技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及Interferon-alpha-1（干擾素α1）真核細(xì)胞表達(dá)和制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種重組馬Interferon-alpha-1的在酵母細(xì)胞內(nèi)的重組、分泌表達(dá)和制備方法；此外本發(fā)明還涉及一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列。

背景技術(shù)：

在被動(dòng)免疫治療和預(yù)防中，馬抗體發(fā)揮了無(wú)可替代的作用。馬抗蛇毒抗體是治療蛇傷的最快速、最有效的藥物。

上海賽倫生物技術(shù)股份有限公司利用馬匹來(lái)生產(chǎn)抗生物毒素抗體，如抗蝮蛇血清、抗眼鏡蛇血清、抗銀環(huán)蛇血清、抗五步蛇血清等。這些血清特異性地治療相應(yīng)毒蛇咬傷的病人。在我國(guó)，應(yīng)用了這些抗血清后，每年挽救了上萬(wàn)名蛇傷病人的生命。但是免疫馬匹，獲得高效價(jià)抗相應(yīng)蛇毒抗體的成功率相對(duì)較低，能產(chǎn)生高抗體效價(jià)的馬匹是非常寶貴的，因此需要保證這些馬匹的健康。

我國(guó)每年有十幾萬(wàn)人被毒蛇咬傷，臨床使用抗蛇毒血清的量每年在10萬(wàn)支左右，用于免疫生產(chǎn)抗蛇毒血清的馬匹保有量常年保持在500匹左右。這些群養(yǎng)的動(dòng)物如果發(fā)生病毒感染，極易相互感染，需要能預(yù)防病毒感染的藥物。

Interferon-alpha-1（干擾素α1）具有廣譜抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)免疫功能等作用。干擾素與細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖。同時(shí)，它還可以激活自然殺傷細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞，誘導(dǎo)及加強(qiáng)細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物(MHC)抗原的表達(dá)，促進(jìn)宿主免疫應(yīng)答，抑制或清除細(xì)胞內(nèi)病毒，可以用于馬病毒性傳染病的預(yù)防。鑒于制備馬Interferon-alpha-1需要大量的馬白細(xì)胞，馬白細(xì)胞的來(lái)源極其有限，無(wú)法獲得大量的天然馬Interferon-alpha-1，因此，亟需研發(fā)一種重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，其可以高表達(dá)、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬Interferon-alpha-1，對(duì)抗血清制品生產(chǎn)的原料保證具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，該重組馬Interferon-alpha-1的制備方法設(shè)計(jì)巧妙，從而可以高表達(dá)、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬Interferon-alpha-1，進(jìn)而可以作為在病毒性疾病流行時(shí)，用于馬匹，以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組馬Interferon-alpha-1的制備方法，該方法包括如下步驟：

（1）將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的編碼馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列構(gòu)建入酵母細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)載體中；

（2）然后轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達(dá)；

（3）進(jìn)行純化，從而獲得所述重組馬Interferon-alpha-1。

其中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞所用的材料不含任何動(dòng)物或人來(lái)源的物質(zhì)，而且能在發(fā)酵過(guò)程中獲得高細(xì)胞密度。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞進(jìn)行在含一種或多種可供選擇的材料，如酵母提取物，甘油、甲醇和含氮鹽類(lèi)的培養(yǎng)基中實(shí)施。

較佳地，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。編碼如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

所述酵母細(xì)胞可以是任何合適的酵母細(xì)胞。

較佳地，所述酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞（即Pichia pastoris細(xì)胞）。

更佳地，所述畢赤酵母細(xì)胞（即Pichia pastoris細(xì)胞）是GS115細(xì)胞。

所述酵母細(xì)胞表達(dá)載體是畢赤酵母表達(dá)載體，載體轉(zhuǎn)染入畢赤酵母細(xì)胞（Pichia pastoris細(xì)胞）后與酵母染色體重組整合入酵母染色體中。

