專利名稱：一種ha/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工骨修復(fù)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種HA(納米羥基磷灰 石)/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法。技術(shù)背景臨床上每年由有大量的病人因外傷、腫瘤以及其他疾病所造成的硬組織 缺損，因此，硬組織修復(fù)材料是國內(nèi)外臨床需求最大的修復(fù)材料之一。近幾 年，由于傳統(tǒng)骨修復(fù)材料存在著一些問題，骨組織工程支架成為了研究的一 個熱點，其原理是以支架材料為載體結(jié)合有成骨潛力的種子細(xì)胞、生長因子， 通過體內(nèi)或體外繼續(xù)培養(yǎng)，構(gòu)建有生命活力的仿生骨。膠原、殼聚糖及羥基磷灰石由于其良好的生物相容性等特點而廣泛應(yīng)用 于骨組織工程支架材料?；谔烊还堑闹饕煞质悄z原和羥基磷灰石，膠原/ 羥基磷灰石、殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架成為研究的兩個熱點。目前膠原/ 羥基磷灰石、殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架主要是通過羥基磷灰石粉體和膠原 或殼聚糖進行機械混合方式制備的。韓長菊，葉金鳳，陳慶華，等.物理發(fā)泡 法制備羥基磷灰石/膠原蛋白多孔支架材料.佛山陶瓷，2006， 11 (119): 8-10，該文以氫氧化鈣懸浮液和磷酸為主要實驗原料用共滴定的方法合成羥 基磷灰石，然后把羥基磷灰石粉與一定量的膠原蛋白溶液混合，經(jīng)過物理發(fā) 泡、冷凍、微波干燥的過程，得到氣孔率為79% 89%的羥基磷灰石/膠原 蛋白多孔支架材料。趙峰，尹玉姬，宋雪峰，等.殼聚糖-明膠網(wǎng)絡(luò)/羥基磷灰 石復(fù)合材料支架的研究一制備及形貌.中國修復(fù)重建外科雜志，2001， 15(5): 276-279，該文將平均粒度為2. 8 u m的羥基磷灰石粉體加入一定量去離子水 后攪拌并超聲波處理，在處理后的乳液狀混合物中加入CS和Gel (50 : 50 w/w )和適量乙酸后于4(TC水浴中攪拌，待有機物全部溶解后加入一定量戊 二醛溶液后冷凍干燥得到支架，結(jié)果顯示，通過控制組分配比和預(yù)冷凍溫度 可制備不同密度和孔隙率的CS-Gel/HA多孔支架。上述方法雖然在一定程度上得到了滿足一定性能要求的復(fù)合支架，但是由于羥基磷灰石是以粉末形式 與膠原或殼聚糖基體復(fù)合的，因而實際上很難均勻分散并且和基體之間無法 形成有效鍵合。此外，膠原和殼聚糖還存在著一些缺點，膠原的力學(xué)強度較差，降解速 度過快，而殼聚糖缺乏骨鍵合生物活性，脆性大，且降解慢、親水性差。因 而，改進膠原和殼聚糖本身的一些缺點也是膠原和殼聚糖基體復(fù)合支架需要 解決的問題，而將膠原和殼聚糖共混物同時作為復(fù)合支架的基體或者將兩者 形成新的結(jié)構(gòu)，則有望在一定程度上改善單純膠原或殼聚糖做基體時力學(xué)強 度的問題，同時獲得合適的降解速度。近年來，互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物發(fā)展十分迅 速，有望很好地解決上述問題?；ゴ┚W(wǎng)絡(luò)聚合物是用化學(xué)方法將兩種以上的 聚合物互相貫穿成交織網(wǎng)絡(luò)狀的一類新型復(fù)相聚合物材料，是聚合物共混改 性技術(shù)發(fā)展的新領(lǐng)域，為制造特殊性能的材料開拓了嶄新的途徑。然而；目 前互穿網(wǎng)絡(luò)技術(shù)用于HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)骨組織工程支架的制備沒有先例，如果能成功應(yīng)用該技術(shù)，將實現(xiàn)在HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng) 絡(luò)骨組織工程支架中羥基磷灰石均勻分散，并在此基體中呈現(xiàn)羥基磷灰石顆 粒的定向排列以及與基體形成有效鍵合，則可望在解決現(xiàn)有膠原/羥基磷灰石 及殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架現(xiàn)有問題的基礎(chǔ)上實現(xiàn)支架材料的穩(wěn)定性、力 學(xué)性能的改善，也有望從結(jié)構(gòu)和功能上實現(xiàn)納米羥基磷灰石與基體的有效復(fù)合。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，通過研發(fā)一種結(jié)晶程度可 控、分散性好，能與高分子材料具有穩(wěn)定鍵合的顆粒定向排列的納米羥基磷 灰石溶膠，將溶膠均勻分散于膠原/殼聚糖的互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)基體中并與基體形成有效鍵合，從而提供一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方 法。