專利名稱：一種高活性長效peg－干擾素位置異構(gòu)體混合藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種高活性的PEG-干擾素(Interferon，IFN)位置異構(gòu)體混合藥物的制作方法，通過本發(fā)明制作方法制作的PEG-IFN具有相對較高的生物學(xué)活性。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon，IFN)是1957年被發(fā)現(xiàn)的。它是一類分泌性蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。干擾素在臨床上的預(yù)防和治療作用已被越來越多的生命科學(xué)工作者所認(rèn)可，干擾素的臨床適應(yīng)癥也不斷的被開發(fā)。其作用主要包括抗病毒、抗腫瘤、以及自身免疫調(diào)節(jié)等作用。在抗病毒作用中，其可以用于治療病毒性感染，對乙肝、丙肝、病毒性角膜炎、慢性宮頸炎、新生兒病毒性腦炎以及病毒性感冒均有一定療效。在抗腫瘤作用中，干擾素對多種腫瘤近期有良好療效，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、食道癌、艾滋病等。但由于干擾素在人體內(nèi)的半衰期短，為了達(dá)到和維持一定具有一定的血藥濃度，起到治療的效果需要頻繁的注射，給患者帶來了很大的不方便和痛苦。另外，具有免疫原性的外源蛋白頻繁使用而引起機體產(chǎn)生抗體極大地限制了其療效和臨床的應(yīng)用。
藥物的聚乙二醇修飾即PEG化，是將活化的聚乙二醇(PEG)通過化學(xué)方法偶聯(lián)到蛋白、多肽、小分子有機藥物和脂質(zhì)體上。Davis等人在美國專利(US No.4,179,337)中公開了將PEG結(jié)合到蛋白質(zhì)上，得到具有生物學(xué)活性但蛋白的免疫原性相對較低的結(jié)合物。Nakagawa等人公開了PEG結(jié)合到小島活化蛋白質(zhì)上以減少起副作用和免疫原性。邁克爾A克拉克等公開了PEG結(jié)合到精氨酸脫亞氨酶(CN 1169951c)，極大的降低了其免疫原性，提高了腫瘤的治療效果。
藥物經(jīng)PEG修飾后，往往會具有更長的半衰期和較少的免疫原性及抗原性等優(yōu)點，可參見Nitecki等人的美國專利(US No.4902502)、Enzon公司的國際專利(PCT/U890/02133)、Nishimura等人的歐洲專利申請?，F(xiàn)在臨床上應(yīng)用的PEG化藥物也證實了這一作用，PEG化可增加藥物溶解度、增加藥物的酶水解穩(wěn)定性、大大的提高了藥物的半衰期和降低了其免疫原性，從而降低不良反應(yīng)，改變藥物的分布，降低腎臟清除率，從而延長藥物體內(nèi)半衰期，減少服藥頻率，最終提高藥物的治療指數(shù)和臨床安全性。
但藥物經(jīng)PEG化后，往往會降低其生物學(xué)活性，從而在臨床使用上為了達(dá)到同等的療效就需要更大的劑量。根據(jù)Stefan foser等研究報道(Protein Expression and Purification30(2003)78-87)，干擾素alpha2a經(jīng)分子量為40kd的PEG修飾后，體外生物學(xué)活性為原來的7％。修飾后的產(chǎn)物為同分異構(gòu)體的混合物，PEG分子通過干擾素上不同的氨基酸殘基與之偶聯(lián)。通過研究各個同分異構(gòu)體的生物學(xué)活性發(fā)現(xiàn)，PEG通過某個特定氨基酸殘基偶聯(lián)的PEG干擾素具有比較高的生物學(xué)活性，如果提高了具有較高生物學(xué)活性的異構(gòu)體在混合物中的比例，則會相應(yīng)的提高混合物總體的生物學(xué)活性，從而可以減少臨床上的使用劑量，降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種能獲得高的修飾率，在一定蛋白質(zhì)和PEG的濃度下能獲得較高的均一反應(yīng)產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種就是經(jīng)修飾的產(chǎn)物能保持較高的生物學(xué)活性。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種高活性長效PEG-干擾素位置異構(gòu)體混合藥物的制備方法，該方法至少包括有下述步驟(a)干擾素首先通過疏水性、電荷、親合力等作用力與樹脂相結(jié)合；(b)與溶液中的NHS-PEG反應(yīng)，NHS-PEG的摩爾數(shù)一般要比IFN摩爾數(shù)多3-10倍；(c)反應(yīng)混合物稀釋5倍體積并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH到4.5，用陽離子樹脂分離PEG-IFN結(jié)合物；以及，(d)以pH為4.5的醋酸鈉中加有NaCl洗脫被修飾的IFN。


