本發(fā)明涉及中藥有效成分的高效制備方法，具體為一種爵床中木脂素類(lèi)單體的制備方法。

技術(shù)背景

爵床是爵床科(acanthaceae)植物爵床justiciaprocumbensl.的干燥全草，又名野萬(wàn)年青、六角英、節(jié)節(jié)寒等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，曾收載于《中國(guó)藥典》(1977年版，一部)，為一年生匍匐草本。爵床有清熱解毒，利尿消腫之功效，臨床用于治療咳嗽、感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、瘧疾、痢疾、腸炎、乳糜尿、肝硬化腹水、腎盂腎炎和小兒疳積等癥，外用還可治療癰瘡癤腫、跌打損傷，常生于礦野草地及路旁陰濕處，主要分布于我國(guó)西南、南部各省區(qū)及臺(tái)灣地區(qū)，資源較為豐富。爵床全草的化學(xué)成分主要為木脂素類(lèi)，現(xiàn)代藥理研究表明，爵床木脂素類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗血小板凝集等作用，尤其是在抗腫瘤方面效果顯著。

傳統(tǒng)的爵床中木脂素類(lèi)化合物的分離方法為反相色譜、硅膠柱色譜和sephadexlh-20等制備方法，其局限性是費(fèi)時(shí)費(fèi)力、污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復(fù)柱層析對(duì)樣品有不可逆的吸附作用，分離得到木脂素類(lèi)化合物單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為制備量大的分離技術(shù)。

高速逆流色譜(high-speedcounter-currentchromatography，hsccc)是近30年發(fā)展起來(lái)的一種連續(xù)的無(wú)需任何固體支持物的高效、快速的液-液分配色譜分離技術(shù)，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來(lái)的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問(wèn)題，使用其它液相色譜法進(jìn)行制備型分離時(shí)，其分配效率會(huì)顯著降低，溶劑消耗量大，hsccc保證較高峰型分辨度，分離量大、樣品無(wú)損失、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。高速逆流色譜能直接進(jìn)大量粗提樣品或合成混合物，分離結(jié)果能達(dá)到相當(dāng)高的純度，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。但是溶劑系統(tǒng)的選擇對(duì)于hsccc分離效果十分關(guān)鍵，而到目前為止，溶劑系統(tǒng)的選擇還沒(méi)有充分的理論依據(jù)，而是根據(jù)操作人員積累的豐富經(jīng)驗(yàn)來(lái)選擇，如根據(jù)實(shí)際情況，總結(jié)分析并參照相關(guān)的專(zhuān)著及文獻(xiàn)，從所需分離的物質(zhì)的類(lèi)別出發(fā)尋找相似的分離實(shí)例，選擇極性適合的溶劑系統(tǒng)。如果遇到待分離純化的物質(zhì)種類(lèi)較多時(shí)，而且沒(méi)有與待分離的物質(zhì)的極性相似的分離實(shí)例時(shí)，則難以確定溶劑系統(tǒng)，更無(wú)法對(duì)溶劑系統(tǒng)中的各種溶劑的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)，難以實(shí)現(xiàn)待分離物質(zhì)的分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種爵床中木脂素類(lèi)單體的制備方法，包括如下步驟：

1)將干燥爵床全草粉碎、提取、蒸干，制得粗樣品；

2)使用兩步hsccc分離方法從粗樣品中分離出爵床脂素b、爵床脂素a、6′-羥基爵床脂素、爵床脂素e、lignanj1、爵床苷e、diphyllin-1-o-β-d-apiofuranoside、山荷葉素、6′-羥基爵床脂素b和diphyllinacetylapioside。

進(jìn)一步的，步驟2)中，第一步hsccc分離，兩相溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.5-1：1：0.5-1(v/v)。

進(jìn)一步的，步驟2)中，第一步hsccc分離，高速逆流色譜法的溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.7：1：0.7(v/v)。

進(jìn)一步的，高效逆流色譜儀的分離參數(shù)為：柱體積200-400ml，上樣量100-1000mg，轉(zhuǎn)速600-1000rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流動(dòng)相的流速1-10ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

進(jìn)一步的，步驟2)中，第二步hsccc分離，兩相溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水＝3：2-5：3：2-5，v/v；

進(jìn)一步的，步驟2)中，第一步hsccc分離，高速逆流色譜法的溶劑系統(tǒng)為石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水＝3：3.8：3：3.8(v/v)；

進(jìn)一步的，高效逆流色譜儀的分離參數(shù)為：柱體積200-400ml，上樣量100-1000mg，轉(zhuǎn)速600-1000rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流動(dòng)相的流速1-10ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

第一步hsccc分離過(guò)程中，可以成功分離爵床脂素b、爵床脂素a、6′-羥基爵床脂素、爵床脂素e和lignanj1，第二步hsccc分離過(guò)程中，可以成功分離爵床苷e、diphyllin-1-o-β-d-apiofuranoside、山荷葉素、6′-羥基爵床脂素b和diphyllinacetylapioside。且可以使分離得到的各種物質(zhì)的純度達(dá)到95％以上，實(shí)現(xiàn)了爵床中這10種物質(zhì)的分離純化。

