專利名稱：：黃酮類化合物或含其的植物提取物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類黃酮類化合物或含其的植物提取物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：據(jù)不完全統(tǒng)計，目前我國丙肝抗體陽性患者有4000萬人之多，其中80%會患上慢性丙肝。丙肝是經(jīng)血液、性接觸、母嬰及日常生活接觸等途徑傳播的一種肝臟疾病。感染HCV后，和HBV感染一樣，易發(fā)生慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前，主要使用長效干擾素聯(lián)合利巴韋林治療肝功正常的丙肝患者，總體持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率為52%。但干擾素和利巴韋林在治療過程中，有可能出現(xiàn)骨髓抑制以及情感抑郁、消化道癥狀等不良反應(yīng)。并且，長效干擾素價格昂貴，一個療程48周需花費人民幣6萬元左右。因此開發(fā)抗HCV療效好、價格低，副作用較小的天然藥物是目前醫(yī)藥行業(yè)的一個熱點。黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物(通式如下所示)。黃酮類化合物的主要結(jié)構(gòu)類型有黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、二氫黃酮醇類、二氫異黃酮、查爾酮、花色素類等14種。(具體請見姚新生主編的《天然藥物化學(xué)》，第四版，人民衛(wèi)生出版社)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一類黃酮類化合物或含其的植物提取物在制備抗丙型肝炎病毒藥物中的新應(yīng)用。本發(fā)明人經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)具有如式I所示的母核結(jié)構(gòu)的一類黃酮類化合物具有較佳的抗丙型肝炎病毒活性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式I其中，R2、R4、R5和R6獨立地為H、OH或OMe，R3為H、0H、0Me或P_D_葡萄糖酸基，2位和3位碳之間為單鍵或雙鍵。較佳的，所述的黃酮類化合物為以下兩種化合物中的任一種(1)OH式A其中，R2、R5和R6獨立地為H或0H，R3為OH或13_D_葡萄糖酸基，R4為氫；(2)式H其中，&、R2、R3、R4和R5獨立地為H、OH或0Me，其為外消旋化合物或手性化合物。本發(fā)明中，所述的如式A所示的黃酮類化合物優(yōu)選下述三種化合物中的任一種(1)如式B所示的芹菜素，即式A化合物，其中R3和R5為0H，R2和R6為H，其分子式為C15H1005;分子量270.25，化學(xué)名為5，7，4'-三羥基黃酮，英文名稱為Apigenin，CAS編號為520-36-5。6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式B(2)如式C所示的木犀草素，即式A化合物，其中R3、R5和R6為0H，R2為H，其分子式為QA。06;分子量286.09，化學(xué)名為5，7，3'，4'_四羥基黃酮，英文名稱為Luteolin，CAS編號為491-70-3。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式C(3)如式D所示的黃芩苷，即式A化合物，其中Rs和Re為H;R3為P_D_葡萄糖酸基，R2為0H，其分子式為&凡80n;分子量446.35，化學(xué)名為化學(xué)名為P-D-葡萄糖酸-5，6_二羥基-4-0-2-苯基-4H-苯并吡喃-7，英文名稱為Baicalin，CAS編號為21967-41-9。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式D本發(fā)明中，所述的如式H所示的黃酮類化合物優(yōu)選下述化合物E:式E其中，&、R2、R3、R4和R5獨立地為H、OH或OMe。所述的如式E所示的黃酮類化合物優(yōu)選下述兩種化合物中的任一種柚皮素，即式E化合物，其中&、R3和R5為0H，R2和R4為H，其分子式為015111205;分子量272，化學(xué)名為(2S)-5，7，4'-三羥基二氫黃酮，英文名稱為(2S)-Naringenin。OH0式F(2)如式G所示的6-甲氧基柚皮素，即式E化合物，其中R"R3和R5為0H，R2為0Me，R4為H，其分子式為CwHw06;分子量302，化學(xué)名為(2S)-5，7，4'-三羥基-6-甲氧基二氫黃酮，英文名稱為(2S)-6-methoxynaringeniruOHO式G本發(fā)明中，所述的黃酮類化合物可由天然植物中提取，較佳的為夏枯草或半枝蓮。本發(fā)明所述的黃酮類化合物不僅包括市售單體純品，也包括從天然植物中提取的粗品或純品，還包括以這些黃酮類化合物為有效成份的植物提取物。本發(fā)明的積極進步效果在于本發(fā)明所述的黃酮類化合物具有較好的抗丙型肝炎病毒的作用，其副作用小，其來源于中藥，廉價安全有效。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。實施例中所用的芹菜素、木犀草素、黃芩苷柚皮素和6_甲氧基柚皮素購自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心。HCV-E2抗體取自美國Scripps研究所。對照藥物a干擾素以及其它所用試劑和原料均國內(nèi)市售可得。效果實施例體外細胞試驗1、樣品制備用100%DMS0將樣品溶解成濃度為20mg/ml的母液，4。C保存。檢測時，再用100%DMS0將貯存母液分別稀釋為5mg/ml和2mg/ml的溶液。2、細胞、病毒及細胞培養(yǎng)本研究采用Huh7衍生細胞系和HCV病毒株(取自中國科學(xué)院上海巴斯德研究8所)，該病毒株能在該細胞中產(chǎn)生高滴度、有感染能力的HCV病毒顆粒。將細胞以1X104個/1001/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜。用完全培養(yǎng)基(DMEM中含10%胎牛血清，lOOU/ml青霉素，100yg/ml鏈霉素)將HCV病毒上清稀釋到1Xl()3ffu/ml，按50ffu/孔感染細胞。