本發(fā)明屬于中藥有效成分的高效制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從山楂葉中制備高純度牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷的方法。

技術(shù)背景

山楂葉(crataegifolium)為薔薇科(rosaceae)植物山里紅(crataeguspinnatifidabge.var.majorn.e.br.)或山楂(crataeguspinnatifidabge.)的干燥葉，具有活血化瘀，理氣通脈，化濁降脂等多種功效，在我國(guó)山東、陜西、山西等地均廣泛分布。山楂葉作為山楂果實(shí)的副產(chǎn)物，資源豐富、產(chǎn)量高，具有廣泛的開(kāi)發(fā)價(jià)值?，F(xiàn)代藥理研究表明山楂葉具有降血脂、抗心肌缺血缺氧、防治糖尿病、抗炎和鎮(zhèn)痛等多種藥理活性。并且已廣泛的應(yīng)用于山玫膠囊、益心酮片等多味中藥中。牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷為黃酮類(lèi)化合物，為《中國(guó)藥典》中規(guī)定山楂葉、山楂葉提取物及相關(guān)制劑中檢測(cè)指標(biāo)。該三種成分在山楂葉中含量較低，聚酰胺色譜、硅膠柱色譜和sephadexlh-20等傳統(tǒng)制備方法，具有分離時(shí)間長(zhǎng)、重現(xiàn)性差、死吸附嚴(yán)重、溶劑消耗量大等缺點(diǎn)。雖然制備液相色譜具有分離效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)組分較雜的樣品，該方法仍具有分離效率較低，樣品前處理嚴(yán)格的弊端。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于難以從山楂葉中高效、低成本分離制備高純度牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷的問(wèn)題，尚缺乏有效的解決方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種山楂葉中黃酮類(lèi)單體的高效制備方法，包括如下步驟：

1)將山楂葉粉碎、提取、富集、蒸干，制得粗樣品；

2)應(yīng)用高速逆流色譜法將牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷從粗樣品中分離純化出來(lái)，得到牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷的混合物；

3)利用制備液相色譜對(duì)牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷的混合物進(jìn)行純化，制備得到高純度牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷三種單體。

本發(fā)明中將高校逆流色譜法作為富集手段，較常規(guī)逆流色譜一次分離得到多個(gè)化合物單體的模式，增大了樣品上樣量，極大提高了富集效率。同時(shí)，結(jié)合制備液相色譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了低含量黃酮類(lèi)化合物的快速制備。高校逆流色譜法和制備色譜技術(shù)聯(lián)用從山楂葉中制備得到純度大于98％牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷單體的方法具有制備成本低、操作簡(jiǎn)便、效率高單體純度大等優(yōu)勢(shì)。

進(jìn)一步的，步驟1)中，所述提取是將一定質(zhì)量的山楂葉粉末用6-9倍量的50-95％乙醇加熱回流提取，得提取液。

采用50-95％乙醇(此處的％為體積分?jǐn)?shù))可以對(duì)山楂葉粉中的牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷具有良好的提取效果，有利于這三種單體的制備。

更進(jìn)一步的，對(duì)山楂葉粉末提取的次數(shù)為2-4次，每次提取1.5-2.5h。

更進(jìn)一步的，將所述提取液減壓回收乙醇，至無(wú)醇味，加入一定量熱水，過(guò)濾后，得到上柱溶液，將上述溶液用大孔樹(shù)脂柱富集，洗脫、濃縮，制得粗樣品。

大孔樹(shù)脂柱有利于牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷三種單體的富集，避免了這三種單體的損失。

進(jìn)一步的，步驟2)中，高速逆流色譜法的溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：水：正丁醇＝4：2.5-3.5：1.5-2.5：1-2(v/v)。

更進(jìn)一步的，高速逆流色譜法的溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：水：正丁醇＝4：3：2：1.5(v/v)。

進(jìn)一步的，高效逆流色譜儀的分離參數(shù)為：柱體積200-400ml，上樣量600-1220mg，轉(zhuǎn)速600-1000rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流動(dòng)相的流速1-10ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

更進(jìn)一步的，柱體積300ml，上樣量800mg，轉(zhuǎn)速850rpm，流動(dòng)相的流速5.0-10.0ml/min。

進(jìn)一步的，步驟3)中，制備液相色譜的制備參數(shù)為：watersxbridgebehc18柱(100mm×4.6mmi.d.,2.5μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫：25℃，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量：10μl，洗脫溶劑為乙腈和水，梯度條件為：0-3min，13％-14％乙腈；3-15min，14％-17％乙腈；15-15.1min，17％-13％乙腈；15.1-20min，13％乙腈。