實現(xiàn)本發(fā)明目的是通過如下措施來實現(xiàn)的。一種HA(納米羥基磷灰石)/膠原/殼聚糖互穿 合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法包括以下步驟及其工藝條件-步驟一HA溶膠的制備(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)同時為模板劑、分散劑和改性劑；(2) 配制0. 01 3mol/L的鈣鹽和0. 006 1. 8mol/L的磷酸鹽溶液或配 制0。 01 3mol/L的鈣鹽溶液和0. 006 1. 8mol/L的磷酸；(3) 采用高速分散機，在堿液控制體系中，將上述(1) 、 (2)的物料 充分進行混合，形成納米羥基磷灰石溶膠；該納米羥基磷灰石溶膠體系中鈣 磷摩爾比達1.6 1.7:1，按質(zhì)量百分比計聚乙烯吡咯垸酮含量為0.01 50Zo ;步驟二 HA溶膠的陳化上述溶膠在20 10(TC的溫度下陳化至少24小時，然后用去離子水充分 洗滌溶膠得到顆粒定向排列的HA溶膠；步驟三HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的成型(1) 用醋酸溶液配制3mg/ml 10mg/ml的膠原溶液；(2) 按殼聚糖:膠原溶質(zhì)的質(zhì)量比為0. 1 9:1的比例將殼聚糖加入到上 述(1)的膠原溶液中，充分混合后得到膠原/殼聚糖的共混液；(3) 將步驟二的HA溶膠與上述(2)的膠原/殼聚糖的共混液混合并采 用高速分散機分散得到HA/膠原/殼聚糖的混合液,其中上述(2)的膠原/殼 聚糖共混液的溶質(zhì):HA溶膠的質(zhì)量比為0. 1 9:1;(4) 在上述(3)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中加入按質(zhì)量百分比計含 量為0.01 1%的混合交聯(lián)劑，所述混合交聯(lián)劑是指1 —乙基一3— (3 — 二甲 基氨丙基)碳二亞胺和N—羥基琥珀酰亞胺在常溫下攪拌交聯(lián)至少12h的混 合溶液，其中l(wèi)一乙基一3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)與N—羥 基琥珀酰亞胺(NHS)的質(zhì)量比為1 4:1;(5) 在上述(4)經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合 液中再加入按質(zhì)量百分比計含量為0.01 1%的殼聚糖交聯(lián)劑，并在常溫下 攪拌交聯(lián)至少12h;(6) 將上述(5)的經(jīng)混合交聯(lián)劑以及殼聚糖交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼 聚糖的混合液減壓、除氣泡后注入模型，再置于超低溫冰箱中冷凍至少24小 時，接著轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥至少24小時，即得到HA/膠原/殼聚糖 互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架；步驟四HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的后處理(1) 首先將HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架用氨水或緩沖溶液浸 泡1 3小時，然后再用去離子水浸泡至少6小時，并至少每半小時換一次水；(2) 將清洗后的支架材料放回模型，再次放入超低溫冰箱中冷凍至少 24小時后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥至少24小時，最后得到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架。為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明；步驟一 (3)所述物料混合，聚乙烯吡咯垸酮的 加入有以下兩種方式，擇一使用-(1) 將聚乙烯吡咯烷酮加入到鈣鹽或磷酸鹽溶液或磷酸中，或加入到鈣 鹽和磷酸鹽或磷酸的混合溶液中；(2) 先配制聚乙烯吡咯烷酮水溶液，再用聚乙烯吡咯烷酮水溶液配制鈣 鹽和磷酸鹽或磷酸溶液。所述鈣鹽為硝酸鈣或氫氧化鈣；磷酸鹽采用磷酸氫二銨、磷酸氫二鈉或 磷酸氫二鉀。步驟二所述陳化有以下兩種方式，擇一使用-(1) 將納米羥基磷灰石溶膠自然放置陳化；(2) 將納米羥基磷灰石溶膠移入加熱蒸發(fā)回流裝置陳化。 所述堿液控制體系pH值大于10. 5;所述堿液為氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。所述緩沖溶液為磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉溶液。 所述高速分散機的速度范圍為100 8000轉(zhuǎn)/分。