圖1為以本發(fā)明實施例三分離PEG-IFN的純化圖譜。
圖2為以本發(fā)明實施例四檢測PEG-IFN位置異構(gòu)體的圖譜。以及，圖3為以本發(fā)明實施例四wish-vsv方法檢測本發(fā)明的體外生物學(xué)活性的結(jié)果圖。
具體實施例方式
本發(fā)明揭露有一種高活性長效PEG-干擾素(Interferon，IFN)位置異構(gòu)體混合藥物的制備方法，該方法包括至少如下步驟(a)干擾素首先通過疏水性、電荷、親合力等作用力與樹脂相結(jié)合；(b)與溶液中的NHS-PEG反應(yīng)，NHS-PEG的摩爾數(shù)一般要比IFN摩爾數(shù)多3-10倍；(c)反應(yīng)混合物稀釋5倍體積并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH到4.5，用陽離子交換樹脂分離PEG-IFN結(jié)合物；以及，(d)以pH為4.5的醋酸鈉中加有NaCl洗脫被修飾的IFN。
在步驟(a)中，反應(yīng)一般在堿性的條件下進(jìn)行以獲得更高的修飾率，通常為8-11。
在步驟(c)中，具體方法為樹脂先用20mMpH為4.5的醋酸鈉平衡到流出液的pH為4.5，然后上稀釋后的反應(yīng)混合液，再用20mM pH為4.5的醋酸鈉平衡到紫外吸收回到基線，以20mMpH為4.5的醋酸鈉中加有150mM NaCl洗脫，收集洗脫峰，此收集峰為PEG-IFN結(jié)合物。
PEG與IFN修飾反應(yīng)是一個親核反應(yīng)，影響修飾產(chǎn)物的組成主要有兩個因素，第一個影響因素為在反應(yīng)條件下的氨基酸殘基的電離程度，第二個影響因素為PEG和IFN的空間位阻效應(yīng)。
影響氨基酸殘基的電離程度主要為反應(yīng)體系中的pH，眾所周知氨基酸在不同的pH環(huán)境中不同的基團(tuán)帶有不同的電荷，如在酸性的環(huán)境中氨基帶有正電荷，在堿性的環(huán)境中羧基帶有負(fù)電荷，由于基團(tuán)不同的電離和帶電性質(zhì)從而表現(xiàn)出與活化的PEG反應(yīng)有不同的反應(yīng)活性。在理論上，IFN中的165個氨基酸中能與PEG反應(yīng)的基團(tuán)有10個賴氨酸殘基中的ε-氨基、N-末端半胱氨酸中的α-氨基、3個組氨酸中咪唑環(huán)中的N原子、14個絲氨酸中的羥基、5個酪氨酸中的羥基和10個蘇氨酸中的羥基。在實際反應(yīng)中由于本身基團(tuán)的親核性不同、蛋白的結(jié)構(gòu)、微環(huán)境中的電荷及基團(tuán)的pKa等因素的影響，只有少數(shù)幾個位點參與了反應(yīng)。在與NHS-PEG的反應(yīng)中，在一定的pH環(huán)境中只有賴氨酸殘基中的ε-氨基被修飾。
基于以上的了解，在pH為8.0-11.0中只有賴氨酸殘基中的ε-氨基被修飾，特別在pH為8.5-10.0時能極大的提高反應(yīng)的專一性，更特別的是在pH為9.0時，50％以上的修飾位點為lys(31)、lys(131)、lys(134)，修飾混合物的生物學(xué)活性有了很大的提高。
蛋白質(zhì)本身有特定的空間結(jié)構(gòu)，在與PEG的修飾反應(yīng)中有些位點可能由于空間結(jié)構(gòu)未能被修飾上，如在IFN中有10個賴氨酸殘基中的ε-氨基在理論上都能被修飾，但在大多數(shù)的反應(yīng)中Lys132始終沒被修飾。
在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)lys(31)、lys(134)位點修飾的IFN具有比經(jīng)其它位點修飾的IFN更高的生物學(xué)活性。在IFN的空間結(jié)構(gòu)中，lys(31)和lys(134)的位置相對靠近，此區(qū)域遠(yuǎn)離活性中心，偶聯(lián)上的PEG不會阻礙到IFN與其受體的結(jié)合，從而表現(xiàn)出高的生物學(xué)活性。在本發(fā)明中引入了一種大分子物質(zhì)，可與干擾素活性中心可逆性結(jié)合，封閉活性中心周圍氨基酸殘基與PEG偶聯(lián)反應(yīng)的可能性，從而提高了修飾反應(yīng)專一性，提高了修飾后干擾素的生物學(xué)活性。
