本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種大片段基因整合提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法。

背景技術(shù)：

里氏木霉纖維素酶是一種廣泛應(yīng)用的酶類(lèi)；里氏木霉具有很好的胞外酶表達(dá)能力，是食品或工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的菌種。里氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶酶系組成中，葡糖苷酶的活力相對(duì)較低。已有的提高里氏木霉纖維素酶酶系的方法是通過(guò)基因工程的手段導(dǎo)入葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，從而提高纖維素酶蛋白的分泌量。目前這些方法中，每次只能剔除一個(gè)基因或增強(qiáng)一個(gè)基因的表達(dá)。

實(shí)際上，非纖維素酶的酶類(lèi)對(duì)里氏木霉的代謝網(wǎng)絡(luò)也會(huì)產(chǎn)生影響。非纖維素酶類(lèi)和纖維素酶類(lèi)的多克隆可能是提高纖維素酶酶活的一個(gè)創(chuàng)新型的策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種大片段基因整合提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法，該方法通過(guò)多次同源重組將黑曲霉維素酶系相關(guān)的基因大片段一次性整合到里氏木霉基因組中，達(dá)到纖維素酶基因、非纖維素酶基因多克隆的效果，從而影響里氏木霉的代謝網(wǎng)絡(luò)，提高里氏木霉的纖維素酶酶活。本發(fā)明的目的還在于提供一種纖維素酶酶活提高的里氏木霉菌株。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種大片段基因整合提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法，包括如下步驟：

（1）合成兩端含有限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列的如下DNA片段：

DNA片段1：酶切位點(diǎn)序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因單元盒-里氏木霉基因組片段1-黑曲霉基因同源片段后段1-酶切位點(diǎn)序列2；

DNA片段1-2：酶切位點(diǎn)序列1-黑曲霉基因同源片段前段1-里氏木霉基因組片段1-酶切位點(diǎn)序列2；

DNA片段2：酶切位點(diǎn)序列1-黑曲霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因單元盒-里氏木霉基因組片段2-黑曲霉基因同源片段后段2-酶切位點(diǎn)序列2。

其中，黑曲霉基因同源片段前段1的序列如SEQ ID NO.1所示，潮霉素抗性基因單元盒的序列如SEQ ID NO.2所示，里氏木霉基因組片段1的序列如SEQ ID NO.3所示，黑曲霉基因同源片段后段1的序列如SEQ ID NO.4所示，黑曲霉基因同源片段前段2的序列如SEQ ID NO.5所示，里氏木霉基因組片段2的序列如SEQ ID NO.6所示，黑曲霉基因同源片段后段2的序列如SEQ ID NO.7所示。

（2）將步驟（1）中的3個(gè)DNA片段分別連接到載體上構(gòu)建得到同源重組載體1、同源重組載體1-2、同源重組載體2。

（3）用同源重組載體1轉(zhuǎn)化黑曲霉，篩選得到同源重組成功的黑曲霉菌株1。黑曲霉菌株1的基因組上含有外源片段潮霉素抗性基因單元盒、里氏木霉基因組片段1。

用同源重組載體1-2轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株1，篩選得到同源重組成功的黑曲霉菌株1-2。黑曲霉菌株1-2在黑曲霉菌株1的基礎(chǔ)上去除了潮霉素抗性基因單元盒，其基因組上含有外源片段里氏木霉基因組片段1。

用同源重組載體2轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株1-2，篩選得到同源重組成功的黑曲霉菌株2。黑曲霉菌株2的基因組上含有外源片段里氏木霉基因組片段1、潮霉素抗性基因單元盒、里氏木霉基因組片段2。

（4）將黑曲霉菌株2的基因組斷裂片段導(dǎo)入到里氏木霉，以潮霉素抗性作為篩選標(biāo)記，篩選得到同源重組成功的里氏木霉菌株G，里氏木霉菌株G的纖維素酶酶活得到提高。此過(guò)程的同源重組是以里氏木霉基因組片段1、里氏木霉基因組片段2為同源重組位點(diǎn)，將黑曲霉菌株2基因組上這兩個(gè)位點(diǎn)之間的大片段整合到了里氏木霉基因組上。