所述所采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的類型為K15、 K30、 K60或K90;所 述膠原為I型膠原。所述超低溫冰箱中冷凍的溫度范圍為_5 °C _80°C 。所述殼聚糖交聯(lián)劑為戊二醛或聚縮水甘油醚，其中聚縮水甘油醚是指聚 乙二醇雙縮水甘油醚或聚丙三醇三縮水甘油醚。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下突出的優(yōu)點1、本發(fā)明首次將互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備技術(shù)成功應(yīng)用到HA/膠原/ 殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備中，通過PVP的橋梁作用，使得羥基磷灰 石顆粒在膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)基體中分散良好且與基體之間形成有 效、穩(wěn)定的鍵合，且羥基磷灰石在基體中顆粒呈現(xiàn)定向排列，從而在結(jié)構(gòu)和功能上實現(xiàn)納米羥基磷灰石與膠原/殼聚糖基體的有效復(fù)合。2、 本發(fā)明采用以羥基磷灰石溶膠的形式與膠原基體復(fù)合，解決了現(xiàn)有技 術(shù)中以羥基磷灰石粉末形式，采用普通機械攪拌混合制備的納米羥基磷灰石/ 膠原支架中存在著羥基磷灰石與膠原基體之間無法形成有效鍵合，以及羥基 磷灰石顆粒只能松散的分布于膠原框架內(nèi)，并不能有效地實現(xiàn)納米羥基磷灰 石與膠原的有效復(fù)合的問題。3、 由于將互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備技術(shù)應(yīng)用到HA/膠原/殼聚糖互穿 聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備中，互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)是用化學(xué)方法將兩種以上的聚合 物互相貫穿成交織網(wǎng)絡(luò)狀的一類新型復(fù)相聚合物材料，因而本發(fā)明制備的HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)骨組織工程支架解決了膠原及殼聚糖復(fù)合支架 力學(xué)性能不佳的問題，同時獲得了合適的降解速度。4、 本發(fā)明采用具有優(yōu)良的分散穩(wěn)定性，良好的生物相容性和生理安全性 的聚乙烯吡咯烷酮作為模板劑、分散劑和改性劑，在改善材料性能的同時不 至于引起的生理毒性的問題。5、 本發(fā)明制備工藝簡單，操作簡捷，易于推廣應(yīng)用。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步地詳細(xì)說明，但實施方式并不僅限 于此。實施例1一種HA (納米羥基磷灰石)/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方 法包括以下步驟及其工藝條件 步驟一HA溶膠的制備(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K15)同時為模板劑、分散劑、改性劑；(2) 使用去離子水配制含硝酸鈣0.01mol/L，磷酸氫二銨0.006mol/L 的溶液，然后將O. lg PVP K15加入到上述硝酸鈣溶液中充分溶解；(3) 采用100轉(zhuǎn)/分的高速分散機，在氨水控制體系pH值為10.6條件 下，將上述(1) 、 (2)的物料充分進行混合，形成納米羥基磷灰石溶膠， 使該納米羥基磷灰石溶膠體系中鈣磷摩爾比達1.6:1，按質(zhì)量百分比計聚乙 烯吡咯烷酮含量為0.01%;步驟二 HA溶膠的陳化上述納米羥基磷灰石溶膠在2(TC的溫度下，自然放置陳化24小時，然 后再用去離子水充分洗滌溶膠得到顆粒定向排列的納米羥基磷灰石溶膠； 步驟三HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的成型(1) 采用I型膠原，用質(zhì)量百分比濃度為2%的醋酸溶液配制3mg/ml的 膠原溶液；(2) 按殼聚糖:膠原溶質(zhì)的質(zhì)量比為0. 1:1的比例將殼聚糖加入到上述(1) 的膠原溶液中，充分混合后得到膠原/殼聚糖的共混液;(3) 將步驟二的HA與上述(2)的膠原/殼聚糖的共混液混合并采用高 速分散機以100轉(zhuǎn)/分的速度分散得到HA/膠原/殼聚糖的混合液，其中上述(2) 的膠原/殼聚糖的共混液的溶質(zhì):HA溶膠的質(zhì)量比為0. 