專利名稱：長效干擾素α綴合物的液體制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及長效干擾素α綴合物的液體制劑，其包含藥用有效量的干擾素α綴合物和不含白蛋白的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑。
背景技術(shù)：
在1957年，Isaacs和Lindenmann注意到當(dāng)小雞感染甲型流感病毒時干擾所述病毒的因子，發(fā)現(xiàn)了干擾素(Isaacs, K.和 Lindenmann, J.，Proc.R.Soc.Lond.，B147,258-267(1957))。人干擾素是被稱為細胞因子的蛋白質(zhì)，其允許細胞之間的通訊從而可引發(fā)消滅病原體(如病毒)之免疫系統(tǒng)的保護性防御。根據(jù)釋放所述干擾素的細胞類型，干擾素可被分類為干擾素α、干擾素β和干擾素Y (Kirchner, H.等,Tex.Rep.Biol.Med.,41,89-93(1981):Stanton, G.J.等，Tex.R印.Biol.Med.，41，84-88 (1981))。即，干擾素 α由B淋巴細胞釋放,干擾素β由裸淋巴細胞(null lymphocyte)和巨曬細胞釋放,而干擾素Y由T淋巴細胞在巨噬細胞幫助下釋放。報道稱干擾素表現(xiàn)出抗病毒活性、抗癌活性、激活NK (自然殺傷)細胞和對髓細胞生長的協(xié)同抑制作用(Klimpel 等，J.1mmunol., 129, 76-78 (1982) ；Fleischmann, ff.R.等，J.Natl.Cancer Inst.,65,863-966(1980) ；ffeigent.等，Infec.1mmun.,40,35-38(1980))。從那時起，大量研究發(fā)現(xiàn)除表現(xiàn)出抗病毒作用之外，干擾素還在細胞內(nèi)基因的表達、結(jié)構(gòu)和功能中充當(dāng)調(diào)節(jié)因子，尤其是直接的抗增殖作用。此外，干擾素的一個功能是對抗由感染和多種腫瘤引起的多種疾病。在暴露于分裂素、病毒或腫瘤細胞之后白細胞中產(chǎn)生干擾素α。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)干擾素α的至少20種基因的多基因家族并且已知其編碼大多數(shù)由165或166個氨基酸組成的多肽。

臨床測試已證明重組人干擾素α在治療多種實體瘤方面有效。特別地，已知干擾素α對膀胱癌、腎癌和AIDS相關(guān)卡波西式肉瘤(AIDS-associated kaposi’s sarcoma)具有有效的治療作用(Torti，F(xiàn).M.，J.Clin.0ncol.，6，476-483 (1988) ；Vugrin,D.等，CancerTreat.R印.，69，817-820 (1985) ；Rios,A.等，J.Clin.0ncol.，3，506-512 (1985))。此外，最近的報道提到，干擾素α在治療上適用于治療丙型肝炎(Davis，G.G.等，N.Engl.J.Med.，321,1501-1506(1989)) 0基于這些新發(fā)現(xiàn)，干擾素α的治療領(lǐng)域變得更廣。多肽(例如干擾素α)因其低穩(wěn)定性而傾向于容易變性、被血液中的蛋白水解酶降解并且易于通過腎或肝。因此，需要頻繁地向患者施用蛋白質(zhì)藥物(包含作為藥物有效組分的多肽)以維持期望的血液水平濃度和效價。但是，蛋這種白質(zhì)藥物的頻繁施用(大多數(shù)為注射形式)造成患者疼痛。為了解決這些問題，進行了許多努力來改善蛋白質(zhì)藥物的血清穩(wěn)定性并使血液中的藥物在較長的時間內(nèi)維持在高水平，從而使藥物的藥效最大化。為了在長效制劑中使用，必須將蛋白質(zhì)藥物配制成高穩(wěn)定性的并且其效價維持在足夠高的水平而不引起患者免疫應(yīng)答。穩(wěn)定蛋白質(zhì)并預(yù)防酶促降解和通過腎臟清除的常規(guī)方法是用具有高溶解度的聚合物(例如聚乙二醇(PEG))來對蛋白質(zhì)藥物表面進行化學(xué)修飾。通過與靶蛋白的特定區(qū)域或多個區(qū)域結(jié)合，PEG使蛋白質(zhì)穩(wěn)定并防止水解，而不引起嚴重的副作用(Sada等，J.Fermentation Bioengineering71:137-139)。但是,盡管聚乙二醇化能夠提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，但其也存在問題，例如大大降低生理活性蛋白質(zhì)的效價。此外，產(chǎn)量隨著PEG的分子量的增加而降低，這是由于蛋白質(zhì)的反應(yīng)性降低。用于改善生理活性蛋白質(zhì)體內(nèi)穩(wěn)定性的另一種替代性策略是借助遺傳重組技術(shù)將生理活性蛋白質(zhì)的基因與編碼具有高血清穩(wěn)定性之蛋白質(zhì)的基因連接起來，并且培養(yǎng)經(jīng)重組基因轉(zhuǎn)染的細胞以產(chǎn)生融合蛋白。例如，融合蛋白可這樣制備:通過遺傳重組將白蛋白(已知的在增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面最有效的蛋白質(zhì))或其片段與目的生理活性蛋白質(zhì)綴合(PCT 公開 N0.W093/15199 和 W093/15200、歐洲專利公開 N0.413，622)。另一種方法是使用如美國專利N0.5，045，312所述的免疫球蛋白，其中通過使用交聯(lián)劑將人生長激素與牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白綴合。所述綴合物與未修飾的生長激素相比具有增強的活性。采用碳二亞胺或戊二醛作為交聯(lián)劑。但是，與肽非特異性鍵合的這種低分子量交聯(lián)劑不允許形成均一的綴合物，并且甚至在體內(nèi)是有毒的。此外，該專利表明活性提高僅僅是由于與生長激素的化學(xué)偶聯(lián)而發(fā)生。該專利的方法不能確保多種類型的多肽藥物的活性增強，因此該專利甚至沒有認識到與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)的因素，例如持續(xù)時間、血液半衰期等。由此，需要具有改善的體內(nèi)持續(xù)時間和穩(wěn)定性的長效蛋白質(zhì)藥物制劑。為了在長效藥物制劑中使用，最近韓國專利 N0.10-0567902 (Physiologically active polypeptideconj ugate having improved in vivo durability)和 10-0725315(Protein complexusing an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof)中提出了其中將生理活性多肽與非多肽聚合物和`
