩倍體積的乙二醇中和過量的高碘酸鈉，置于20℃暗處繼續(xù)攪拌30min；

③將氧化的多聚唾液酸置于0.01%碳酸銨緩沖液（ph7.4）中4℃透析24h，透析袋應(yīng)能截留3.5kda的分子；

④以分子量為8kda的干燥聚乙二醇覆蓋反相透析濃縮多聚唾液酸溶液；

⑤將透析液凍干，置于-40℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）多聚唾液酸修飾β干擾素的反應(yīng)

①β干擾素采用含0.1%sdsph7.410mm的磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度為0.2mg/ml的溶液；

②在4mg/ml氰基硼氫化鈉存在的情況下，活化的多聚唾液酸與β干擾素摩爾比按50:1進行混合；

③將反應(yīng)容器置于35℃的環(huán)境中密閉攪拌反應(yīng)48h；

④反應(yīng)結(jié)束后用70%硫酸銨沉淀蛋白，4℃攪拌1h后離心收集沉淀；

⑤將沉淀用ph7.410mm的磷酸鹽緩沖液溶解并在相同的緩沖液中4℃透析24h。

取活化的多聚唾液酸與純化的β干擾素按摩爾比50:1進行反應(yīng),控制氰基硼氫化鈉的用量為4mg/ml,蛋白濃度為0.2mg/ml，反應(yīng)體系為5ml，35℃密閉攪拌反應(yīng)48h。對反應(yīng)后的產(chǎn)物與10mmpbsph7.4溶液中透析24h，濃縮反應(yīng)產(chǎn)物并進行sds-page凝膠電泳分析；實驗結(jié)果如圖1所示，與未反應(yīng)的β干擾素相比，經(jīng)多聚唾液酸修飾的β干擾素分子量明顯增加，一單位的多聚唾液酸的分子量為30kda，反應(yīng)后產(chǎn)物的分子量約為50kda，與預(yù)期分子量大小一致。

實施例2獲得親水性非重復(fù)序列多肽與β干擾素融合蛋白編碼基因及構(gòu)建含有信號肽表達載體

人工化學(xué)合成親水性非重復(fù)序列多肽與β干擾素融合蛋白編碼基因序列，并將其克隆至puc57simple質(zhì)粒載體中，得到含有融合蛋白編碼基因的質(zhì)粒；

首先以該質(zhì)粒中的融合蛋白編碼基因序列為模板，采用primer設(shè)計引物，上游引物為：5’actgccatggccagctacaacttgcttggat3’，其中加下劃線處為ncoi酶切位點；下游引物：5’agtctcgagtcatggtgcggtagaagat3’,其中加下劃線處為xhoi酶切位點；引物由上海生工生物工程公司合成；

采用pcr方法克隆含有ncoi和xhoi酶切位點的融合蛋白編碼基因序列，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，實驗結(jié)果如圖2所示，pcr產(chǎn)物在1000bp左右，與β干擾素-xten目的基因預(yù)期大?。?42bp）相符。

pcr反應(yīng)i：在0.2ml的pcr管中加入以下成分并混合均勻：

2xtaqmix25μl；上游引物2μl；下游引物2μl；puc57-融合蛋白編碼基因質(zhì)粒1μl；超純水20μl。

pcr反應(yīng)程序為：94℃，5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，2min；72℃，30min。一共進行30個循環(huán)反應(yīng)。

將克隆到的pcr產(chǎn)物連接pmd19-tsimple載體，挑取陽性克隆，送至上海英駿貿(mào)易有限公司進行測序，測序結(jié)果如圖3所示，經(jīng)比對與人工化學(xué)合成的核苷酸序列一致。

取pet22b表達載體及pmd19-融合蛋白編碼基因質(zhì)粒，采用ncoi及xhoi限制性核酸內(nèi)切酶進行雙酶切。雙酶切的反應(yīng)體系為20ul，其中質(zhì)粒10ul，ncoi1ul，xhoi1ul，10xbufferh2ul,無菌水6ul。37℃酶切5h。酶切產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，實驗結(jié)果如圖4所示。采用膠回收試劑盒回收目的片段，其中pet22b表達載體回收5000bp左右的片段，pmd19-ifnβ回收1000p的片段。