1:1;(4) 在上述(3)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中加入按質(zhì)量百分比計總 含量為0.01%的混合交聯(lián)劑，在常溫下攪拌交聯(lián)12h，混合交聯(lián)劑中l(wèi)一乙 基—3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)與N—羥基琥珀酰亞胺(NHS) 的質(zhì)量比為1:1;(5) 在上述(4)經(jīng)EDC+NHS交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中再加入 按質(zhì)量百分比計含量為0。01%的戊二醛溶液并在常溫下攪拌交聯(lián)12h;(6) 將上述(5)的經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑以及戊二醛溶液交聯(lián)的HA/ 膠原/殼聚糖的混合液減壓、除氣泡后注入模型，再置于-5'C的超低溫冰箱中 冷凍24小時，接著轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥24小時，即得到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架；步驟四HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的后處理(1) 首先將HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架用質(zhì)量百分比濃度為 0.5%的氨水浸泡1小時，然后再用去離子水浸泡6小時，至少每半小時換一 次水；(2) 將清洗后的支架材料放回模型，再次放入-5"C的超低溫冰箱中冷凍 24小時后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥24小時，最后得到HA/膠原/殼聚 糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架。實施例2--種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法包括以下步驟及其工藝條件-
步驟一HA溶膠的制備
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)同時為模板劑、分散劑、改性劑；
(2) 使用質(zhì)量百分比0.5X的PVP K30水溶液配制含硝酸鈣0. lmol/L， 磷酸氫二鈉0. 06mol/L的溶液；
(3) 采用1000轉(zhuǎn)/分的高速分散機，在氫氧化鈉控制體系pH值為11的 條件下，將上述(1) 、 (2)的物料充分進行混合，形成納米羥基磷灰石溶 膠，使該納米羥基磷灰石溶膠體系中鈣磷摩爾比達1.65:1，按質(zhì)量百分比計 聚乙烯吡咯烷酮含量為0. 5°%;
步驟二 HA溶膠的陳化
將上述羥基磷灰石溶膠移入加熱蒸發(fā)回流裝置，在5(TC蒸發(fā)回流36小 時陳化；然后再用去離子水充分洗滌溶膠得到顆粒定向排列的納米羥基磷灰 石溶膠；
步驟三HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的成型
(1) 采用I型膠原，用質(zhì)量百分比濃度為2%的醋酸溶液配制4mg/ml的 膠原溶液；
(2) 按殼聚糖:膠原溶質(zhì)的質(zhì)量比為0. 25:1的比例將殼聚糖加入到上述 (1)的膠原溶液中，充分混合后得到膠原/殼聚糖的共混液；
(3) 將步驟二的HA與上述步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液混合并 采用高速分散機以1000轉(zhuǎn)/分的速度分散得到HA/膠原/殼聚糖的混合液，其 中步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液的溶質(zhì):HA溶膠的質(zhì)量比為0。25:l;
(4) 在上述(3)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中加入按質(zhì)量百分比計總 含量為0.05%的混合交聯(lián)劑，在常溫下攪拌交聯(lián)12h，混合交聯(lián)劑中l(wèi)一乙 基一3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)與N—羥基琥珀酰亞胺(NHS) 的質(zhì)量比為2:1;
(5) 在上述(4)經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合 液中再加入按質(zhì)量百分比計含量為O. 05%的聚乙二醇雙縮水甘油醚并在常溫 下攪拌交聯(lián)12h;
(6) 將上述(5)的經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑以及聚乙二醇雙縮水甘油醚 交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合液減壓、除氣泡后注入模型，再置于-l(TC的超低溫冰箱中冷凍24小時，接著轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥36小時，即得 到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架；