優(yōu)選的，上述方法中，所述的載體為pCAMBIA1300，酶切位點(diǎn)序列1、酶切位點(diǎn)序列2分別為SacII、HindIII的酶切位點(diǎn)序列；所述的黑曲霉為黑曲霉CBS 513.88；所述的里氏木霉為里氏木霉QM6a。

一種纖維素酶酶活提高的里氏木霉菌株，通過(guò)上述方法得到。

本發(fā)明大大提高了里氏木霉的纖維素酶酶活，所得到菌株的濾紙酶活是出發(fā)菌株的2.28倍。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

1、材料

黑曲霉CBS 513.88，里氏木霉QM6a，質(zhì)粒pCAMBIA1300（Biovector），農(nóng)桿菌EHA105，大腸桿菌DH5α，限制性?xún)?nèi)切酶（TakaRA）等。

合成的DNA片段1，其序列組成為：GGCCGCGG（SacII酶切位點(diǎn)序列）-黑曲霉基因同源片段前段1-潮霉素抗性基因單元盒-里氏木霉基因組片段1-黑曲霉基因同源片段后段1-AAGCTTGG（HindIII酶切位點(diǎn)序列）。

合成的DNA片段1-2，其序列組成為：GGCCGCGG（SacII酶切位點(diǎn)序列）-黑曲霉基因同源片段前段1-里氏木霉基因組片段1-AAGCTTGG（HindIII酶切位點(diǎn)序列）。

合成的DNA片段2，其序列組成為：GGCCGCGG（SacII酶切位點(diǎn)序列）-黑曲霉基因同源片段前段2-潮霉素抗性基因單元盒-里氏木霉基因組片段2-黑曲霉基因同源片段后段2-AAGCTTGG（HindIII酶切位點(diǎn)序列）。

其中，黑曲霉基因同源片段前段1、潮霉素抗性基因單元盒、里氏木霉基因組片段1、黑曲霉基因同源片段后段1、黑曲霉基因同源片段前段2、里氏木霉基因組片段2、黑曲霉基因同源片段后段2的序列分別如SEQ ID NO.1-7所示。

2、方法

一、同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）質(zhì)粒pCAMBIA1300的提取

含有pCAMBIA1300的大腸桿菌DH5α接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基：氯化鈉1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃滅菌20min，加入微孔過(guò)濾的卡那霉素，卡那霉素在LB中的終濃度為30μg/mL）中，35℃培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照說(shuō)明書(shū)說(shuō)明提取pCAMBIA1300質(zhì)粒，提取步驟如下：

使用前請(qǐng)先在漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。

1）柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

2）取2mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12000rpm（13400×g）離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。

4）向離心管中加入250μL溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。

5）向離心管中加入350μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm（13400×g）離心10min。

6）將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

7）可選步驟：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步可省略。

8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

9）重復(fù)操作步驟8）。

10）將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

11）將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm（13400×g）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過(guò)小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測(cè)序，需使用ddH₂O做洗脫液，并保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm（13400×g）離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

（2）質(zhì)粒pCAMBIA1300、DNA片段的酶切和電泳

往41μL pCAMBIA1300質(zhì)粒溶液或DNA片段（DNA片段1、1-2、2）溶液中加入2μL SacII、2μL HindIII和5μL酶切緩沖液，總體積為50.0μL，在30℃酶切2h。使用瓊脂糖凝膠電泳試劑盒（上海一基實(shí)業(yè)有限公司）進(jìn)行電泳。

1）打開(kāi)試劑盒，依照說(shuō)明書(shū)清點(diǎn)各種試劑，并按實(shí)驗(yàn)需要量將50×電泳緩沖液稀釋為1×電泳緩沖液待用；將核酸熒光染料與6×Loading Buffer按1:1比例混合備用。

2）把U型凝膠托盤(pán)放入制膠槽中，插好梳子，置于一水平面上。

3）將0.25g瓊脂糖加到盛有適當(dāng)體積1×電泳緩沖液的三角瓶或玻璃瓶中（常用凝膠濃度0.8-1.2%）。

4）將瓶口用封口膜輕輕蓋住，在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖完全熔化（熔化到?jīng)]有小顆粒物為止）。