連接反應(yīng)在t4dna連接酶催化下進行，pet22b表達載體酶切片段與ifnβ目的片段的摩爾數(shù)比約為1:3。連接反應(yīng)體系為25ul，其中t4連接酶1ul，10xt4dna連接酶緩沖液2.5ul，16℃連接過夜。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌dh5α，涂布于氨芐青霉素抗性lb平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，采用ncoi及xhoi雙酶切。酶切產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察酶切產(chǎn)物的大小，實驗結(jié)果如圖5所示。將擴大培養(yǎng)的菌液采用pet載體通用引物測序，測序反應(yīng)由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

實施例3構(gòu)建不含信號肽的親水性非重復(fù)序列多肽與β干擾素融合蛋白編碼基因表達載體

人工化學(xué)合成親水性非重復(fù)序列多肽與β干擾素融合蛋白編碼基因序列，并將其克隆至puc57simple質(zhì)粒載體中，得到含有融合蛋白編碼基因的質(zhì)粒。

首先以該質(zhì)粒中的融合蛋白編碼基因序列為模板，采用primer設(shè)計引物，上游引物為：5’catatgagctacaacttgcttggat3’，其中加下劃線處為ndei酶切位點；下游引物：5’agtctcgagtcatggtgcggtagaagat3’,其中加下劃線處為xhoi酶切位點；引物由上海生工生物工程公司合成。

采用pcr方法克隆含有ncoi和xhoi酶切位點的融合蛋白編碼基因序列，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，實驗結(jié)果如圖6所示：pcr產(chǎn)物在1000bp左右，與β干擾素-xten目的基因預(yù)期大小（942bp）相符。

pcr反應(yīng)i：在0.2ml的pcr管中加入以下成分并混合均勻：

2xtaqmix25μl；上游引物2μl；下游引物2μl；puc57-融合蛋白編碼基因質(zhì)粒1μl；超純水20μl。

pcr反應(yīng)程序為：94℃，5min；94℃，1min；55℃，1min；72℃，2min；72℃，30min。一共進行30個循環(huán)反應(yīng)。

將克隆到的pcr產(chǎn)物連接pmd19-tsimple載體，挑取陽性克隆，送至上海英駿貿(mào)易有限公司進行測序，測序結(jié)果經(jīng)比對與人工化學(xué)合成的核苷酸序列一致。

取pet24b表達載體及pmd19-融合蛋白編碼基因質(zhì)粒，采用ndei及xhoi限制性核酸內(nèi)切酶進行雙酶切。雙酶切的反應(yīng)體系為20ul，其中質(zhì)粒10ul，ndei1ul，xhoi1ul，10xbufferh2ul,無菌水6ul。37℃酶切5h。酶切產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用膠回收試劑盒回收目的片段，其中pet24b表達載體回收5000bp左右的片段，pmd19-ifnβ回收1000p的片段。

連接反應(yīng)在t4dna連接酶催化下進行，pet24b表達載體酶切片段與ifnβ目的片段的摩爾數(shù)比約為1:3。連接反應(yīng)體系為25ul，其中t4連接酶1ul，10xt4dna連接酶緩沖液2.5ul，16℃連接過夜。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌dh5α，涂布于氨芐青霉素抗性lb平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，采用ndei及xhoi雙酶切。酶切產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察酶切產(chǎn)物的大小，實驗結(jié)果如圖7所示。將擴大培養(yǎng)的菌液采用pet載體通用引物測序，測序反應(yīng)由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

實施例4親水性非重復(fù)序列多肽與β干擾素融合蛋白的表達

將測序正確的pet22b-融合蛋白編碼基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌transb（de3)，涂布于氨芐青霉素、硫酸卡那霉素和四環(huán)霉素三抗性lb平板，37℃培養(yǎng)過夜。隨機挑取平板上4個單菌落，擴大培養(yǎng)，按1%的比例轉(zhuǎn)接至3ml新鮮lb試管中，37℃震蕩培養(yǎng)至od600≈0.6時，分別取樣加入終濃度為0.5mm和1mm的iptg，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)3h，取1ml菌液離心收集菌體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析；實驗結(jié)果如圖8所示，與未經(jīng)iptg誘導(dǎo)對照組相比，iptg誘導(dǎo)的實驗組在30kda附近有目的蛋白表達，大小與預(yù)期相符。

sequencelisting

<110>復(fù)旦大學(xué)

<120>長效干擾素的制備方法及其用途

<160>4

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<213>親水性非重復(fù)多肽

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<213>β干擾素

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<213>親水性無重復(fù)序列多肽

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<213>效干擾素融合蛋白

<400>4

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