一種具有降血脂、抗心肌缺血缺氧、防治糖尿病、抗炎、抗鎮(zhèn)痛藥理活性的藥物的制備方法，包括利用上述方法從山楂葉中制備高純度牡荊素、金絲桃苷和2”-o-牡荊素鼠李糖苷的步驟。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的制備方法利用大孔樹(shù)脂柱富集山楂葉中總黃酮，經(jīng)高速逆流色譜富集含有牡荊素、金絲桃苷、2”-o-牡荊素鼠李糖苷的組分，最后經(jīng)制備液相色譜分離得到上述三個(gè)化合物，成本低于現(xiàn)有技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，效率高，可以較大批量分離制備出純度大于98％的山楂葉黃酮單體化合物。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1為實(shí)施例1的工藝流程圖；

圖2為實(shí)施例1山楂葉總黃酮粗提液的高效液相色譜圖；

圖3為實(shí)施例1山楂葉總黃酮粗提液分離的高速逆流色譜圖；

圖4為實(shí)施例1中牡荊素、金絲桃苷、2”-o-牡荊素鼠李糖苷組分的高效液相色譜圖；

圖5為實(shí)施例1中牡荊素、金絲桃苷、2”-o-牡荊素鼠李糖苷組分的液相制備圖；

圖6為實(shí)施例1中牡荊素單體的高效液相色譜圖；

圖7為實(shí)施例1中金絲桃苷單體的高效液相色譜圖；

圖8為實(shí)施例1中2”-o-牡荊素鼠李糖苷單體的高效液相色譜圖；

圖9為對(duì)比例1中的高速逆流色譜圖；

圖10為對(duì)比例2中的高速逆流色譜圖。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

實(shí)施例1

如圖1一種山楂葉中黃酮類(lèi)單體的高效制備方法流程圖如圖1所示。

1.山楂葉總黃酮的提取

山楂葉總黃酮的提取：將山楂葉粉碎，加8倍量70％乙醇(70％是體積分?jǐn)?shù))加熱回流提取2次，每次提取2h。兩次提取液合并，減壓回收乙醇，至無(wú)醇味，加入適量熱水，抽濾或離心，即得上柱溶液。將上柱溶液進(jìn)行大孔樹(shù)脂柱富集，先用純水洗脫，再用70％乙醇洗脫，70％乙醇洗脫物合并收集，減壓濃縮至浸膏，得山楂葉總黃酮粗提液，圖2為山楂葉總黃酮粗提液的高效液相色譜圖，可見(jiàn)，高效液相色譜無(wú)法將粗體液中的三種單體分離，這是因?yàn)榇痔嵋褐泻写罅康母吆扛蓴_物質(zhì)。

2.應(yīng)用高速逆流色譜分離純化山楂葉總黃酮單體

溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水-正丁醇(4:3:2:1.5，v/v)，高速逆流色譜儀柱體積為300ml，上樣量800mg，轉(zhuǎn)速850rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速5.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開(kāi)，取800mg富含山楂葉總黃酮樣品，溶解于10ml加上相和10ml下相中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300ml)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開(kāi)啟速度控制器，使高速逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)850rpm時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動(dòng)相流速為5.0ml/min，開(kāi)始泵流動(dòng)相，然后根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖(如圖3所示)接收目標(biāo)成分，得含有牡荊素、金絲桃苷、2”-o-牡荊素鼠李糖苷三個(gè)峰的混合物98.6mg。

將得到的混合物用高效液相色譜儀進(jìn)行分離，如圖4所示，可以將混合物中的三種單體完全分離，而且混合物中沒(méi)有其他雜質(zhì)的干擾。

3.制備液相色譜分離純化

采用制備液相色譜對(duì)上述混合物進(jìn)行二次制備，流動(dòng)相為乙腈-水(19:81，v/v)，流速5.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm時(shí)，三種化合物可以實(shí)現(xiàn)基線分離，如圖5所示，如圖6、圖7和圖8所示，制備的三種單體中沒(méi)有其他干燥物質(zhì)的存在，制備的三種化合物的純度均高于98％。

利用高效液相色譜分析分離物，液相條件：watersxbridgebehc18柱(100mm×4.6mmi.d.,2.5μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫：25℃，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量：10μl，洗脫溶劑為乙腈和水，梯度條件為：0-3min，13％-14％乙腈；3-15min，14％-17％乙腈；15-15.1min，17％-13％乙腈；15.1-20min，13％乙腈。

結(jié)構(gòu)鑒定：對(duì)分離得到的黃酮應(yīng)用agilent5973n質(zhì)譜儀和brukerav-400mhz核磁共振波譜儀分別進(jìn)行ms，nmr譜的測(cè)定，所得數(shù)據(jù)如下：

牡荊素：esi-ms,m/z433.3[m+h]⁺,431.1[m-h]^-.¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:13.16(1h,s,5-oh),6.90(2h,d,j＝6.4hz,h-3',5'),6.77(1h,s,h-3),6.26(1h,s,h-6),4.69(1h,d,j＝9.9hz,h-1”).¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:181.7(c-4),163.7(c-2),162.7(c-7),161.0(c-5),160.3(c-4'),156.5(c-9),129.6(c-2'),128.8(c-6'),121.5(c-1'),115.7(c-3'),115.7(c-5'),104.7(c-8),104.1(c-10),102.4(c-3),98.2(c-6),81.7(c-5”),78.5(c-3”),73.3(c-1”),70.8(c-2”),70.4(c-4”),61.1(c-6”)。