步驟四HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的后處理
(1) 首先將HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架用濃度為0.05mol/L 的磷酸氫二鈉溶液浸泡2小時，然后再用去離子水浸泡6小時，至少每半小 時換一次水；
(2) 將清洗后的支架材料放回模型，再次放入-l(TC的超低溫冰箱中冷 凍24小時后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥36小時，最后得到HA/膠原/殼 聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架。
實施例3
一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法包括以下步驟及其 工藝條件
步驟一HA溶膠的制備
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K60)同時為模板劑、分散劑、改性劑；
(2) 使用質(zhì)量百分比5X的PVPK60水溶液配制含硝酸鈣0.5mol/L，磷 酸氫二鉀0. 3mol/L的溶液；
(3) 采用2000轉(zhuǎn)/分的高速分散機，在氫氧化鉀控制體系pH值為11. 5 條件下，將上述(1) 、 (2)的物料充分進行混合，形成納米羥基磷灰石溶 膠，使該納米羥基磷灰石溶膠體系中鈣磷摩爾比達1.67:1，按質(zhì)量百分比計 聚乙烯吡咯垸酮含量為5%;
步驟二 HA溶膠的陳化
將上述羥基磷灰石溶膠移入加熱蒸發(fā)回流裝置，在7(TC蒸發(fā)回流48小 時陳化，然后再用去離子水充分洗滌溶膠得到顆粒定向排列的納米羥基磷灰 石溶膠；
步驟三HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的成型
(1) 采用I型膠原，用質(zhì)量百分比濃度為2%的醋酸溶液配制5mg/ml的 膠原溶液；
(2) 按殼聚糖:膠原溶質(zhì)的質(zhì)量比為0. 65:1的比例將殼聚糖加入到上述 (1)的膠原溶液中，充分混合后得到膠原/殼聚糖的共混液；
(3) 將步驟二的HA與上述步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液混合并采用高速分散機以2000轉(zhuǎn)/分的速度分散得到HA/膠原/殼聚糖的混合液，其 中步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液的溶質(zhì):HA溶膠的質(zhì)量比為0,65:1;
(4) 在上述(3)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中加入按質(zhì)量百分比計總 含量為0.1%的混合交聯(lián)劑，在常溫下攪拌交聯(lián)12h，混合交聯(lián)劑中l(wèi)一乙基 —3— (3 —二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)與N—羥基琥珀酰亞胺(NHS) 的質(zhì)量比為4:1;
(5) 在上述(4)經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合 液中再加入按質(zhì)量百分比計含量為0. 1%的聚乙二醇雙縮水甘油醚并在常溫 下攪拌交聯(lián)12h;
(6) 將上述(5)的經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑以及聚乙二醇雙縮水甘油醚 交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合液減壓、除氣泡后注入模型，再置于-2(TC的 超低溫冰箱中冷凍24小時，接著轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥48小時，即得 到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架；
步驟四HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的后處理
(1) 首先將HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架用0. lmol/L的磷酸氫 二鈉溶液浸泡2小時，然后再用去離子水浸泡6小時，至少每半小時換一次 水；
(2) 將清洗后的支架材料放回模型，再次放入-2CTC的超低溫冰箱中冷 凍24小時后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥48小時，最后得到HA/膠原/殼
聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架。 實施例4
一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法包括以下步驟及其 工藝條件