5）將溫?zé)岬哪z溶液倒入U(xiǎn)型凝膠托盤(pán)中（超過(guò)二分之一處）。

6）將凝膠室溫放置15-30min完全冷卻至凝固，小心拔除梳子，將凝膠托盤(pán)移入電泳槽，梳井（點(diǎn)樣孔）一端朝負(fù)極方向，加入1×電泳緩沖液，使凝膠全部被浸沒(méi)。

7）將樣品與6×Loading Buffer和核酸熒光染料充分混合（20μL樣品+1μL 6×Loading Buffer+1μL核酸熒光染料），用微量移液器將以上混合物緩慢加入梳井內(nèi)，注意避免引入氣泡。

8）蓋上電泳槽蓋，樣品應(yīng)向陽(yáng)極（紅色插頭）泳動(dòng)，提供5-10V/cm的電壓。

9）當(dāng)樣品與染料在凝膠中遷移到足夠距離時(shí)，關(guān)上電源，拔出電極插頭和打開(kāi)電泳槽蓋，在DNA電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶。

（3）膠回收

使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收質(zhì)粒pCAMBIA1300、DNA片段的酶切、電泳產(chǎn)物。

1）從瓊脂糖凝膠中割下含目的條帶的膠塊，稱(chēng)重。

2）加入膠塊重量3-6倍的Buffer B2，50℃水浴5-10分鐘溶膠。

3）選做，對(duì)于<500bp的片段，加入1/3 Buffer B2體積的異丙醇。

4）將溶膠液移入吸附柱中，8000×g離心30秒。倒掉收集管中液體。

5）加入500μL Wash Solution，9000×g離心30秒，倒掉收集管中液體。

6）重復(fù)步驟5）一次。

7）空吸附柱于9000×g離心1分鐘。

8）將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入15-40μL Elution Buffer，室溫靜置1分鐘后，離心1分鐘。保存管中DNA溶液。

（4）質(zhì)粒pCAMBIA1300和DNA片段的連接

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara）進(jìn)行連接。

1）將酶切的質(zhì)粒pCAMBIA1300與酶切的DNA片段混合制備成體積為10μL的DNA溶液，質(zhì)粒和DNA片段的體積比為1:3。

2）向上述DNA溶液中加入等體積的 Solution I，充分混勻。

3）16℃反應(yīng)12h。

（5）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和篩選

1）從-80℃冰箱中取100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞懸液，冰上溶解10分鐘。

2）取10μL上述連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。

3）42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻2分鐘。

4）加入890μL LB 液體培養(yǎng)基（不含Kan），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（KanR）。

5）將上述菌液搖勻后取100μL 涂布于含Kan的LB篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后挑取部分轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)后，提質(zhì)粒驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的同源重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300-1（pCAMBIA1300與DNA片段1連接）、pCAMBIA1300-1-2（pCAMBIA1300與DNA片段1-2連接）、pCAMBIA1300-2（pCAMBIA1300與DNA片段2連接）。

二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉及篩選同源重組菌株

（1）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

1）在新活化的農(nóng)桿菌EHA105的LB平板（LB液體培養(yǎng)基添加5%瓊脂）上，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基。

2）28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.7。

3）取1.5mL無(wú)菌離心管，每管分裝1mL菌液，6000r/min離心10min。

4）去除上清，用1mL 10%無(wú)菌甘油重懸菌體，6000r/min離心10min，重復(fù)此過(guò)程3次，充分洗滌菌體以去除殘留的培養(yǎng)基。

5）洗好的菌體用100μL 20%無(wú)菌甘油重懸，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）質(zhì)粒pCAMBIA1300-1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1）將100μL農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入10μL 質(zhì)粒pCAMBIA1300-1，充分混勻，冰上放置30min。

2）置液氮中快速冷卻約1min后迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，待其融化。

3）加1mL無(wú)抗生素的YM 液體培養(yǎng)基（酵母膏0.3%，胰蛋白胨0.5%，麥芽糖0.5%，自然pH）于28℃、230r/min培養(yǎng)2-4h。

4）3000r/min離心2min收集菌體，將上清吸去500μL，剩余液體重懸培養(yǎng)菌后直接涂布含卡那霉素30μg/mL的YM平板，28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)36h。