所述的酵母表達(dá)載體是適合于畢赤酵母細(xì)胞（Pichia pastoris細(xì)胞）的表達(dá)載體。

較佳地，所述的酵母表達(dá)載體為Pichia pastoris分泌型載體。

更佳地，所述的酵母表達(dá)載體為Pichia pastoris分泌型載體，其所用的啟動(dòng)子為AOX1啟動(dòng)子。

能表達(dá)Interferon-alpha-1。

較佳地，所述誘導(dǎo)表達(dá)在培養(yǎng)液的OD₆₀₀達(dá)到20-400時(shí)啟動(dòng)。

更佳地，所述OD₆₀₀為50-300。

更進(jìn)一步地，所述OD₆₀₀為150-250。

較佳地，所述的表達(dá)載體是分泌型表達(dá)載體，

更進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)表達(dá)通過(guò)甲醇進(jìn)行。

較佳地，所述純化采用離子交換層析將所述重組馬Interferon-alpha-1以單體形式分離。

重組Interferon-alpha-1純化后可以進(jìn)一步超濾濃縮然后添加保護(hù)劑和/或冷凍干燥保存。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種密碼子優(yōu)化的編碼Interferon-alpha-1的核苷酸序列，其特點(diǎn)是，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列，適于上述的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法是將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的編碼馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列構(gòu)建入酵母細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行純化，從而獲得所述重組馬Interferon-alpha-1，表達(dá)量可達(dá)約500 mg/l；純度高，經(jīng)檢測(cè)，不含可以用SDS-PAGE或HPLC檢測(cè)到的酵母細(xì)胞蛋白或其它殘留物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明獲得的重組馬Interferon-alpha-1具有生物學(xué)活性，因此本發(fā)明的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法設(shè)計(jì)巧妙，從而可以高表達(dá)、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬Interferon-alpha-1，進(jìn)而可以作為大規(guī)模馬匹飼養(yǎng)時(shí)在病毒性疾病流行時(shí)預(yù)防性使用，以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)，提高動(dòng)物抵抗病毒傳染病的能力，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例2中馬Interferon-alpha-1在畢赤酵母中表達(dá)所用的載體結(jié)構(gòu)圖譜。采用AOX1啟動(dòng)子與酵母ɑ-factor secretion signal分泌表達(dá)目的蛋白。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中表達(dá)馬Interferon-alpha-1的重組Pichia pastoris誘導(dǎo)后的上清液在還原條件下SDS-PAGE結(jié)果示意圖。圖2中從左到右，1：為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2. 為GS115酵母細(xì)胞；3-15為挑取的13個(gè)在無(wú)精氨酸培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的克隆。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中離子交換層析圖譜，第一峰是上樣流穿峰，第二峰為氯化鈉洗脫蛋白，此峰洗脫的蛋白為馬Interferon-alpha-1；第三峰為氫氧化鈉清洗雜蛋白峰。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中離子交換層析樣品SDS-PAGE的結(jié)果示意圖，從左到右，1：培養(yǎng)上清液；2:離子交換層析流穿液；3：氯化鈉洗脫蛋白；4：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特列舉以下具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。然而，具體實(shí)施例僅僅是用于舉例說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例I：表達(dá)序列獲取和優(yōu)化

為了達(dá)到使馬Interferon-alpha-1在酵母細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)這個(gè)目的，通過(guò)查文獻(xiàn)得到該完整基因的氨基酸序列（即SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列）。根據(jù)這個(gè)氨基酸序列，確定編碼馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列（即SEQ ID NO:1所示的序列），經(jīng)密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)了核苷酸序列（即SEQ ID NO:2所示的序列），將該核苷酸序列插入表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。然后使用相應(yīng)的誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)?？梢允褂卯叧嘟湍刚T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