為了將長效干擾素α綴合物應(yīng)用于藥物產(chǎn)品，必須維持其在體內(nèi)的藥效，同時抑制在儲存和運輸期間的物理化學(xué)變化，例如光、熱或添加劑引起的變性、聚集、吸附或水解。與干擾素α多肽自身相比，長效干擾素α綴合物由于其體積和分子量增加更難以穩(wěn)定化。一般來說，蛋白質(zhì)具有非常短的半衰期，并且當(dāng)暴露于不合適的溫度、水-空氣界面、高壓、物理/機械應(yīng)力、有機溶劑、微生物污染等時，其發(fā)生變性，如單體聚集、聚集沉淀以及吸附到容器表面上。在變性后，蛋白質(zhì)失去其固有的物理化學(xué)特性和生理活性。一旦變性，蛋白質(zhì)幾乎不能恢復(fù)其原有特性，因為變性是不可逆的。特別在蛋白質(zhì)(例如干擾素α )以小至幾百微克/注射的劑量施用的情況下，當(dāng)它們喪失穩(wěn)定性并因此吸附到容器表面上時，產(chǎn)生的損失相對較大。此外，在變性過程中吸附的蛋白質(zhì)容易聚集，并且變性蛋白質(zhì)的聚集體在施用到體內(nèi)時，其充當(dāng)抗原(與體內(nèi)合成的蛋白質(zhì)不同)。因此，蛋白質(zhì)必須以足夠穩(wěn)定的形式施用。已研究了許多方法以防止蛋白質(zhì)在溶液中變性(John Geigert, J.ParenteralSc1.Tech.,43(5):220-224,1989 ；David Wong, Pharm.Tech., October,34-48,1997 ；ffeiWang.，Int.J.Pharm.，185: 129-188,1999 ；ffillem Norde, Adv.Colloid Interface Sc1.，25:267-340,1986 ；Michelle et.al.，Int.J.Pharm.120: 179-188,1995)。
為了實現(xiàn)穩(wěn)定性的目標，使一些蛋白質(zhì)藥物經(jīng)歷凍干。但是，凍干產(chǎn)品不方便，因為它們必須重新溶解于注射用水中使用。此外，因為其生產(chǎn)過程包括凍干，所以需要在大容量凍干機中進行巨大投資。還有人提出通過使用噴霧干燥劑使蛋白質(zhì)收縮(contraction)。但是，該方法由于產(chǎn)量低而并不經(jīng)濟有利。此外，噴霧干燥過程將蛋白質(zhì)暴露于高溫，因此對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性具有負面影響。作為克服該限制的替代方案，出現(xiàn)了穩(wěn)定劑，當(dāng)將其添加到蛋白質(zhì)的溶液中時，可抑制蛋白質(zhì)藥物的物理化學(xué)變化并且維持體內(nèi)藥效，甚至在長時間儲存之后也是如此。穩(wěn)定劑有碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、表面活性劑、聚合物和鹽。尤其是人血清白蛋白已被廣泛用于穩(wěn)定多種蛋白質(zhì)藥物，并且其在該方面的性能已得到證實(Edward Tarelli等，Biologicals, 26:331-346)。人血清白蛋白的典型純化過程包括使生物污染物(如支原體、朊病毒(prion)、細菌和病毒)失活，或者篩選或檢查一種或更多種生物污染物或病原體的存在。但是，總存在因生物污染物未完全除去或失活而使患者處于與其接觸的風(fēng)險。例如，篩選來自供體的人血液以檢查它是否包含某些病毒。但是，該過程不總是可靠的。特別地，以非常小的數(shù)目存在的某些病毒不能被檢測到。此外，不同蛋白質(zhì)由于其化學(xué)差異可逐漸失活，因為它們在儲存期間經(jīng)歷不同的比率和條件。穩(wěn)定劑對蛋白質(zhì)儲存期的作用因蛋白質(zhì)而異。即，根據(jù)目的蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性，不同穩(wěn)定劑可以以不同比率使用。當(dāng)同時使用時，不同穩(wěn)定劑因其競爭和錯誤操作可引起相反作用。不同穩(wěn)定劑組合也引發(fā)不同的作用，因為它們在儲存期間引起蛋白質(zhì)特征或濃度改變。因為每種穩(wěn)定劑穩(wěn)定活性的適用性與給定的濃度范圍相關(guān)，所以在組合不同種類和濃度的不同穩(wěn)定劑時必須注意。特別地，對于具有改善的體內(nèi)持續(xù)時間和穩(wěn)定性的長效干擾素α綴合物來說，因為它們由生理活性肽干擾素α、非肽聚合物和免疫球蛋白片段Fe構(gòu)成，所以其分子量和體積與普通干擾素α的 相當(dāng)不同。而且，因為生理活性肽干擾素α和免疫球蛋白片段Fe 二者都是肽或蛋白質(zhì)，所以它們必須同時穩(wěn)定。如上所述，不同蛋白質(zhì)由于其化學(xué)差異可逐漸失活，因為它們在儲存期間經(jīng)歷不同的比率和條件。此外，分別適用于肽或蛋白質(zhì)的不同穩(wěn)定劑在同時使用時，由于其競爭和錯誤操作可導(dǎo)致不良作用，而不是期望的作用。因此，難以建立被設(shè)計成同時穩(wěn)定干擾素α和免疫球蛋白Fe區(qū)域的用于長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定劑組合物。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題在本發(fā)明之前，對開發(fā)能夠長時間維持藥效并且沒有病毒感染的用于長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定液體制劑進行的集中和徹底研究產(chǎn)生了這樣的發(fā)現(xiàn):包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑的不含白蛋白的穩(wěn)定劑賦予長效干擾素α綴合物增強的穩(wěn)定性。