5）挑取單菌落接種到含卡那霉素的YM液體培養(yǎng)基中，28℃、250r/min 培養(yǎng)48h，將菌液用于保存-20℃，得到含有質(zhì)粒pCAMBIA1300-1的農(nóng)桿菌。

（3）黑曲霉菌絲的制備

1）從-80℃冰箱取出甘油管保藏的黑曲霉CBS 513.88菌株，置于室溫下，快速解凍。

2）吸取適量菌液加到淀粉培養(yǎng)基平板上，用涂布棒將菌液涂布均勻（或者用無(wú)菌接種環(huán)蘸取適量菌液作平板劃線分離），34℃恒溫培養(yǎng)5天。

3）待平板上長(zhǎng)出單菌落后，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落移至裝有察氏培養(yǎng)基的三角瓶中，34℃培養(yǎng)5天。

4）將三角瓶中菌液全部轉(zhuǎn)移至50mL離心管，8000rpm離心5min，棄去上清。

5）加入20mL生理鹽水，反復(fù)吹打混勻，8000rpm離心洗滌 5min，棄上清，再加入適量生理鹽水重懸使菌體濃度OD₆₀₀值達(dá)到1.5左右，留待轉(zhuǎn)化用。

（4）含有質(zhì)粒pCAMBIA1300-1的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉

1）試劑的配制

無(wú)機(jī)鹽液：將2.61g KCl、7.48g KH₂PO₄和29.8g NaNO₃溶于80mL水中，再加水定容至100mL，用5M KOH調(diào)pH至5.5，高壓滅菌，4℃保存。

50%葡萄糖（w/v）：50g葡萄糖溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌。

1M MgSO₄：24.7g MgSO₄溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌。

MM微量元素溶液：將1.1g H₃BO₃、2.1g ZnSO₄·7H₂O、0.16g CuSO₄·5H₂O、0.5g MnC1₂·4H₂O、0.5g FeSO₄·7H₂O、0.17g CoC1₂·6H₂O、0.15g Na₂MoO₄·2H₂O和0.1g EDTA溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。

MM選擇培養(yǎng)平板：取20mL無(wú)機(jī)鹽溶液、20mL 50%葡萄糖溶液、2mL 1M MgSO₄溶液、1mL MM微量元素溶液加入到957mL經(jīng)高壓滅菌含有20g瓊脂粉的蒸餾水中使總體積至1L，充分混勻（即瓊脂濃度2%）。當(dāng)溫度降至60℃，加入1mL 100mg/mL潮霉素B（終濃度100μg/mL）和1mL 0.2M頭孢噻肟（終濃度0.2mM），加入1mL 200mM乙酰丁香酮（終濃度0.2mM)，混合均勻后制成MM選擇培養(yǎng)平板。

PDA培養(yǎng)基：①稱(chēng)量和熬煮：按培養(yǎng)基配方逐一稱(chēng)取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000mL，在加熱器上加熱至沸騰，維持20-30min，用2層紗布趁熱在量杯上過(guò)濾，濾渣棄取。②加熱溶解：把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15-20g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所1000mL。

2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉

在含有200μM乙酰丁香酮的IM培養(yǎng)基平板上貼一層玻璃紙濾膜（盡量不要產(chǎn)生氣泡），將100μL黑曲霉菌絲懸液與100μL轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒pCAMBIA1300-1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液等體積混合均勻后涂布于濾膜上，22.5℃避光培養(yǎng)3天。

3）篩選

將濾膜轉(zhuǎn)移至含有200μM頭孢噻肟（目的殺死農(nóng)桿菌細(xì)胞）和100μg/mL潮霉素的MM選擇培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)4-6天，待菌落長(zhǎng)出后，挑去菌落進(jìn)行鑒定，篩選得到的同源重組成功的菌株命名為黑曲霉菌株1。黑曲霉菌株1的基因組上含有潮霉素抗性基因單元盒、里氏木霉基因組片段1。

（5）黑曲霉菌株1潮霉素抗性基因的去除

按照上述步驟（1）-（4）的方法用同源重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-1-2轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株1，轉(zhuǎn)化后篩選的方法為：將濾膜涂布于MM平板上，30℃培養(yǎng) 4-6天，對(duì)長(zhǎng)出的每個(gè)菌落標(biāo)記后，再轉(zhuǎn)移接種于含有100μg/mL潮霉素的MM平板上，30℃培養(yǎng) 4-6天，對(duì)應(yīng)接入的地方?jīng)]有長(zhǎng)出菌落的菌株即為去除潮霉素抗性基因的黑曲霉菌株1-2。黑曲霉菌株1-2的基因組上含有里氏木霉基因組片段1。