實(shí)施例2：表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建和表達(dá)克隆篩選

在優(yōu)選實(shí)施方案中，含密碼子優(yōu)化的馬Interferon-alpha-1的核苷酸序列（即SEQ ID NO:1所示的序列） 在5’端加上XhoI位點(diǎn)和AAA AGA核苷酸序列，在3’端加入EcoRI位點(diǎn)。選用pPIC9質(zhì)粒（Invitrogen），用XhoI和EcoRI雙酶切使之線(xiàn)性化。將具有XhoI和EcoRI酶切獲得的馬Interferon-alpha-1 DNA 與XhoI和EcoRI線(xiàn)性化的pPIC9質(zhì)粒（Invitrogen）連接（見(jiàn)圖1），然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5ɑ（Invitrogen）獲得，名稱(chēng)定為pPIC9-Interferon-alpha-1。可理解，本發(fā)明不限于馬Interferon-alpha-1因子，也涉及其它動(dòng)物來(lái)源的（狗、羊、兔等）的Interferon-alpha-1。

pPIC9-Interferon-alpha-1用SalI酶切使之成線(xiàn)性，用苯酚：氯仿：異戊醇（phenol:chloroform:isoamyl alcohol）(25:24:1)抽提后，上清加乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA干燥去乙醇后加10微升TE緩沖液。

表達(dá)宿主細(xì)胞采用Pichia pastoris細(xì)胞株GS115。在長(zhǎng)有GS115的YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基）平板上挑取單克隆細(xì)胞接種到含5毫升YPD培養(yǎng)基的50毫升conical（圓錐形）管中，在28-30℃，250-300rpm條件下培養(yǎng)過(guò)夜。取0.5毫升過(guò)夜的培養(yǎng)細(xì)胞接種到含500毫升YPD培養(yǎng)基的2升三角燒杯中，在28-30℃，250-300rpm條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀=1.3-1.5。培養(yǎng)液1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于500毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于250毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于溫度為2-8℃、20毫升1 M 山梨醇中，1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于溫度為2-8℃、1毫升1 M 山梨醇中，此時(shí)重懸液的體積為1.5毫升左右。10微克線(xiàn)性化pPIC9-Interferon-alpha-1加入到80微升重懸的GS115細(xì)胞中混勻后轉(zhuǎn)移到0.2cm的電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)杯在冰浴中放置5分鐘，在電轉(zhuǎn)儀上脈沖電擊細(xì)胞一次。電擊后立即加入1毫升冰凍1 M 山梨醇，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管中。取200微升涂布到RDB板（RDB培養(yǎng)板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；50mg/L L-谷氨酸；50mg/L L-甲硫氨酸；50mg/L L-賴(lài)氨酸；50mg/L L-亮氨酸；50mg/L L-異亮氨酸；20g/L瓊脂）上，RDB板置28-30℃培養(yǎng)5-7天。挑取克隆，同時(shí)接種在MD培養(yǎng)板（MD培養(yǎng)板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖，20g/L瓊脂）和MM培養(yǎng)板（MM培養(yǎng)板成分：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；5ml/L甲醇；20g/L瓊脂）上，置28-30℃培養(yǎng)2天。兩天后比較同一克隆在MD培養(yǎng)板和MM培養(yǎng)板上生長(zhǎng)狀況，在MD和MM培養(yǎng)板上生長(zhǎng)正常的克隆為Mut⁺,在MD培養(yǎng)板上生長(zhǎng)正常，在MM培養(yǎng)板上生長(zhǎng)很慢或不生長(zhǎng)的克隆為Mut^s。