步驟一HA溶膠的制備
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)同時為模板劑、分散劑、改性劑；
(2) 使用去離子水配制含氫氧化鈣lmol/L，磷酸0。6mol/L的溶液，然 后分別將5g PVP K90加入到上述氫氧化鈣和磷酸溶液中充分溶解；
(3) 采用5000轉(zhuǎn)/分的高速分散機，在氫氧化鉀控制體系pH值為12的 條件下，將上述(1) 、 (2)的物料充分進行混合，形成納米羥基磷灰石溶 膠，使該納米羥基磷灰石溶膠體系中鈣磷摩爾比達1.67:1，按質(zhì)量百分比計聚乙烯吡咯烷酮含量為10%; 步驟二 HA溶膠的陳化
將上述羥基磷灰石溶膠移入加熱蒸發(fā)回流裝置，在9CTC蒸發(fā)回流60小
時陳化，然后再用去離子水充分洗滌溶膠得到顆粒定向排列的納米羥基磷灰
石溶膠；
步驟三HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的成型
(1) 采用I型膠原，用質(zhì)量百分比濃度為2%的醋酸溶液配制7mg/ml的 膠原溶液；
(2) 按殼聚糖:膠原溶質(zhì)的質(zhì)量比為1:1的比例將殼聚糖加入到上述(l) 的膠原溶液中，充分混合后得到膠原/殼聚糖的共混液；
(3) 將步驟二的HA與上述步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液混合并 采用高速分散機以5000轉(zhuǎn)/分的速度分散得到HA/膠原/殼聚糖的混合液，其 中步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液的溶質(zhì):HA溶膠的質(zhì)量比為1:1;
(4) 在上述(3)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中加入按質(zhì)量百分比計總 含量為0。5%的混合交聯(lián)劑，在常溫下攪拌交聯(lián)12h，混合交聯(lián)劑中l(wèi)一乙基 一3_ (3 — 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)與N—羥基琥珀酰亞胺(NHS) 的質(zhì)量比為4:1;
(5) 在上述(4)經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合 液中再加入按質(zhì)量百分比計含量為0. 5%的聚丙三醇三縮水甘油醚并在常溫 下攪拌交聯(lián)12h，；
(6) 將上述(5)的經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑以及聚丙三醇三縮水甘油醚 交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合液減壓、除氣泡后注入模型，再置于-65X:的 超低溫冰箱中冷凍24小時，接著轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥48小時，即得 到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架；
步驟四HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的后處理
(1) 首先將HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架用用質(zhì)量百分比濃度 為0. 5mol/L的碳酸氫鈉溶液浸泡2小時，然后再用去離子水浸泡6小時，至 少每半小時換一次水；
(2) 將清洗后的支架材料放回模型，再次放入-65。C的超低溫冰箱中冷 凍24小時后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥48小時，最后得到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架。
實施例5
一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法包括以下步驟及其 工藝條件-
步驟一HA溶膠的制備
(1) 以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)同時為模板劑、分散劑、改性劑；
(2) 使用去離子水配制含氫氧化鈣3mol/L，磷酸氫二鉀1. 8mol/L的溶 液，然后將50g PVP K90加入到上述磷酸氫二鉀中充分溶解；
(3) 采用8000轉(zhuǎn)/分的高速分散機，在氨水控制體系pH值為12條件下， 將上述(1) 、 (2)的物料充分進行混合，形成納米羥基磷灰石溶膠，使該 納米羥基磷灰石溶膠體系中鈣磷摩爾比達1.7:1，按質(zhì)量百分比計聚乙烯吡 咯垸酮含量為50%;
步驟二 HA溶膠的陳化
上述溶膠在10(TC的溫度下放置，陳化48小時，然后再用去離子水充分 洗滌溶膠得到顆粒定向排列的納米羥基磷灰石溶膠；
步驟三HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的成型