（6）質(zhì)粒pCAMBIA1300-2轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株1-2

按照上述步驟（1）-（4）的方法用同源重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-2轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株1-2，篩選得到的同源重組成功的菌株即為黑曲霉菌株2。黑曲霉菌株2的基因組上含有里氏木霉基因組片段1、潮霉素抗性基因單元盒、里氏木霉基因組片段2。

三、纖維素酶酶活提高的里氏木霉菌株的構(gòu)建

（1）黑曲霉菌株2基因組提取

黑曲霉菌株2基因組提取用真菌基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)D2300，生產(chǎn)廠家北京索萊寶）提取。提取步驟如下：

1）黑曲霉菌株2菌絲接種于PDA平板，30℃培養(yǎng) 3天，從平板上挑取100mg菌絲，加200μL溶液A，用玻璃研磨器適當(dāng)研磨分散菌絲，加入20μL RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約30min。

2）加入20μL 10mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，55℃水浴消化，30min。消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，12000rpm離心2min。將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。如有沉淀，可再次離心。

3）在上清中加入200μL溶液B，充分混勻。如出現(xiàn)白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即會(huì)消失，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說(shuō)明樣品消化不徹底，可能導(dǎo)致提取的DNA量少及不純，還有可能導(dǎo)致上柱后堵柱子，請(qǐng)?jiān)黾酉瘯r(shí)間。

4）再加入200μL無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，放置2分鐘。

5）12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

6）向吸附柱中加入700μL漂洗液（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7）向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8）12000rpm離心2min，將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。

9）將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心1min。

10）離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，即可得基因組DNA。

11）基因組DNA用移液槍反復(fù)吹打，并用槍頭在離心管壁反復(fù)碾壓，得到黑曲霉菌株2的基因組斷裂片段。

（2）黑曲霉菌株2的基因組斷裂片段導(dǎo)入到里氏木霉

里氏木霉QM6a接種到PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4d，挑取菌絲。按照裂解酶液:菌絲重量10:1配比混合，30℃酶解2h，得到里氏木霉原生質(zhì)體懸液。裂解酶液組成為：2g/L纖維素酶+1g/L蝸牛酶溶解于1mol/L山梨醇溶液；纖維素酶、蝸牛酶購(gòu)自華美生物工程公司。

取100μL里氏木霉原生質(zhì)體懸液、黑曲霉菌株2的基因組斷裂片段 20μL，用槍頭輕輕吹吸混勻，加入500μL PEG溶液（25% PEG8000，50mmol/LCaCl₂，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5），輕輕顛倒混勻，冰浴20min，取出后緩緩加入1mL PEG溶液，室溫放置5min，將其與含有潮霉素B（100μg/mL）的再生培養(yǎng)基（酵母提取物0.2g/L，蛋白胨0.5g/L，氯化鈉0.2g/L，66g/L MaSO₄，淀粉1g/dL，瓊脂117g/L）混勻后倒平板，34℃培養(yǎng)5-6d，在再生培養(yǎng)基上篩選得到的同源重組成功的菌株即為目的菌株。此過(guò)程的同源重組是以里氏木霉基因組片段1、里氏木霉基因組片段2為同源重組位點(diǎn)，將黑曲霉菌株2基因組上這兩個(gè)位點(diǎn)之間的大片段整合到了里氏木霉基因組上。將目的菌株命名為里氏木霉菌株G。

（3）里氏木霉菌株G發(fā)酵

里氏木霉菌株G選育：挑取里氏木霉菌株G孢子用無(wú)菌水稀釋到孢子濃度為1×10⁷/mL，涂布PDA平板，30℃培養(yǎng)72h得到單菌落，單菌落接種到PDA斜面，30℃培養(yǎng)108h左右，得到里氏木霉菌株G選育的孢子。同時(shí)以出發(fā)菌株里氏木霉QM6a作為對(duì)照。