金絲桃苷：esi-ms,m/z465.2[m+h]^-,463.1[m-h]^-.¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:12.64(1h,s,5-oh),10.84(1h,s,7-oh),7.67(1h,dd,j＝2.0,8.4hz,h-6'),7.54(1h,d,j＝2.0hz,h-2'),6.82(1h,d,j＝8.4hz,h-6'),6.41(1h,d,j＝1.6hz,h-8),6.20(1h,d,j＝1.6hz,h-6),5.38(1h,d,j＝8.0hz,h-1”).¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:177.3(c-4),164.5(c-7),161.1(c-5),156.2(c-9),156.1(c-2),148.4(c-4'),144.7(c-3'),133.4(c-3),121.9(c-6'),121.0(c-1'),115.8(c-5'),115.1(c-2'),103.7(c-10),101.8(c-1”),98.7(c-6),93.5(c-8),75.7(c-5”),73.1(c-3”),71.1(c-2”),67.8(c-4”),60.0(c-6”)。

2”-o-牡荊素鼠李糖苷：esi-ms,m/z579.2[m+h]^-,577.2[m-h]^-.¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:13.15(1h,s,5-oh),8.05(2h,d,j＝8.8hz,h-2',6'),6.91(2h,d,j＝8.8hz,h-3',5'),6.79(1h,s,h-3),6.28(1h,s,h-6),4.98(1h,s,h-1”'),4.77(1h,d,j＝10.0hz,h-1”),0.48(3h,d,j＝6.0hz,h-6”').¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:182.5(c-4),164.4(c-2),162.7(c-7),161.5(c-5),161.1(c-4'),156.3(c-9),129.4(c-6'),129.1(c-2'),122.1(c-1'),116.5(c-5'),116.3(c-3'),104.9(c-10),104.7(c-8),103.0(c-3),100.8(c-l”'),98.7(c-6),82.2(c-5”),80.2(c-3”),75.5(c-2”),72.1(c-1”),71.8(c-4”'),71.0(c-2”'),70.8(c-3”'),70.6(c-4”),68.7(c-5”'),61.5(c-6”),18.2(c-6”')。

實(shí)施例2

山楂葉總黃酮的提?。簩⑸介~粉碎，加9倍量60％(60％是體積分?jǐn)?shù))乙醇加熱回流提取2次，每次2h。兩次提取液合并，減壓回收乙醇，至無(wú)醇味，加入適量熱水，抽濾或離心，即得上柱溶液。將上述溶液進(jìn)行大孔樹(shù)脂柱富集，先用10％乙醇洗脫，再用70％乙醇洗脫，70％乙醇洗脫物合并收集，減壓濃縮至浸膏，得山楂葉總黃酮。

2.應(yīng)用高速逆流色譜分離純化山楂葉總黃酮單體

溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水-正丁醇(4:3:2:1.4，v/v)，高速逆流色譜儀柱體積為300ml，上樣量760mg，轉(zhuǎn)速850rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速6.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開(kāi)，取760mg富含山楂葉總黃酮樣品，溶解于15ml加上相和15ml下相中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300ml)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開(kāi)啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)850rpm時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動(dòng)相流速為6.0ml/min，開(kāi)始泵流動(dòng)相，然后根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖接收目標(biāo)成分，得牡荊素、金絲桃苷、2”-o-牡荊素鼠李糖苷得含有牡荊素、金絲桃苷、2”-o-牡荊素鼠李糖苷三個(gè)峰的混合物95.2mg。

3.制備液相色譜分離純化

采用制備液相色譜對(duì)上述混合物進(jìn)行二次制備，流動(dòng)相為乙腈-水(20:80，v/v)，流速5.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm時(shí)，三種化合物可以實(shí)現(xiàn)基線分離，最終制備得到三種化合物的純度均高于98％。

對(duì)比例1

條件：氯仿-甲醇-水(4:3:2，v/v)，流速：5mlmin^-1，進(jìn)樣量：800mg，固定相保留：66％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實(shí)施例1中的一樣。分離結(jié)果：出峰時(shí)間太慢，化合物未能洗脫出來(lái)，如附圖9。

對(duì)比例2

條件：正丁醇-乙酸-水(4:1:5，v/v)，流速：2mlmin^-1，進(jìn)樣量：800mg，固定相保留：12％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實(shí)施例1中的一樣。分離結(jié)果：保留值過(guò)低，樣品同時(shí)被洗脫出，仍未得到有效分離，如附圖10。

由圖9和圖10可以看出，對(duì)比例1與實(shí)施例1是在溶劑系統(tǒng)中將正丁醇去掉，并且溶劑系統(tǒng)的前三種比例不變，就導(dǎo)致出峰時(shí)間太慢，化合物未得到分離，對(duì)比例2使用其他的溶劑系統(tǒng)同樣導(dǎo)致了化合物沒(méi)有得到有效分離。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。