問題的解決方案因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種包含藥用有效量的長效干擾素α綴合物和不含白蛋白的穩(wěn)定劑的液體制劑，其中所述長效干擾素α綴合物中干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接，并且所述穩(wěn)定劑由緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑構(gòu)成。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于制備長效干擾素α綴合物的液體制劑的方法，其包括a)構(gòu)建長效干擾素α綴合物；以及b)將步驟a)的長效干擾素α綴合物與不含白蛋白的穩(wěn)定劑混合，所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑。本發(fā)明的又一個目的是提供用于干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域綴合之長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定劑，其中所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑并且不含白蛋白。本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于通過穩(wěn)定劑穩(wěn)定長效干擾素α綴合物的方法，其中所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑并且不含白蛋白，并且所述長效干擾素α綴合物具有與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接的干擾素α。發(fā)明的有利效果因為不含人血清白蛋白和其他對身體有害的潛在因子，所以根據(jù)本發(fā)明的長效干擾素α綴合物的液體制劑沒有病毒感染的問題。另外，所述液體制劑確保長效干擾素α綴合物優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性，其中干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域連接，并且與干擾素α的天然形式相比，其分子量更大且作用持續(xù)時間更長，因此比其他穩(wěn)定劑在經(jīng)濟上更有利。


圖1是在4°C下儲存6個月時間中使用RH-HPLC進行分析時，實施例6中建立的液體制劑(PH5.5)中長效干擾素α綴合物穩(wěn)定性的圖。實施本發(fā)明的最佳方案根據(jù)其一方面，本發(fā)明提供了包含藥用有效量的長效干擾素α綴合物和不含白蛋白的穩(wěn)定劑的液體制劑，其中所述長效干擾素α綴合物中干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接，并且所述穩(wěn)定劑由緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑構(gòu)成。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明提供了用于干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域綴合之長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定劑，其中所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑并且不含白蛋白。根據(jù)其又一方面，本發(fā)明提供了一種用于通過穩(wěn)定劑穩(wěn)定長效干擾素α綴合物的方法，其中所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑并且不含白蛋白，并且所述長效干擾素α綴合物的干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接。本文使用的術(shù)語“長效干擾素α綴合物旨在指蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含生理活性寡肽(例如干擾素a (IFNa))、兩端具有官能團的至少一種非肽聚合物和至少一種免疫球蛋白Fe區(qū)域,其中所述成分通過共價鍵共價連接在一起。因此，本文所用術(shù)語“長效”指與天然形式的干擾素α相比延長的作用持續(xù)時間。術(shù)語“綴合物”指其中干擾素α通過非肽聚合物與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接的構(gòu)建體。長效干擾素α綴合物是改進的蛋白質(zhì)藥物，其被設(shè)計成使固有生理活性的喪失最小化并且使體內(nèi)持續(xù)時間最大提高。為了用于本發(fā)明，將干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域結(jié)合起來。用于本發(fā)明的干擾素α可優(yōu)選是人干擾素α。另外，所述干擾素α可以是天然INF α、天然INF α的衍生物或活性與天然INF α類似的多肽。即，本發(fā)明的干擾素α可包含野生型干擾素α氨基酸序列或其氨基酸序列突變體。本文使用的術(shù)語“氨基酸序列突變體”指由一個或更多個氨基酸殘基的缺失、插入、保守或非保守性替換或其組合引起的與野生型不同的氨基酸序列。所述干擾素α可以是來自人或動物的天然干擾素α，或者可以是來自轉(zhuǎn)化細胞的重組干擾素α。優(yōu)選是使用經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌制備的重組人干擾素a (HuIFNa)0除非其生物學(xué)活性顯著偏離野生型的活性，否則通過氨基酸替換、缺失或插入形成的突變體也包括于干擾素α的范圍內(nèi)。本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白Fe區(qū)域”指缺少輕鏈和重鏈之可變區(qū)(重鏈恒定區(qū)I (Cm)和輕鏈恒定區(qū)I(Cu))的免疫球蛋白片段，即由重鏈的恒定區(qū)2和3(CH2和Ch3)構(gòu)成的片段。