接種發(fā)酵：選育的孢子接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，孢子最終濃度為1×10⁸孢子/mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、130r/m培養(yǎng)96h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：MM微量元素液5mL，麩皮20g，甘蔗渣（粉碎過(guò)20目篩）10g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，自來(lái)水定容至1L。

發(fā)酵結(jié)束后，用濾紙過(guò)濾發(fā)酵液，測(cè)定濾液的纖維素酶酶活，測(cè)定方法依據(jù)文獻(xiàn)（馮月，蔣建新，朱莉偉，菅紅磊。纖維素酶活力及混合纖維素酶協(xié)同作用的研究。北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，第31卷，增刊1）。測(cè)定的里氏木霉菌株G發(fā)酵液的濾紙酶活為3.6U/mL，葡糖苷酶酶活為16.2U/mL，外切酶酶活為0.29U/mL；里氏木霉QM6a發(fā)酵液的濾紙酶活為1.58U/mL，葡糖苷酶酶活為9.68U/mL，外切酶酶活為0.13U/mL。

從結(jié)果可以看出，里氏木霉菌株G的纖維素酶、葡糖苷酶、外切酶的酶活均顯著增加。雖然轉(zhuǎn)化的大片段僅僅有纖維素外切酶基因，但是葡糖苷酶的活性也增加了，這表明大片段中其它基因的表達(dá)，促進(jìn)了葡糖苷酶酶活的增加。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業(yè)大學(xué)

<120> 一種大片段基因整合提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 黑曲霉基因同源片段前段1

<400> 1

actacccgca ccgatacgga aagccgtgct cgacatcgac tagtacacta cttgtaaact 60

aggttgcagg agctctttaa cacattctcg aagtaaatat gtggtaaata gatgaaacat 120

ctagtatccc ttagcatcat tgatattttg accctacact tagcccggat acttgttgcc 180

gtagaaccaa tatacatgga gcagaagcgg aaagaactcc aggaagaaag aagtaatcca 240

gcaggtaaga ttcgggccca accgatccga tgatccgaag cgcagcatct agtagattta 300

gtcctacagt agaggggatt gagcaccgtg gaggattggg aaaggcatag gcatggtaca 360

ttagtagtag ttacatgtct gcatggtaac gtcatagttg acagggaagg agacaaagaa 420

agaagtaaaa actttttgta ggttatccaa caggcagaca taaaatttaa gaggtatagt 480

ttttctagtc tagatctagt ctcacacccc cagattcatt attctgactg cctagtgcac 540

ttcgctcgga ccctttacta aatgtttaac tcgccgatga atatccggag tccatgactc 600

cgtcgttggg agcgttggta cacgatttca tcctgaactt tcgggataaa gttcgtattt 660

cattctagac tacactgcac ttggcacctg ccagtcgtac gggtaatcat cggtagaaaa 720

acaggctctt acgggttcac catgtggatg ccgttcgggt tcatccgttg atgagccttg 780

gtgagctgct acacgtcccg gggttgtcac ggttgtggct ggaggtggag gccctcagac 840

ccgggataca ccccacatgg ggaagaatta aaattgcaaa gggtaactcg ggtaactatg 900

taccgtgtaa tgaggtacct tctaccggga ttagattgat tagtatgcag ttggaaatgc 960

ccaggcttta tttccaatgc atgtacgagg gcattgcgct gcttgtaagc atctagtggg 1020

tgagacgctt tacctggacc ggctataaag cagtgacaag ggtacggttg tttctcatcc 1080

ttccgtagaa tccggttact tggcccgggg gcattcgggt cgatgtagct ggttttgctt 1140

<210> 2

<211> 988

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 潮霉素抗性基因單元盒

<400> 2

aattcggggg atctggattt tagtactgga ttttggtttt aggaattaga aattttattg 60

atagaagtat tttacaaata caaatacata ctaagggttt cttatatgct caacacatga 120

gcgaaaccct ataggaaccc taattccctt atctgggaac tactcacaca ttattatgga 180

gaaactcgag cttgtcgatc gacagatcag agatagattt gtagagagag actggtgatt 240

tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga 300

tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt 360

gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct 420

ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg 480

catttgtagg tgccaccttc cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg 540

caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt 600

tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc 660

atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg 720

atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg 780

atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc 840

cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc 900

ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg 960

gagtagacga gagtgtcgtg ctccacca 988

<210> 3

<211> 1500

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 里氏木霉基因組片段1

<400> 3

atgagcctct ctcgagcttt ggccgcggta ctcgcctatg gatcgattgt tcatgcaaca 60

tcctcttacg acgtctttga ctatgtagat cctctcatag gaactgccaa cggaggacat 120

gtctttgctg gcgcgactct tccattcggt ctcgcgaagg cggtggctga ctctgtaaat 180

gacaatgcgg gtggctatgc ttcggatggc ggtcccatca cgggcttttc tcacatgcat 240

gacagcggaa ctggtggtgg tgcctctctt ggaaactttc ccctattccc tcagagcgga 300

tgtacagcag ggctcctcga caactgttac ttcaccaagg cagaccgcca gtctatgcca 360

atcaacaact cgattgaggc gcatccgggc tacttttccg tgaccctcaa cacctctatc 420

aaggcggaga tgacggtgtc gaacaagacg gctctgtatc gcttcacctt tcccgatgag 480

cctgtgccca tgaaaggagg agacgcaact ggagacaacg cgatcccgta tgagcccgtc 540

atcttggccg acttgacaga tctctccgac tctaggagca agggaagcgt gtctgttgat 600

ccgcacagcg ggcgaatcac cggctctggg acattcaatc cctcgtttgg agtcggcact 660

tatacgctgt acttttgcac agactttcag ggcgcgagca tcaagaacac gggcgtcttc 720

cagaacaaca gggccggcac caacttcaag cagctaaaga ctgaaaccgc gactgtgacg 780

gggccgcctg tccctggagg agcctttgtc cagttcaaca agcccagcaa taaccagatc 840

ctggcgagag tgggcttgtc gtttatcagc accaaccagg cttgcagcaa tgcccagtcc 900

gagattccga ggtttgactt ccagggaacc ctggagactg ctgaggatgc ttggcggcag 960

aagttgggtg tggtcaaggt cgataacacg ggtgttgaca aggacattct gacgacgttc 1020

tactcgggga tgtatcgttc aatgatttcg ccgcaggatt acacgggaga gaatccattg 1080

tggaagagca gcgagcctta ctatgactcc ttctactgca tctgggattc gttccgcagc 1140

attcatccgc tactgacaat tgtcgacccg tacagccaaa cgcaaatgat tcgcgccttg 1200

attgacatct accgccacga agggaagctt ccagactgcc ggatgacgtt ctgcaagggc 1260

tggacgcagg gtggtagcaa cgccgacatc gtgcttgtgg acgcatatct aaagggcctt 1320

cacaaggacg ttgactggca tactggatac gaagccctga tttcggatgc cgaagatgag 1380

ccggcgaact gggggcttga gggacgtggt ggcttgacca gctggaagac gcttggatat 1440

attcccactg acgactttga tcccaacggt gttggcacat tctcgcgatc catttcccga 1500

<210> 4

<211> 900

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 黑曲霉基因同源片段后段1

<400> 4

taaggagtag tacttagttg agaactaatt cctccaatga cgaaagaccc ggcaaaagtg 60

cctcctgctt catgctcaat ttccccatgc gccataggta ttttgctctg ccacaggcac 120

gtctaagcag aagctaaatg cgccgcggga ttcgctctgt gtggagtatt gtttggcttg 180

tccacctgct gtatcgagag ttggccggaa tgagccagac ttgcagggcg atgaactgct 240

agactggtgt ctcactgaag aatgtaaaag ttgatctgat acatcttcca aatcagacat 300

acatcaacaa ggatgtactt gagaaagcca aagatcatac ttcactatga gtgagtttaa 360

aaaactacta tgcggtattg acgtaaacct ggatagtgca ggtaacgatg ccggtttacc 420

cacagctgca gggactggac gaggtactgt gtaacgtaat taccggggcg acccctggcc 480