進(jìn)一步的，步驟1)中，粗樣品的制備方法，包括如下步驟：將干燥的爵床全草粉碎成粉末，用95％乙醇回流提取，將提取液合并過(guò)濾后，濃縮至無(wú)醇味，然后用等量乙酸乙酯萃取濃縮物，得萃取溶液，將萃取溶液蒸發(fā)至干，得粗樣品。

更進(jìn)一步的，每千克干燥爵床全草用1-1.5l95％乙醇進(jìn)行回流提取。

更進(jìn)一步的，用95％乙醇回流提取的次數(shù)為2-3次，每次提取1.5-2.5h。

更進(jìn)一步的，將萃取溶液在55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，制得粗樣品。

進(jìn)一步的，高效逆流色譜儀的分離參數(shù)為：柱體積300ml，上樣量320mg，轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

進(jìn)一步的，溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流動(dòng)相的流速為2.0ml/min。

進(jìn)一步的，步驟2)中，將粗樣品溶于特定體積的上相和下相的混合物中，粗樣品、上相和下相的用量比為：64：1：1，g：l：l。

進(jìn)一步的，利用高效液相色譜方法分析分離物，液相條件為：waters-rpc18柱(4.6×250mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)256nm，柱溫：25℃，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量：20μl，流動(dòng)相采用乙腈(a)和0.1％三氟乙酸水溶液(b)梯度洗脫，梯度條件如下：0min，30％a；0–10min，30–45％a；10–25min，45-60％a；25-40min，60-100％a。

更進(jìn)一步的，上述方法還包括采用質(zhì)譜儀和核磁共振波譜儀對(duì)分離得到的木脂素單體進(jìn)行測(cè)定的步驟。

本發(fā)明的有益效果為：

采用本發(fā)明的方法，可以較大批量從爵床中分離制備出10種純度大于95％的木脂素類(lèi)單體。該方法的分離成本較低，操作簡(jiǎn)便，效率高。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；

圖2為爵床粗品分離的高速逆流色譜圖；

圖3為爵床樣品2分離的高速逆流色譜圖；

圖4為爵床粗品、樣品2與逆流各部分的高效液相色譜圖；

圖5為對(duì)比例1的高速逆流色譜圖；

圖6為對(duì)比例2的高速逆流色譜圖。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

術(shù)語(yǔ)解釋部分：

爵床全草，包括爵床的根、莖和葉。

濃縮至無(wú)醇味，由于爵床粉碎后用95％乙醇回流提取，在濃縮過(guò)程中，乙醇受熱揮發(fā)，當(dāng)濃縮至無(wú)醇味時(shí)，說(shuō)明濃縮液中的乙醇基本揮發(fā)完全。

實(shí)施例1

一種爵床中木脂素類(lèi)單體的制備方法流程圖如圖1所示。

樣品提取

將干燥爵床全草(5kg)完全粉碎成粉末，用6l95％乙醇回流提取3次，每次2h，然后將提取物使用真空過(guò)濾裝置過(guò)濾。合并所有提取液并濃縮至無(wú)醇味，然后使用等量的乙酸乙酯萃取濃縮物。乙酸乙酯部分在55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到87.5g粗樣品，將其儲(chǔ)存在4℃的冰箱中進(jìn)行進(jìn)一步的hsccc純化。

應(yīng)用高速逆流色譜分離純化爵床中10個(gè)木脂素類(lèi)單體

在本文中，使用兩步hsccc分離方法，從爵床的乙酸乙酯提取物中成功分離出10種木脂素類(lèi)化合物。在第一步hsccc分離中，兩相溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1：0.7：1：0.7，v/v)，成功分離化合物a-e。在該步驟中，化合物f-j一起洗脫，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)完全分離。第二步中，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3：3.8：3：3.8，v/v)作為溶劑系統(tǒng)純化的化合物f-j。通過(guò)esi-ms和nmr鑒定了10種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。高速逆流色譜儀柱體積為300ml，上樣量320mg，轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/min，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，固定相保留率分別為61.5％、68.0％，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開(kāi)，取320mg粗品，溶解于5ml上相和5ml下相的混合物中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300ml)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開(kāi)啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800轉(zhuǎn)/min時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動(dòng)相流速為2.0ml/min，開(kāi)始泵流動(dòng)相，然后根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖(圖2)接收目標(biāo)成分，經(jīng)過(guò)兩步hsccc分離后共得7個(gè)木質(zhì)素和3個(gè)木質(zhì)素苷分別為：a：爵床脂素b(12.1mg)，b：爵床脂素a(14.2mg)，c：6′-羥基爵床脂素(16.4mg)，d：爵床脂素e(5.4mg)，e：lignanj1(7.9mg)，f：爵床苷e(8.3mg)，g：diphyllin-1-o-β-d-apiofuranoside(4.1mg)，h：山荷葉素(4.6mg)，i：6′-羥基爵床脂素b(5.2mg)，和j：diphyllinacetylapioside(3.9mg)，hplc分析純度均為95％以上，可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)一次分離得到的木脂素類(lèi)單體的種類(lèi)和數(shù)量都較多，而且單體的純度較高。