(1) 采用I型膠原，用質(zhì)量百分比濃度為2%的醋酸溶液配制10mg/ml 的膠原溶液；
(2) 按殼聚糖:膠原溶質(zhì)的質(zhì)量比為9:1的比例將殼聚糖加入到上述(l) 的膠原溶液中，充分混合后得到膠原/殼聚糖的共混液；
(3) 將步驟二的HA與上述步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液混合并 采用高速分散機以8000轉(zhuǎn)/分的速度分散得到HA/膠原/殼聚糖的混合液，其 中步驟三(2)的膠原/殼聚糖的共混液的溶質(zhì):HA溶膠的質(zhì)量比為9";
(4) 在上述(3)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中加入按質(zhì)量百分比計總 含量為1%的混合交聯(lián)劑，在常溫下攪拌交聯(lián)12h，混合交聯(lián)劑中l(wèi)一乙基一 3— (3 — 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)與N—羥基琥珀酰亞胺(NHS)的 質(zhì)量比為4:1;
(5) 在上述(4)經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合 液中再加入按質(zhì)量百分比計含量為1%的聚丙三醇三縮水甘油醚并在常溫下 攪拌交聯(lián)12h;(6)將上述(5)的經(jīng)EDC+NHS混合交聯(lián)劑以及聚丙三醇三縮水甘油醚 交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合液減壓、除氣泡后注入模型，再置于-8(TC的 超低溫冰箱中冷凍24小時，接著轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥48小時，即得 到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架；
步驟四HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的后處理
(1) 首先將HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架用用質(zhì)量百分比濃度
為lmol/L的碳酸氫鈉溶液浸泡2小時，然后再用去離子水浸泡6小時，至少 每半小時換一次水；
(2) 將清洗后的支架材料放回模型，再次放入-8(TC的超低溫冰箱中冷 凍24小時后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥48小時，最后得到HA/膠原/殼 聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架。
權(quán)利要求
1、一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟及其工藝條件步驟一HA即納米羥基磷灰石溶膠的制備(1)以PVP即聚乙烯吡咯烷酮同時為模板劑、分散劑和改性劑；(2)配制0.01～3mol/L的鈣鹽和0.006～1.8mol/L的磷酸鹽溶液或配制0.01～3mol/L的鈣鹽溶液和0.006～1.8mol/L的磷酸；(3)采用高速分散機，在堿液控制體系中，將上述(1)、(2)的物料充分進行混合，形成納米羥基磷灰石溶膠；該納米羥基磷灰石溶膠體系中鈣磷摩爾比達1.6～1.7∶1，按質(zhì)量百分比計聚乙烯吡咯烷酮含量為0.01～50％；步驟二HA溶膠的陳化上述溶膠在20～100℃的溫度下陳化至少24小時，然后用去離子水充分洗滌溶膠得到顆粒定向排列的HA溶膠；步驟三HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的成型(1)用醋酸溶液配制3mg/ml～10mg/ml的膠原溶液；(2)按殼聚糖∶膠原溶質(zhì)的質(zhì)量比為0.1～9∶1的比例將殼聚糖加入到上述(1)的膠原溶液中，充分混合后得到膠原/殼聚糖的共混液；(3)將步驟二的HA溶膠與上述(2)的膠原/殼聚糖的共混液混合并采用高速分散機分散得到HA/膠原/殼聚糖的混合液，其中上述(2)的膠原/殼聚糖共混液的溶質(zhì)∶HA溶膠的質(zhì)量比為0.1～9∶1；(4)在上述(3)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中加入按質(zhì)量百分比計含量為0.01～1％的混合交聯(lián)劑，所述混合交聯(lián)劑是指1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺在常溫下攪拌交聯(lián)至少12h的混合溶液，其中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為1～4∶1；(5)在上述(4)經(jīng)1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合液中再加入按質(zhì)量百分比計含量為0.01～1％的殼聚糖交聯(lián)劑，并在常溫下攪拌交聯(lián)至少12