任選地，所述免疫球蛋白Fe區(qū)域可還包含鉸鏈區(qū)。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)域可以是延伸的Fe區(qū)域，其包含除重鏈恒定區(qū)2和3(CH2和Ch3)之外的一部分或完整的重鏈恒定區(qū)I (Chi)和/或輕鏈恒定區(qū)I (Cu)，只要它顯示出與典型Fe區(qū)域的作用基本上相同或比其優(yōu)越的作用。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)域可由缺少氨基酸序列之重要部分的Ch2和/或Ch3構(gòu)成。因此，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)域可由以下構(gòu)成:1)CH1結(jié)構(gòu)域、Ch2結(jié)構(gòu)域、Ch3結(jié)構(gòu)域和Ch4結(jié)構(gòu)域，2) CHl結(jié)構(gòu)域和Ch2結(jié)構(gòu)域，3) Chi結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域，4) Ch2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，5) —種或更多種恒定結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)(或部分鉸鏈區(qū))的組合，或6)各個重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的二聚體。此外，野生型Fe的氨基酸序列突變體可包括在本發(fā)明免疫球蛋白Fe區(qū)域的范圍內(nèi)。本文使用的術(shù)語“氨基酸序列突變體”指由一個或更多個氨基酸殘基缺失、插入、保守或非保守性替換或其組合產(chǎn)生的與野生型不同的氨基酸序列。例如，IgG Fe第214至238、297至299、318至322或327至331位的氨基酸殘基(已知對于連接是重要的)可用作適用于修飾的位點。

本發(fā)明可使用多種衍生物，例如通過除去二硫鍵位點、從天然Fe中除去幾個N端氨基酸、或?qū)⒓琢虬彼崽砑拥教烊籉e N端制備的那些。此外，可消除補體結(jié)合位點(complement fixation site)(例如Clq結(jié)合位點)或ADCC位點以從天然Fe區(qū)域中除去效應(yīng)功能。國際專利公開N0.W097/34631和W096/32478中公開了制備免疫球蛋白Fe區(qū)域的氨基酸序列突變體的技術(shù)。蛋白質(zhì)或肽分子中不改變所述分子活性的氨基酸取代為本領(lǐng)域所公知(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最常見的取代發(fā)生在氛基酸殘基 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/IIe、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly之間。任選地，可通過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙?；王０坊揎棸被?。上述Fe衍生物表現(xiàn)出與野生型生物學(xué)活性相同的生物學(xué)活性,但是其對熱和pH的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提聞。用于本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)域可被糖基化為與天然形式相同的程度或比其更高或更少的程度，或者可以被去糖基化或無糖基化(aglycosylated)?？赏ㄟ^典型方法(例如通過使用化學(xué)方法、酶促方法或遺傳工程方法)實現(xiàn)免疫球蛋白區(qū)域糖基化或去糖基化的提高或降低。本文中，在去糖基化時，免疫球蛋白Fe區(qū)域的補體(Clq)結(jié)合力顯著降低并且具有降低的或沒有抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性，因此它在體內(nèi)不誘導(dǎo)不必要的免疫應(yīng)答。在本上下文中，免疫球蛋白Fe區(qū)域的去糖基化或無糖基化更符合藥物載體的目的。本文使用的術(shù)語“去糖基化”旨在意指將糖從Fe區(qū)域中酶促除去。當(dāng)術(shù)語“無糖基化”與Fe區(qū)域連起來使用時意指由原核生物(優(yōu)選大腸桿菌)表達的不含糖的Fe區(qū)域。為了在本發(fā)明中使用，免疫球蛋白Fe區(qū)域具有人免疫球蛋白Fe區(qū)域或其密切相關(guān)的類似物的氨基酸序列。Fe片段可以從分離自動物(包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠)的天然形式中得到。此外，免疫球蛋白Fe區(qū)域可以是來自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM或者由其組合或其雜合體制得的Fe區(qū)域。優(yōu)選地，它來自在人血中最豐富的蛋白質(zhì)IgG或IgM，并且最優(yōu)選地來自已知增強配體結(jié)合蛋白的血清半衰期的IgG。本文中，免疫球蛋白Fe可以通過分離人或動物有機體的完整免疫球蛋白并用蛋白水解酶處理它們而從天然免疫球蛋白中得到，或者，它可以是得自其經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細胞或微生物的重組體或衍生物。優(yōu)選的是由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的重組人免疫球蛋白Fe。本文使用的術(shù)語“組合”意指編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白Fe區(qū)域的多肽與不同來源的單鏈多肽連接以形成二聚體或多聚體。S卩，二聚體或多聚體可由選自IgG Fc.1gAFe、IgM Fe、IgD Fe和IgE Fe片段的兩種或更多種片段形成。