本發(fā)明中使用一種帶有苯環(huán)的疏水性樹脂，在與PEG偶聯(lián)反應(yīng)之前，在高鹽的環(huán)境中干擾素分子疏水部位首先與樹脂相結(jié)合。干擾素分子與樹脂結(jié)合后由于樹脂空間效應(yīng)的影響，使得部分氨基酸殘基不能參與PEG的偶聯(lián)反應(yīng)，減少了混合物中的種類，并且提高了反應(yīng)后混合物總體的生物學(xué)活性。在研究中發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系中加入疏水性樹脂或在裝有樹脂的層析柱中反應(yīng)都能極大的提高修飾后的干擾素活性。經(jīng)對修飾后產(chǎn)物的分析表明，經(jīng)lys(31)、lys(134)位點修飾的IFN占總修飾干擾素的80％以上。
以下結(jié)合幾個具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明中的方法。
實施例一100mg的IFN蛋白溶液用Sephadex-25把緩沖體系換成50mM pH9.0的NaOH-H3BO3、2M NaCl緩沖液，然后用超濾濃縮的方法濃縮到蛋白濃度為3mg/ml，加入PhenylSepharose Fast Flow(Amersharm Biotech)10ml室溫攪拌30分鐘。再加入NHS-PEG固體600mg，攪拌均勻，在常溫下攪拌反應(yīng)2小時，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH到4.0終止反應(yīng)。然后5000rpm離心10分鐘，收集沉淀，棄去上清夜。取沉淀，加入50ml 50mM pH9.0的NaOH-H3BO3緩沖液，室溫攪拌10分鐘，再次離心，收集上清液。
實施例二100mg的IFN蛋白溶液同實施例一換體系后，直接上疏水樹脂(PhenylSepharose Fast Flow)，柱高10cm，直徑26mm，流速5ml/min，待上樣完畢后用50M pH9.0的NaOH-H3BO3、2M NaCl溶液沖洗200ml，再用50M pH9.0的NaOH-H3BO3、2M NaCl、2％的PEG緩沖液循環(huán)2小時。然后用50M pH9.0的NaOH-H3BO3、2M NaCl的緩沖液洗去未反應(yīng)的PEG，用50M pH9.0的NaOH-H3BO3緩沖液洗脫被修飾IFN和未修飾的IFN。用紫外280nm檢測，收集洗脫液共32ml。
實施例三取實施例一的上清液或?qū)嵤├南疵撘海谜麴s水稀釋到150ml，用1M的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH到4.5。稀釋液直接上已用20mM pH4.5醋酸鈉溶液平衡好的陽離子交換樹脂(CM FastFlow，Aermsham Biotech)，柱高10cm，直徑26mm，流速5ml/min。上樣完畢后用200ml 20mM pH4.5醋酸鈉溶液沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，然后用含有150mM NaCl的20mM pH4.5的醋酸鈉溶液洗脫PEG-IFN結(jié)合物，用紫外280nm檢測，分別收集洗脫峰23ml和31ml。然后在用含有500mM NaCl的20mM pH4.5的醋酸鈉溶液洗脫未被修飾的IFN。
實施例四用分析柱(Tosoh-Biosep，sp-5PW，填料顆粒10um，柱內(nèi)徑7.5mm，柱長7.5cm)檢測PEG-INF的位置異構(gòu)體。用含3.4mM醋酸鈉、10％乙醇的pH4.4的緩沖液平衡柱子，上樣后用含3.4mM醋酸鈉、10％乙醇的pH4.4的緩沖液沖洗柱子。再用含10mM磷酸鉀、10％乙醇的pH6.6的緩沖液梯度洗脫。流速1ml/min，用紫外215檢測，收集洗脫峰并軟件積分計算各峰面積的百分比。
實施例五實施例三中所得的PEG-IFN和實施例四中所得的PEG-IFN位置異構(gòu)體的體外生物學(xué)活性用細(xì)胞病變抑制法檢測(方法見中國藥典三部，2005版)。人羊膜細(xì)胞(Wish細(xì)胞)培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPM1640培養(yǎng)基中，每周傳代2-3次，使用前EDTA消化并用培養(yǎng)基稀釋到1.0-2.0×105各細(xì)胞/ml，接種于96孔板中，每孔100ul，37℃，5％CO2培養(yǎng)4-6小時使細(xì)胞貼壁。測活樣品作4倍梯度稀釋，加入到96孔中，每孔100ul，37℃，5％CO2培養(yǎng)18-24小時，棄去上清。再加入含3％小牛血清的RPM1640培養(yǎng)基稀釋至100TCID50的水泡口炎病毒(VSV病毒)，每孔100ul，37℃，5％CO2培養(yǎng)18-24小時，棄去上清。每孔加入50ul染色液(50mg結(jié)晶紫溶于100ml的20％乙醇溶液)，溫室放置30分鐘，流水洗去未結(jié)合的染色液，吸干殘留水分，每孔加入100ul的脫色液(0.1％的乙酸50％乙醇溶液)，溫室放置10分鐘，搖勻后再570nm檢測吸光度值。