挑取Mut⁺克隆接種在含5毫升YPD培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖）的50毫升conical管中， 置28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)2天。離心棄上清，添加含1%甲醇的YP培養(yǎng)基（YP培養(yǎng)基成分：10g/L酵母提取物粉；20g/L蛋白胨）5毫升，置28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)72小時(shí)，在培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)每管分別加甲醇25微升。72小時(shí)后取培養(yǎng)上清，用SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）進(jìn)行分析。SDS-PAGE參照Sambrook et al.,Molecular Biology: A Laboratory Method,1989上的方法進(jìn)行。成層膠4%，分離膠12.5%。培養(yǎng)上清50微升和等量SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后取20微升上樣。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，分析結(jié)果。從圖2中可見(jiàn)，GS115細(xì)胞誘導(dǎo)后無(wú)19KD處蛋白條帶，而在無(wú)精氨酸培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的13克隆大部分在19KD處有蛋白條帶，有的克隆表達(dá)量高，有的克隆僅微量表達(dá)。表達(dá)陽(yáng)性的克隆，在19KD處可見(jiàn)一蛋白條帶。

實(shí)施例3：干擾素純化

取50毫升SP-Sepharose FF裝入2.6x10cm層析柱，凝膠先后用2體積1M NaCl, 2體積0.5 N NaOH清洗后用pH4.0、50 mM醋酸緩沖液平衡。

四個(gè)2000毫升三角燒瓶，每個(gè)含500毫升YPD培養(yǎng)基，均接種篩選到的最佳

Interferon-alpha-1表達(dá)克隆，28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)48小時(shí)，離心棄上清，在無(wú)菌條件下各加含0.5%（v/v）甲醇的YP培養(yǎng)基500毫升，28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)72小時(shí)，每24小時(shí)各添加2.5毫升甲醇。72小時(shí)后離心取上清，上清用20%醋酸調(diào)pH至4.0，上已經(jīng)平衡的SP-Sepharose FF離子交換層析柱。上樣完畢，層析柱用pH4.0、50 mM醋酸緩沖液洗滌至OD₂₈₀小于0.05，接著用pH4.0、50 mM醋酸、0.5 M氯化鈉緩沖液洗脫，收集洗脫獲得的蛋白峰，這個(gè)蛋白峰即為高純度重組馬Interferon-alpha-1（見(jiàn)圖3，第一峰是上樣流穿峰；第二峰為氯化鈉洗脫蛋白，此峰洗脫的蛋白為馬Interferon-alpha-1；第三峰為氫氧化鈉清洗雜蛋白峰）。SDS-PAGE中在19KD處有一蛋白條帶，未見(jiàn)其它蛋白條帶（見(jiàn)圖4）。2000毫升培養(yǎng)上清可以獲得500毫克馬Interferon-alpha-1，表達(dá)量可達(dá)約500 mg/l；經(jīng)檢測(cè)，不含可以用SDS-PAGE或HPLC檢測(cè)到的酵母細(xì)胞蛋白或其它殘留物。

實(shí)施例4：干擾素活性測(cè)定

用rhIFN-ɑ2b作對(duì)照（人干擾素生物學(xué)活性測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品），采用濾泡性口膜炎病毒（VSV）-人羊膜傳代細(xì)胞（WISH）體系測(cè)定干擾素的抗病毒活性。系依據(jù)干擾素可以保護(hù)人羊膜細(xì)胞WISH免受VSV破壞的作用，用結(jié)晶紫對(duì)存活的WISH細(xì)胞染色，于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定其吸光度，可得到干擾素對(duì)WISH細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)曲線(xiàn)，以此測(cè)定干擾素生物學(xué)活性。

試劑:

1.每升MEM加青霉素10⁵IU和鏈霉素10⁵IU再加碳酸氫鈉2.1g，除菌過(guò)濾，4℃保存。

 2.完全培養(yǎng)液量取新生牛血清10ml加MEM培養(yǎng)液90ml。4℃保存。

3.測(cè)定培養(yǎng)液量取新生牛血清7ml加MEM或RPMI 1640培養(yǎng)液93ml, 4℃保存。

4.攻毒培養(yǎng)液量取新生牛血清3ml加MEM培養(yǎng)液97ml,4℃保存。

5.消化液取乙二胺四乙酸二鈉0.2g、氯化鈉8.0g、氯化鉀2g、磷酸氫二鈉1.152g、磷酸二氫鉀0.2g加水溶解并稀釋至1000ml經(jīng)121℃ 15分鐘滅菌。使用時(shí)加胰蛋白酶至0.25%（w/v）濃度。