本文使用的術(shù)語“雜合體”意指編碼不同來源的兩種或更多種免疫球蛋白Fe區(qū)域的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fe區(qū)域中。在本發(fā)明中，多種雜合體是可能的。即，結(jié)構(gòu)域雜合體可由選自以下的一個至四個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成:CH1、CH2、IgG Fe的Ch3和CH4、IgM Fe、IgA Fe、IgE Fe和IgD Fe，，并且可包含鉸鏈區(qū)。另一方面，IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型，并且本發(fā)明包括其組合和雜合體。優(yōu)選的是IgG2和IgG4亞 型，最優(yōu)選的是很少具有效應(yīng)功能(如CDC (補體依賴性細胞毒性))的IgG4Fc區(qū)域。作為本發(fā)明的藥物載體，最優(yōu)選的免疫球蛋白Fe區(qū)域是人IgG4來源的無糖基化Fe區(qū)域。來源于人的Fe區(qū)域比非人來源Fe區(qū)域更優(yōu)選，后者可在人體中充當(dāng)抗原并引起不期望的免疫應(yīng)答，如產(chǎn)生針對抗原的新抗體。通過將干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域連接在一起來制備用于本發(fā)明的長效干擾素α綴合物。對此，干擾素α和免疫球蛋白Fe區(qū)域可通過非肽聚合物交聯(lián)，或者可以使用重組技術(shù)形成融合蛋白。如韓國專利N0.10-0725315所公開的，可使用遺傳重組技術(shù)制備用于本發(fā)明的長效干擾素α綴合物。用于交聯(lián)的非肽聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖(dextran)、聚乙烯基乙醚(polyvinyl ethyl ether)、可生物降解聚合物(如PLA(聚乳酸)、PLGA(聚乳酸-乙醇酸))、脂質(zhì)聚合物、甲殼素、透明質(zhì)酸及其組合。最優(yōu)選聚乙二醇。本領(lǐng)域公知的并且能夠易于由本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員制備的其衍生物也包括于本發(fā)明的范圍中。根據(jù)本發(fā)明的長效干擾素α綴合物的液體制劑包含可藥物接受量的長效干擾素α綴合物。本文使用的術(shù)語“藥用有效量”旨在指以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理益處/風(fēng)險比來治療疾病的藥物組合物的足夠量。有效量可根據(jù)多種因素而改變，所述因素包括治療疾病的嚴重程度和類型、患者年齡和性別、藥物活性、對藥物的敏感性、施用時間、施用途徑、排泄速率、治療期長度、與其他藥物的共同施用以及醫(yī)學(xué)和藥物領(lǐng)域公知的其他參數(shù)。通常，干擾素α的藥用有效量范圍為每個一次性瓶30至200 μ g。用于本發(fā)明的長效干擾素α綴合物的濃度為約0.1至50 μ g/ml,優(yōu)選約0.1至5.0 μ g/ml。特別地，具有改善的體內(nèi)持續(xù)時間和穩(wěn)定性的長效干擾素α綴合物之分子量和體積與一般干擾素α的相當(dāng)不同，因為它們由干擾素α和免疫球蛋白Fe區(qū)域構(gòu)成。另外，因為生理活性肽干擾素α和免疫球蛋白Fe區(qū)域二者都是肽或蛋白質(zhì)，所以它們必須被同時穩(wěn)定。為了滿足該要求，根據(jù)本發(fā)明提供了穩(wěn)定劑。本文使用的術(shù)語“穩(wěn)定劑”旨在指允許長效干擾素α綴合物安全儲存的物質(zhì)。術(shù)語“穩(wěn)定”旨在意指在儲存條件下某時間段內(nèi)活性成分的損失不高于預(yù)定的比例(通常最高10%)。當(dāng)在5±3°C下儲存2年、在25±2°C下6個月或在40±2°C下一至兩周之后，長效干擾素α綴合物保留其原有活性的90%或更多(優(yōu)選其原有活性的95%或更高)時，應(yīng)理解為是穩(wěn)定的。對于例如長效干擾素α綴合物的蛋白質(zhì)而言，其儲存穩(wěn)定性對于抑制干擾素α樣抗原性物質(zhì)的可能生成以及確保準確施用量是重要的。在儲存期間，除非制劑中的長效干擾素α綴合物聚集或破裂并形成抗原性物質(zhì)，否則可將約10%的干擾素α活性損失理解為是施用所允許的。適用于賦予長效干擾素α綴合物穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、等張劑和非離子型表面活性劑，并且任選地還包含甲硫氨酸。穩(wěn)定劑中的緩沖劑在使液體制劑的pH維持恒定中發(fā)揮作用以防止pH波動，從而穩(wěn)定長效干擾素α綴合物。用于本發(fā)明的緩沖劑可包括可藥物接受的PH緩沖劑，包括堿性鹽(磷酸鈉或磷酸鉀、其氫鹽或二氫鹽)、檸檬酸鈉/檸檬酸、乙酸鈉/乙酸及其組合。參照實施例部分，長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定性根據(jù)緩沖劑的pH值而改變。在檸檬酸鹽緩沖劑，PH5.5下檢測到長效干擾素α綴合物的最高穩(wěn)定性(實施例2)。適用于本發(fā)明的是磷酸鹽緩沖劑或檸檬酸緩沖劑，后者更優(yōu)選。檸檬酸鹽緩沖劑中磷酸鹽的濃度范圍優(yōu)選為5至IOOmM,并且更優(yōu)選10至50mM。緩沖劑優(yōu)選pH為4.0至7.0，更優(yōu)選pH為5.0至7.0，更更優(yōu)選pH為5.2至7.0并且最優(yōu)選pH為5.2至6.0。糖醇是碳水化合物的衍生形式，其羰基(=CO)被還原為羥基(-0H)。在本發(fā)明中，糖醇有助于長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定性。在液體制劑中，糖醇優(yōu)選以I至10% (w/v)的濃度，并且更優(yōu)選以5% (w/v)的濃度使用。糖醇可選自赤蘚糖醇、半乳糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、核糖醇、麥芽糖醇、山梨糖醇、乳糖 醇和甘露醇，優(yōu)選甘露醇、山梨糖醇或其組合。參照實施例部分，發(fā)現(xiàn)甘露醇在普通緩沖溶液條件下最高度地有助于長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定性(實施例1)。