h；(6)將上述(5)的經(jīng)混合交聯(lián)劑以及殼聚糖交聯(lián)劑交聯(lián)的HA/膠原/殼聚糖的混合液減壓、除氣泡后注入模型，再置于超低溫冰箱中冷凍至少24小時，接著轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥至少24小時，即得到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架；步驟四HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的后處理(1)首先將HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架用氨水或緩沖溶液浸泡1～3小時，然后再用去離子水浸泡至少6小時，并至少每半小時換一次水；(2)將清洗后的支架材料放回模型，再次放入超低溫冰箱中冷凍至少24小時后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中冷凍干燥至少24小時，最后得到HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于步驟一 (3)所述物料混合，聚乙烯吡咯垸酮的加入 有以下兩種方式，擇一使用(1) 將聚乙烯吡咯垸酮加入到鈣鹽溶液或磷酸鹽溶液或磷酸中，或加入 到鈣鹽和磷酸鹽或磷酸的混合溶液中；(2) 先配制聚乙烯吡咯垸酮水溶液，再用聚乙烯吡咯烷酮水溶液配制鈣 鹽和磷酸鹽或磷酸溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支 架的制備方法，其特征在于所述鈣鹽為硝酸鈣或氫氧化鈣；磷酸鹽采用磷 酸氫二銨、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于步驟二所述陳化有以下兩種方式，擇一使用-(1) 將納米羥基磷灰石溶膠自然放置陳化；(2) 將納米羥基磷灰石溶膠移入加熱蒸發(fā)回流裝置陳化。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于所述堿液控制體系pH值大于10.5。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于；所述堿液為氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法，其特征在于所述緩沖溶液為磷酸氫二鈉或碳酸氫鈉溶液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于所述高速分散機的速度范圍為100 8000轉(zhuǎn)/分。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于所述所采用聚乙烯吡咯烷酮的類型為PVP K15、 PVP PVP K30、 PVP K60或PVP K90;所述膠原為I型膠原。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于所述超低溫冰箱中冷凍的溫度范圍為-5'C -80°C。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的 制備方法，其特征在于所述殼聚糖交聯(lián)劑為戊二醛或聚縮水甘油醚。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架 的制備方法，其特征在于所述聚縮水甘油醚是指聚乙二醇雙縮水甘油醚或 聚丙三醇三縮水甘油醚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HA/膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)支架的制備方法。該法首先在堿液控制體系中形成含聚乙烯吡咯烷酮的HA溶膠體系，經(jīng)陳化洗滌得到顆粒定向排列的HA溶膠，再與膠原和殼聚糖共混液混合，采用高速分散機分散得HA/膠原/殼聚糖的混合液，將經(jīng)混合交聯(lián)劑以及殼聚糖交聯(lián)劑交聯(lián)的混合液減壓、除氣泡后注入模型，經(jīng)后處理得支架。本發(fā)明以HA溶膠的形式與基體復(fù)合，呈現(xiàn)顆粒定向排列的HA在膠原/殼聚糖互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)基體中分散良好，與基體之間形成有效、穩(wěn)定的鍵合，從而在結(jié)構(gòu)和功能上實現(xiàn)HA與膠原/殼聚糖基體的有效復(fù)合。同時也有效地解決了膠原及殼聚糖材料本身存在的問題。本法工藝簡單，操作簡捷，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號A61L27/40GK101590293SQ200910149959
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者寧成云, 尹兆益, 張德貴, 王迎軍, 坤 魏 申請人:華南理工大學(xué);廣州南楓生物科技有限公司