如本技術(shù)領(lǐng)域的人所知，本發(fā)明的附圖和實施例僅為說明本發(fā)明的功能、結(jié)構(gòu)和原理而不應(yīng)當(dāng)成為對本發(fā)明理解上的限制；同時，本發(fā)明的目的均已經(jīng)實現(xiàn)。上述實施例可能在不脫離本發(fā)明原理的情況下有所變更，故此，本發(fā)明的保護(hù)應(yīng)以權(quán)利要求書中所描述的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種高活性長效PEG-干擾素(IFN)位置異構(gòu)體混合藥物的制備方法，其特征是所述方法至少包括如下步驟(a)所述干擾素首先通過疏水性、電荷、親合力等作用力與樹脂相結(jié)合；(b)與溶液中的NHS-PEG反應(yīng)，NHS-PEG的摩爾數(shù)一般要比IFN摩爾數(shù)多3-10倍；(c)反應(yīng)混合物稀釋5倍體積并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH到4.5，用弱大分子結(jié)合物分離PEG-IFN結(jié)合物；以及，(d)以pH為4.5的醋酸鈉中加有NaCl洗脫被修飾的IFN。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是因為反應(yīng)一般在堿性的條件下進(jìn)行以獲得更高的修飾率，所以pH值通常定為8-11。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在步驟(c)中，具體方法為樹脂先用20mM pH為4.5的醋酸鈉平衡到流出液的pH為4.5，然后上稀釋后的反應(yīng)混合液，再用20mM pH為4.5的醋酸鈉平衡到紫外吸收回到基線，以20mM pH為4.5的醋酸鈉中加有150mM NaCl洗脫，收集洗脫峰，此收集峰為PEG-IFN結(jié)合物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述干擾素是重組人干擾素，包括干擾素alpha、干擾素beta及其突變體。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述PEG是活化基團(tuán)為N-羥基琥珀酰亞胺的PEG，其分子量為20000-40000道爾頓。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是IFN先與樹脂結(jié)合，再與NHS-PEG反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述IFN與樹脂結(jié)合在溶液狀態(tài)下或者在樹脂固定的情況下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述樹脂分別是離子交換樹脂、疏水樹脂和親和樹脂。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是制備的PEG-IFN，經(jīng)lys(31)、lys(134)位點修飾的IFN占總修飾干擾素的80％以上。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種高活性的PEG－干擾素(Interferon，IFN)位置異構(gòu)體混合藥物的制作方法，通過本發(fā)明制作方法制作的PEG－IFN具有相對較高的生物學(xué)活性。該方法包括至少以下步驟(a)干擾素首先通過疏水性、電荷、親合力等作用力與樹脂相結(jié)合；(b)與溶液中的NHS－PEG反應(yīng)，NHS－PEG的摩爾數(shù)一般要比IFN摩爾數(shù)多3－10倍；(c)反應(yīng)混合物稀釋5倍體積并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH到4.5，用陽離子交換樹脂分離PEG－IFN結(jié)合物；以及，(d)以pH為4.5的醋酸鈉中加有NaCl洗脫被修飾的IFN。
文檔編號A61K35/00GK1919336SQ20051002901
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月23日
發(fā)明者王英明, 朱化星, 蔡麗君, 毛佳 申請人:上海欣百諾生物科技有限公司