等張劑不僅起到當(dāng)液體制劑中的長效干擾素α綴合物進入體內(nèi)時維持合適滲透壓的作用，還起到進一步穩(wěn)定液體制劑中長效干擾素α綴合物的作用。等張劑的實例包括水溶性無機鹽。其中最優(yōu)選的代表是氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，將氯化鈉用作等張劑提高了緩沖劑、糖醇和非離子型表面活性劑存在下長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定性。由這些數(shù)據(jù)可理解，氯化鈉作為等張劑與糖醇和非離子型表面活性劑一起對長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定性具有協(xié)同作用。優(yōu)選地，等張劑的濃度為約5至200mM，并且更優(yōu)選約150mM。在該范圍內(nèi)，可根據(jù)組分的種類和量來調(diào)整等張劑的濃度，使得液體制劑是等張的?，F(xiàn)轉(zhuǎn)到非離子型表面活性劑，其降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力以防止蛋白質(zhì)被吸附到或聚集于疏水表面上。聚山梨酯(polysorbate)的非離子型表面活性劑和泊洛沙姆(poloxamer)的非離子型表面活性劑優(yōu)選地適合用于本發(fā)明。它們可以單獨或組合使用。更優(yōu)選聚山梨酯的非離子型表面活性劑。其中有聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80，更優(yōu)選聚山梨酯80。參照實施例部分，觀察到包含聚山梨酯80的長效干擾素α綴合物之液體制劑與包含泊洛沙姆188之液體制劑的穩(wěn)定性相似或比其優(yōu)越。此外，檢測到包含0.02%聚山梨酯80的液體制劑比包含0. 005%聚山梨酯80的液體制劑穩(wěn)定性更高(實施例3)。不建議使用高濃度的非離子型表面活性劑，因為如果非離子型表面活性劑以高濃度存在，則會干擾蛋白質(zhì)測定，例如UV光譜法或等電聚焦法，使得難以準確評估蛋白質(zhì)的濃度或穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的液體制劑可包含優(yōu)選濃度為0.1% (w/v)或更低，更優(yōu)選濃度為0.001至0.05% (w/v)并且最優(yōu)選濃度為0.02% (w/v)的非離子型表面活性劑。本發(fā)明的穩(wěn)定劑還可包含甲硫氨酸。防止歸因于溶液中蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的雜質(zhì)，甲硫氨酸可進一步穩(wěn)定目的蛋白質(zhì)。甲硫氨酸可優(yōu)選以基于制劑總體積的0.05%至0.1%(w/v)的濃度,更優(yōu)選0.01%至0.1 % (w/v)的濃度使用。參照實施例部分，發(fā)現(xiàn)制劑中氧化的長效干擾素α綴合物的含量在甲硫氨酸不存在下隨時間升高，但是在0.01%甲硫氨酸存在下保持相對恒定，表明包含甲硫氨酸的液體制劑可進一步穩(wěn)定長效干擾素α綴合物(實施例5)。此外，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定劑優(yōu)選不含白蛋白。因為從人血中制備，所以可作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的人血清白蛋白有被人來源的致病性病毒污染的可能性。明膠或牛血清白蛋白可在一些患者中引起疾病或引起變應(yīng)反應(yīng)。由于不含人來源或動物來源的血清白蛋白或異源蛋白質(zhì)(如純化明膠)，因此本發(fā)明的穩(wěn)定劑沒有病毒感染的問題。此外，本發(fā)明的穩(wěn)定劑可還包含糖或多元醇。還可以包含的提高長效干擾素α綴合物儲存穩(wěn)定性之糖的優(yōu)選實例包括單糖(如甘露糖、葡萄糖、果糖和木糖)和多糖(如乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖和葡聚糖)。用于本發(fā)明的多元醇的實例包括丙二醇、低分子量的聚乙二醇、甘油和低分子量的聚丙二醇。它們可以單獨或組合使用。除了上述組分(包括緩沖劑、等張劑、糖醇、非離子型表面活性劑和甲硫氨酸)之夕卜，本發(fā)明的液體制劑還可選擇性地包含本領(lǐng)域已知的其他組分，只要它們不惡化本發(fā)明的作用。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備長效干擾素α綴合物的液體制劑的方法，其包括a)構(gòu)建長效干擾素α綴合物；和b)將步驟a)的長效干擾素α綴合物與穩(wěn)定劑混合，所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑。構(gòu)建長效干擾素α綴合物的以上步驟a)可通過使干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域經(jīng)由非肽聚合物交聯(lián)或使干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域借助重組技術(shù)融合來進行。干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域經(jīng)由非肽聚合物的交聯(lián)包括使在每個末端具有官能團的非肽聚合物與干擾素α和免疫球蛋白Fe區(qū)域反應(yīng)以產(chǎn)生綴合物，所述綴合物中所述非肽聚合物在一端與干擾素α共價連接并且在另一端與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接；以及分離所述綴合物。三種組分之間的共價鍵可先后或同時形成。例如，當(dāng)干擾素α和免疫球蛋白Fe區(qū)域分別與非肽聚合物的兩端連接時，干擾素α或免疫球蛋白Fe區(qū)域可首先與非肽聚合物結(jié)合，然后剩余部分與聚合物結(jié)合。共價鍵的先后形成對于產(chǎn)生副產(chǎn)物數(shù)目最小的目標綴合物是有利的。