3、HCV病毒集落減少實驗。將不同濃度(5mg/ml和2mg/ml)的樣品溶液分別以體積比1:50的比例稀釋于完全培養(yǎng)基中，使之濃度相應(yīng)為100g/ml和40g/ml，分別吸取適量樣品溶液與等體積病毒稀釋液混和均勻，制備成濃度為50g/ml和20g/ml的樣品。室溫孵育1小時。棄去96孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入100ill上述混和液，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時。棄去上清，用無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(DPBS)洗1次，每孔加入150新鮮的完全培養(yǎng)基，置371:、5%C0J咅養(yǎng)箱中培養(yǎng)64小時。每孔加入150iU4%多聚甲醛(PFA)，室溫固定15分鐘。棄去上清，用DPBS洗滌3次，用抗HCV-E2人源單克隆抗體和免疫熒光素標(biāo)記的抗人二抗(取自中國科學(xué)院上海巴斯德研究所)進行免疫熒光染色。熒光顯微鏡觀察記錄病毒集落數(shù)量。4、陰性對照組設(shè)定。陰性對照組以匿SO代替樣品溶液，其余同樣品檢測。5、a干擾素對照組設(shè)定。用完全培養(yǎng)基將干擾素溶液分別稀釋至5，50，500IU/ml。與細胞孵育1小時，加入病毒稀釋液，其余同提取物檢測。抑制率=(陰性對照組病毒集落數(shù)量_實驗組的病毒集落數(shù)量)/陰性對照組病毒集落數(shù)量X100%實驗結(jié)果9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，柚皮素即為本發(fā)明的式F化合物，e-甲氧基柚皮素即為本發(fā)明的式G化合物。細胞毒性說明無細胞毒性=實驗組細胞密度/陰性對照組細胞密度^80%有細胞毒性=實驗組細胞密度/陰性對照組細胞密度<80%實驗結(jié)果顯示芹菜素、木犀草素、黃芩苷、柚皮素和6-甲氧基柚皮素等黃酮類化合物對丙型肝炎病毒有顯著的抑制作用。綜上所述，各項實驗結(jié)果表明芹菜素、木犀草素、黃芩苷、柚皮素和6-甲氧基柚皮素等黃酮類化合物具有抗丙型肝炎病毒活性。權(quán)利要求一類如式I所示的黃酮類化合物或含其的植物提取物在制備抗丙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用；式I其中，R1、R2、R4、R5和R6獨立地為H、OH或OMe，R3為H、OH、OMe或β-D-葡萄糖酸基，2位和3位碳之間為單鍵或雙鍵。F2009101503740C00011.tif2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的黃酮類化合物I為以下兩種化合物中的任一種(1)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式A其中，R2、R5和R6獨立地為H或0H，R3為OH或13_D_葡萄糖酸基，R4為氫；(2)式H<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，R2、R3、R4和R5獨立地為H、OH或0Me，其為外消旋化合物或手性化合物。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的如式A所示的黃酮類化合物為下述三種化合物中的任一種(1)如式B所示的芹菜素，即式A化合物，其中R3和R5為0H，R2和R6為H;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式B(2)如式C所示的木犀草素，即式A化合物，其中R3、R5和R6為0H，R2為H;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式C(3)如式D所示的黃芩苷，即式A化合物，其中R5和R6為H;R3為P_D_葡萄糖酸基，R2為OH;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式Dc4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的如式H所示的黃酮類化合物為下述化合物E:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式E其中，R2、R3、R4和R5獨立地為H、OH或OMe。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的如式E所示的黃酮類化合物為下述兩種化合物中的任一種(1)如式F所示的柚皮素，即式E化合物，其中R!、R3和R5為0H，R2和R4為H;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式F(2)如式G所示的6-甲氧基柚皮素，即式E化合物，其中R3和R5為0H，R2為OMe，尺4為H;OHO式G。6.如權(quán)利要求15任一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗丙型肝炎病毒藥物為治療病毒性丙型肝炎的藥物。7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物提取物為夏枯草或半枝蓮提取物。全文摘要本發(fā)明公開了一類如式I所示的黃酮類化合物或含其的植物提取物在制備抗丙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用；其中，R1、R2、R4、R5和R6獨立地為H、OH或OMe，R3為H、OH、OMe或β-D-葡萄糖酸基，2位和3位碳之間為單鍵或雙鍵。本發(fā)明所述的黃酮類化合物具有較好的抗丙型肝炎病毒的作用，其副作用小，大多來源于中藥，廉價安全有效。式I文檔編號A61K31/7048GK101744830SQ20091015037公開日2010年6月23日申請日期2009年6月17日優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日發(fā)明者孔德云,莊昌龍,李波,王曙光,胡玨,鐘勁,高雯申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院;中國科學(xué)院上海巴斯德研究所