6.染色液取結(jié)晶紫50mg加無(wú)水乙醇20ml溶解后加水稀釋至100ml即得。

7.脫色液取無(wú)水乙醇50ml、乙酸0.1ml加水稀釋至100ml。

8.PBS緩沖液取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g加水溶解并稀釋至1000ml經(jīng)121℃ 15分鐘滅菌。

9. 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：取人干擾素生物學(xué)活性測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋至每1ml含1000IU。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2孔。在無(wú)菌條件下操作。

10. 供試品溶液的制備將供試品按標(biāo)示量溶解后用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋成每1ml約含1000IU。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2個(gè)孔。在無(wú)菌條件下操作。

具體實(shí)驗(yàn)如下：

使WISH細(xì)胞在含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。按1:3傳代每周2次于完全培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。棄去培養(yǎng)液用PBS洗貼壁細(xì)胞2次后，消化和收集細(xì)胞，用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基配制成每1ml 含2.5×10⁵~3.5×10⁵個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)6小時(shí)。棄去孔中細(xì)胞培養(yǎng)液，將配制完成的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液移入接種WISH細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時(shí)。棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液。分別向每孔加100μl將配制好的水泡性口炎病毒（VSV）（-70℃保存）攻毒培養(yǎng)液。于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)24小時(shí)，鏡檢觀察細(xì)胞狀況后棄細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，每孔加入染色液50μl，室溫放置30分鐘后用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分每孔加入脫色液100μl室溫放置3-5分鐘?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀以630nm為參比波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果，計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣品中的半效稀釋倍數(shù)，然后按公式：待測(cè)樣品效價(jià)=標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)x待測(cè)樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)樣品預(yù)稀釋倍數(shù)x待測(cè)樣品半效稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)樣品半效稀釋倍數(shù)。經(jīng)測(cè)定，1毫克馬Interferon-alpha-1活性為3.5x10⁸，其活性與人α2b干擾素相似。

表達(dá)的Interferon-alpha-1蛋白與其它雜蛋白分離，隨后超濾濃縮，添加保護(hù)劑并冷凍干燥。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法可以高表達(dá)、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬Interferon-alpha-1。馬Interferon-alpha-1的氨基酸序列（帶有信號(hào)肽）如SEQ ID NO:3所示，重組表達(dá)馬Interferon-alpha-1的氨基酸序列（無(wú)信號(hào)肽）如SEQ ID NO:4所示。

綜上，本發(fā)明的重組馬Interferon-alpha-1的制備方法設(shè)計(jì)巧妙，從而可以高表達(dá)、高純度地獲得具有生物學(xué)活性的重組馬Interferon-alpha-1，進(jìn)而可以作為大規(guī)模馬匹飼養(yǎng)時(shí)在病毒性疾病流行時(shí)預(yù)防性使用，以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)，提高動(dòng)物抵抗病毒傳染病的能力，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

在此說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書(shū)和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。

序列表

<110>上海賽倫生物技術(shù)股份有限公司

<120>一種重組馬Interferon-alpha-1的制備方法

<130>HJ17-12952

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 馬Interferon-alpha-1

<400> 1

atggctttgc cagtttcttt gttgatggct ttggttgttt tgtcttgtca ctctatctgt 60

tctttgggtt gtgacttgcc acacactcac tctttgggta acactagagt tttgatgttg 120

ttgggtcaaa tgagaagaat ctctccattc tcttgtttga aggacagaaa cgacttcggt 180

ttcccacaag aagttttcga cggtaaccaa ttcagaaagc cacaagctat ctctgctgtt 240

cacgaaacta tccaacaaat cttccacttg ttctctactg acggttcttc tgctgcttgg 300

gacgaatctt tgttggacaa gttgtacact ggtttgtacc aacaattgac tgaattggaa 360

gcttgtttgt ctcaagaagt tggtgttgaa gaaactccat tgatgaacga agactctttg 420

ttggctgtta gaagatactt tcagagaatc gcgttgtact tgcaagagaa gaagtactct 480

ccatgtgctt gggaaatcgt tagagctgaa atcatgagat cgttctcttc ttctactaac 540

ttgccacaat ct 552

<210> 2

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctttgc cagtttcttt gttgatggct ttggttgttt tgtcttgtca ctctatctgt 60