將步驟a)中構(gòu)建的長效干擾素α綴合物與穩(wěn)定劑混合以提供本發(fā)明的長效干擾素α綴合物的液體制劑，所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑。優(yōu)選地，穩(wěn)定劑采用氯化鈉作為等張劑，并且可還包含由甲硫氨酸、糖、多元醇及其組合組成的組分。發(fā)明實施方案 通過以下實施例可更好地理解本發(fā)明，列出以下實施例以舉例說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。[制備實施例1]制備長效干擾素α綴合物〈1-1〉使 用免疫球蛋白制備免疫球蛋白Fe區(qū)域為了得到免疫球蛋白Fe區(qū)域，在37 °C下用2mg木瓜蛋白酶(Sigma)將200mgl50kDa免疫球蛋白G (IgG, GreenCross,韓國)的IOmM磷酸鹽緩沖劑溶液處理2小時并緩慢攪拌。酶促反應(yīng)之后，使用Superdex柱、蛋白A柱和陽離子交換柱的柱色譜分離由此形成的免疫球蛋白Fe區(qū)域。詳細地，將反應(yīng)逐滴加載到用IOmM PBS(pH7.3)平衡的Superdex200柱(Pharmacia)上,然后用相同緩沖劑以lmL/min的流速洗脫。未反應(yīng)的免疫球蛋白(IgG)和F(ab’)2在免疫球蛋白Fe區(qū)域之前被洗脫，從而可被除去，原因是其二者的分子量大于免疫球蛋白Fe區(qū)域。分子量與免疫球蛋白Fe區(qū)域類似的Fab使用蛋白A柱色譜過濾掉。在本上下文中，從Superdex200柱中洗脫的免疫球蛋白Fe區(qū)域級分以5mL/min的流速加載到用20mM PBS(pH7.0)平衡的蛋白A柱(Pharmacia)上，然后用足夠量的相同緩沖劑清洗以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。使IOOmM檸檬酸鈉(pH3.0)緩沖劑流經(jīng)該柱以洗脫純的免疫球蛋白Fe區(qū)域。最終，在陽離子交換柱(polyCAT，PolyLC)上使用線性梯度(NaCl0.15M — 0.4M)的IOmM乙酸鹽緩沖劑(pH4.5)進一步純化從蛋白A柱上洗脫的該Fe級分。<1~2> 制各 IFN a -PEG 復(fù)合物將ALD-PEG-ALD(Shearwater)(在其兩端具有醛反應(yīng)基的3.4_kDa聚乙二醇)與5mg/mL人干擾素a-2b(hIFNa-2b，Mw20kDa)的IOOmM磷酸鹽緩沖劑溶液以1: 1、I: 2.5,1: 5、I: 10或1: 20的IFNa: PEG摩爾比混合。向該混合物中添加還原劑氰基硼氫化鈉(NaCNBH3, Sigma)至終濃度為20mM，并溫和攪拌使其在4°C下反應(yīng)3小時。為了得到其中PEG與IFNa氨基端選擇性連接的1:1IFNa-PEG復(fù)合物，使用SuperdexK).柱(Pharmacia)使反應(yīng)混合物經(jīng)過尺寸排阻色譜。使用IOmM磷酸鉀緩沖劑(pH0.6)作為洗脫液使IFN a -PEG復(fù)合物從柱中洗脫，同時除去未與PEG連接的IFN α，未反應(yīng)的PEG和其中PEG與兩個IFN α分子連接的二聚體副產(chǎn)物。將純化的IFN a -PEG復(fù)合物濃縮至5mg/ml ο表現(xiàn)出最有效反應(yīng)性并且產(chǎn)生最少副產(chǎn)物(例如二聚體)的IFNa: PEG的最佳反應(yīng)摩爾比鑒定為1: 2.5至1: 5。<1-3> 構(gòu)律 IFNa-PEG-Fc 綴合物使〈1-2>中制備的IFNa-PEG復(fù)合物與免疫球蛋白Fe區(qū)域的N端連接。對此，將〈1-1>中制備的免疫球蛋白Fe區(qū)域(約53kDa)溶解于IOmM磷酸鹽緩沖劑中并與IFNa-PEG復(fù)合物以1: 1、I: 2、I: 4或1: 8的IFNa-PEG復(fù)合物:Fe摩爾比混合。在將反應(yīng)溶液的磷酸鹽緩沖液濃度調(diào)節(jié)至IOOmM之后，將還原劑NaCNBH3添加至反應(yīng)溶液中至終濃度為20mM并通過溫和攪拌使其在4°C下反應(yīng)20小時。表現(xiàn)出最有效反應(yīng)性并且產(chǎn)生最少副產(chǎn)物(例如二聚體)的IFNa-PEG復(fù)合物:Fe的最佳反應(yīng)摩爾比鑒定為1: 2。

<1-4>分離并鈍化IFN a -PEG-Fc綴合物在〈1-3>的偶聯(lián)反應(yīng)之后，進行Superdex尺寸排阻色譜以從反應(yīng)混合物中除去未反應(yīng)的物質(zhì)和副產(chǎn)物，從而純化IFNa-PEG-Fc綴合物。濃縮反應(yīng)混合物并使其與IOmMPBS (pH7.3) 一起以2.5mL/min的流速經(jīng)過柱以除去未結(jié)合的Fe和未反應(yīng)物質(zhì)，從而洗脫IFNa-PEG-Fc綴合物級分。因為少量雜質(zhì)(包括未反應(yīng)的Fe和IFNa 二聚體)還共存于IFNa -PEG-Fc綴合物級分中，進一步進行陽離子交換色譜以除去它們。將IFNa -PEG-Fc綴合物級分加載到用IOmM乙酸鈉(pH4.5)平衡的PolyCAT LP柱(PolyLC)上，然后用包含IMNaCl的IOmM乙酸鈉緩沖劑(pH4.5)以線性梯度(NaClOM — 0.5M)方式洗脫。隨后，使用陰離子交換色譜以得到純的IFNa-PEG-Fc綴合物。使用PolyWAX LP柱(PolyLC)進一步純化該綴合物。將級分加載到用IOmMTris-HCl (pH7.5)平衡的柱上，并用包含IM NaCl的IOmMTris-HCl (pH7.5)以線性梯度(NaClOM — 0.3M)方式洗脫，從而產(chǎn)生高純度的IFNa-PEG-Fc綴合物。[實施例1]:測定根據(jù)不同穩(wěn)定劑的長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定性在磷酸鹽緩沖劑存在下，測定包括糖、糖醇和氨基酸在內(nèi)的不同穩(wěn)定劑穩(wěn)定長效IFNa綴合物的能力。對于該測定，使用檸檬酸鹽(檸檬酸鈉)溶液(pH5.5)作為緩沖劑，使用甘露醇作為糖醇，使用組氨酸或甲硫氨酸作為氨基酸，使用蔗糖作為糖。將表I所列組合物在40°C下儲存一周后，進行RH-HPLC和SE-HPLC分析。結(jié)果歸納在下表2中。在表2中，RP-HPLC (% )和SE-HPLC (% )柱示出長效IFNa綴合物相比于其初始值的保留率，其表示為面積％ (/初始面積％)。表I[表I]