利用高效液相色譜分析分離物，液相條件：waters-rpc18柱(4.6×250mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)256nm，柱溫：25℃，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量：20μl，流動(dòng)相采用乙腈(a)和0.1％三氟乙酸水溶液(b)梯度洗脫，梯度條件如下：0min，30％a；0–10min，30–45％a；10–25min，45-60％a；25-40min，60-100％a。

結(jié)構(gòu)鑒定：對(duì)分離得到的木脂素單體應(yīng)用agilent5973n質(zhì)譜儀和varian600mhz核磁共振波譜儀分別進(jìn)行ms，nmr譜的測(cè)定，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2：

表1化合物a-j的¹h-nmr光譜數(shù)據(jù)(400mhz)

表2化合物a-j的¹³c-nmr光譜數(shù)據(jù)(400mhz)

實(shí)施例2

一種利用高速逆流色譜分離制備爵床中木脂素類(lèi)單體的方法流程圖如圖1所示。

樣品提?。簩⒏稍锞舸踩?5kg)完全粉碎成粉末，用7l95％乙醇回流提取3次，每次2h，然后將提取物使用真空過(guò)濾裝置過(guò)濾。合并所有提取液并濃縮至無(wú)醇味，然后使用等量的乙酸乙酯萃取濃縮物。乙酸乙酯部分在55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到87.7g粗樣品，將其儲(chǔ)存在4℃的冰箱中進(jìn)行進(jìn)一步的hsccc純化。

應(yīng)用高速逆流色譜分離純化爵床中10個(gè)木脂素類(lèi)單體：在本文中，使用兩步hsccc分離方法，從爵床的乙酸乙酯提取物中成功分離出10種木脂素類(lèi)化合物。在第一步hsccc分離中，兩相溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1：0.8：1：0.8，v/v)，成功分離化合物a-e。在該步驟中，化合物f-j一起洗脫，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)完全分離。第二步中，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3：4：3：4，v/v)作為溶劑系統(tǒng)純化的化合物f-j。通過(guò)esi-ms和nmr鑒定了10種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。高速逆流色譜儀柱體積為300ml，上樣量320mg，轉(zhuǎn)速800轉(zhuǎn)/min，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，固定相保留率分別為61.3％、68.2％，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開(kāi)，取320mg粗品，溶解于5ml上相和5ml下相的混合物中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測(cè)儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300ml)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開(kāi)啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800轉(zhuǎn)/min時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動(dòng)相流速為2.0ml/min，開(kāi)始泵流動(dòng)相，然后根據(jù)檢測(cè)器紫外光譜圖(圖2)接收目標(biāo)成分，經(jīng)過(guò)兩步hsccc分離后共得7個(gè)木質(zhì)素和3個(gè)木質(zhì)素苷分別為：a：爵床脂素b(12.0mg)，b：爵床脂素a(14.1mg)，c：6′-羥基爵床脂素(16.1mg)，d：爵床脂素e(5.2mg)，e：lignanj1(7.6mg)，f：爵床苷e(8.0mg)，g：diphyllin-1-o-β-d-apiofuranoside(4.0mg)，h：山荷葉素(4.5mg)，i：6′-羥基爵床脂素b(5.1mg)，和j：diphyllinacetylapioside(3.7mg)，hplc分析純度均為95％以上，可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)一次分離得到的木脂素類(lèi)單體的種類(lèi)和數(shù)量都較多，而且單體的純度較高。

對(duì)比例1

第一步hsccc分離的溶劑系統(tǒng)：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1:0.2:1:0.2，v/v)，流速：2mlmin^-1，進(jìn)樣量：320mg，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實(shí)施例1中的一樣。分離結(jié)果：出峰時(shí)間太慢，化合物e未能洗脫出來(lái)，如附圖5所示。

對(duì)比例2

第一步hsccc分離的溶劑系統(tǒng)：石油醚-乙酸乙酯-乙酸-水(1:1.2:1:1.2，v/v)，流速：2mlmin^-1，進(jìn)樣量：320mg，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實(shí)施例1中的一樣。分離結(jié)果：保留值過(guò)低，樣品同時(shí)被洗脫出，仍未得到有效分離，如附圖6所示。

由圖5和圖6可以看出，對(duì)比例1和對(duì)比例2是對(duì)溶劑系統(tǒng)中各溶劑的配比進(jìn)行了改變，導(dǎo)致了各個(gè)化合物沒(méi)有得到有效分離。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。