tctttaggtt gtgacttacc acacactcac tctttgggta acactagagt tttgatgttg 120

ttaggtcaaa tgagaagaat ctctccattc tcttgtttga aggacagaaa cgacttcggt 180

ttcccacaag aggttttcga cggtaaccaa ttcagaaagc cacaagctat ctctgctgtt 240

cacgaaacta tccaacaaat cttccacttg ttctctactg acggttcttc tgctgcttgg 300

gacgaatctt tgttagacaa gttgtacact ggtttgtacc aacaattgac tgaattagag 360

gcttgtttgt ctcaagaagt tggtgttgaa gagactccat tgatgaacga agactctttg 420

ttagctgtta gaagatactt tcagagaatc gcattgtact tacaagagaa gaagtactct 480

ccatgtgctt gggaaatcgt tagagctgag atcatgagat cgttctcttc ttctactaac 540

ttaccacaat ct 552

<210> 3

<211> 553

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

METALALEUP ROVALSERLE ULEUMETALA LEUVALVALL EUSERCYSHI SSERILECYS 60

SERLEUGLYC YSASPLEUPR OHISTHRHIS SERLLEUGLY ASNTHEARGV ALLEUMETLE 120

ULEUGLYGLN METARGARGI LESERPROPH ESERCYSLEU LYSASPARGA SNASPPHEGL 180

YPHEPROGLN GLUVALPHEA SPGLYASNGL NPHEARGLYS PROGLNALAI LESERALAVA 240

LHISGLUTHR ILEGLNGLNI LEPHEHISLE UPHESERTHR ASPGLYSERS ERALAALATR 300

PASPGLUSER LEULEUASPL YSLEUTYRTH RGLYLEUTYR GLNGLNLEUT HRGLULEUGL 360

UALACYSLEU SERGLNGLUV ALGLYVALGL UGLUTHRPRO LEUMETASNG LUASPSERLE 420

ULEUALAVAL ARGARGTYRP HEGLNARGIE UALALEUTYR LEUGLNGLUL YSLYSTYRSE 480

RPROCYSALA TRPGLUILEV ALARGALAGL UILEMETARG SERPHESERS ERSERTHRAS 540

NLEUPROGLN SER 553

<210> 4

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

CYSASPLEUP ROHISTHRHI SSERLLEUGL YASNTHEARG VALLEUMETL EULEUGLYGL 60

NMETARGARG ILESERPROP HESERCYSLE ULYSASPARG ASNASPPHEG LYPHEPROGL 120

NGLUVALPHE ASPGLYASNG LNPHEARGLY SPROGLNALA ILESERALAV ALHISGLUTH 180

RILEGLNGLN ILEPHEHISL EUPHESERTH RASPGLYSER SERALAALAT RPASPGLUSE 240

RLEULEUASP LYSLEUTYRT HRGLYLEUTY RGLNGLNLEU THRGLULEUG LUALACYSLE 300

USERGLNGLU VALGLYVALG LUGLUTHRPR OLEUMETASN GLUASPSERL EULEUALAVA 360

LARGARGTYR PHEGLNARGI EUALALEUTY RLEUGLNGLU LYSLYSTYRS ERPROCYSAL 420

ATRPGLUILE VALARGALAG LUILEMETAR GSERPHESER SERSERTHRA SNLEUPROGL 480

NSER 484