權(quán)利要求
1.液體制劑，其包含藥用有效量的長效干擾素α綴合物和不含白蛋白的穩(wěn)定劑，其中所述綴合物中干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接在一起，并且所述穩(wěn)定劑包含緩沖齊U、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑。
2.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述干擾素α是天然IFNa、天然IFNa的衍生物或活性與天然IFNa活性相似的多肽。
3.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)域來自選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
4.權(quán)利要求3的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)域是選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的兩個或更多個結(jié)構(gòu)域的雜合體，所述結(jié)構(gòu)域具有不同來源。
5.權(quán)利要求3的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)域是由相同來源之結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單鏈免疫球蛋白的二聚體或多聚體。
6.權(quán)利要求3的液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)域是IgG4Fc區(qū)域。
7.權(quán)利要求6 的 液體制劑，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)域是無糖基化的人IgG4Fc區(qū)域。
8.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述干擾素α與所述免疫球蛋白Fe區(qū)域通過非肽聚合物共價連接。
9.權(quán)利要求8的液體制劑，其中所述非肽聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、甲殼素、透明質(zhì)酸及其組合。
10.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述糖醇選自甘露醇、山梨糖醇及其組合。
11.權(quán)利要求10的液體制劑，其中所述糖醇的濃度為基于所述液體制劑總體積的I至10% (w/v)。
12.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽緩沖溶液或磷酸鹽緩沖溶液。
13.權(quán)利要求12的液體制劑，其中所述緩沖劑的pH為4至7。
14.權(quán)利要求12的液體制劑，其中所述緩沖劑的pH為5.2至7。
15.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述等張劑是氯化鈉。
16.權(quán)利要求15的液體制劑，其中氯化鈉以5至200mM的濃度使用。
17.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述非離子型表面活性劑是聚山梨酯80。
18.權(quán)利要求17的液體制劑，其中所述非離子型表面活性劑的濃度為基于所述液體制劑總體積的 0.001 M0.05% (w/v)。
19.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述穩(wěn)定劑還包含甲硫氨酸。
20.權(quán)利要求19的液體制劑，其中甲硫氨酸的濃度為基于所述液體制劑總體積的0.005 M0.1% (w/v)。
21.權(quán)利要求1的液體制劑，其中所述穩(wěn)定劑還包含選自糖、多元醇及其組合的組分。
22.液體制劑，其包含藥用有效量的長效干擾素α綴合物和穩(wěn)定劑，其中所述綴合物中干擾素α與免疫球蛋白Fe區(qū)域通過聚乙二醇共價連接，并且所述穩(wěn)定劑包含檸檬酸鹽緩沖溶液、甘露醇、聚山梨酯80、氯化鈉和甲硫氨酸。
23.用于制備權(quán)利要求1至21中任一項的液體制劑的方法，其包括: a)構(gòu)建長效干擾素α綴合物；和 b)將步驟a)中構(gòu)建的所述長效干擾素α綴合物與不合白蛋白的穩(wěn)定劑混合，所述穩(wěn)定劑包含糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述等張劑是氯化鈉。
25.用于穩(wěn)定長效干擾素α綴合物的穩(wěn)定劑，其中所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑并且不含白蛋白，所述長效干擾素α綴合物具有與免疫球蛋白Fe區(qū)域共價連接的干擾素α。
26.用于通過穩(wěn)定劑穩(wěn)定長效干擾素α綴合物的方法，其中所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑并且不含白蛋白，并且所述長效干擾素α綴合物具有與免疫球蛋白Fe區(qū)域 共價連接的干擾素α。
全文摘要
公開的是一種液體制劑，其中具有改善的體內(nèi)持續(xù)時間和穩(wěn)定性的長效INFα綴合物可長時間穩(wěn)定儲存。所述液體制劑包含穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇、非離子型表面活性劑和等張劑。由于不含人血清白蛋白和其他對身體有害的潛在因子，所以所述液體制劑沒有病毒感染的問題，并且確保長效INFα綴合物優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性。
文檔編號A61K47/36GK103228265SQ201180056378
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者任大成, 李才敏, 李鐘守, 裴城敏, 權(quán)世昌 申請人:韓美科學(xué)株式會社