aaactagtga actaaatcaa cttccccgaa tggtttttcc ctccccccag cttttcgtat 540

tctcccagtc tccaagacgg tcaagaccat ttccagctcg gtcactatta ttgattgcac 600

taggaatggt caaaggaagc ggggctccag acttgtccag cgtggaccaa ggacgctgtt 660

ccccatgttg cgctggtcca taggctagga ataatcctta ccccggtcaa aatggacctc 720

acctgaccct ccgacctctt ttgccaaccg atgtagagtt tgtgcatggc tctgccggcc 780

cgaatgcatc attgctcgag ctccttccag ctctccgaca gtgccttgct tgtctaattt 840

ccggctcctc cagggccggt cgactggttt gttccaccca gtctcccaat cgggacatcc 900

<210> 5

<211> 1020

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 黑曲霉基因同源片段前段2

<400> 5

caacgtcacc cgatatacat tgaccaccac catggcggtt cgacggtccg cccgcctgcg 60

cagccgccag gccaccgagg tgagcacacc acaccatccc actcagcctc cattccgatg 120

ggctgctcgc gcccttgcat gacattcact gactcgacct taaggagcct gaggcccctg 180

ccgaccccgt cgtcactgac aacaacgccc cctgcgacac gaacaatcac aacaactccg 240

agaacacgtc cgaaatcgat acaaccatgg ctcgtctcgg caaacagccg gagagattgc 300

ctcccgtcgt ggagcacgag gagccagctg atgctgctaa ggatgtcccc gtgcagcggt 360

cgcggaagaa gaccaagacc gagaccgcgt ctaagagaag gtccaaggtt gaagctaaag 420

agcctgttgc tgaggtgact ccggtgatcg ctgagtctca gtccaacacg gatacgactg 480

aacctgccgt tgctgagaca gaaaagaagc ctactcccaa ggctgtgcct gaacctgctg 540

ttgctgagac cgaaaagaac cctaccccca aggctctacc tgaaactgcc tccaagctat 600

cgactcctaa gaaatctatc ccaactctca agggcacacc tgtccacaga aacacgcccg 660

tccacagaag cactcccgtc cacaaaagca cacccaccag aaccccctcc agcaccctcg 720

tgcgcccgtc ccaccaagaa atgcacccca gcaaggtccg ccagagcacc accaagcagg 780

cagactccgg tttgatcctg ggcttcaagc ccatcaagaa ggacgccgaa ggcaaggtga 840

ttaaggacac tctcgccgac aacactccta ccaaagccaa ggcctcaccc gctccctatt 900

acggcacccc cgcgttcgaa tttaagtttt cctgcgaatc gcagctcagt gacgaggcca 960

agaagctcat ggagaccgtg cgcgaggatg ctgctaagat caaagcccag atgaccctgg 1020

<210> 6

<211> 1320

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 里氏木霉基因組片段2

<400> 6

ctactcaatc acgatattct cccctaacct tctcagaggc agtctcccaa ccaattcgtc 60

cagtctgcca caagccctca ccacatcctt tgcatcctcc ttgaaagcca tcctcatcct 120

ccccacccgc tcccacgtcc ctctactcgt cttttccaca accagaagca tcaccaaggc 180

ctcttcaaca aaccacaata cgctcatctg ctctcccttt ccgtgtttcg tgatgtactc 240

cttgatgctg cctatggcct cctcgccacc caggcacgct gtctcggtgc cgctcccgcg 300

actcatccgc acatcaacac tcagaccgct aaacagccag ccgtcagaat gcgtcttggc 360

cttgacgcgg tccaggacca gcggatcctg cacatgcagg gcgtatttgc cggggcggaa 420

ccgtggagga ccggcagcga cgatattgtc cccaaagtca tacactgtgg tgccatcggg 480

ggccagtact gccatctcag gcgagtatgt ccactgtatc gaagattgct cgtttctcgt 540

cagctgggtg gccgtcacgt agtggtggtt gaggatcttg cggccctttg tcctggactc 600

gggatcggcg gcgatagtga tggatgaaaa gagctctact gggccagacc agcctgccca 660

tgaccagctg ggcaggtgat tcctccttcg agcttgtgta ccgactttgt ggtgccagaa 720

gcaagtcgac aaggcaaaca agtgtctcgt ccttggtagt acaggtccct ccttatcgtc 780

ggtcggttga gcagccaggg gcgcccacat cgggattccc accagatcgc tgagcttccc 840

ccttccaagc gtgctctcca actccctcca tattcccaag cttgcgtcca gagaatcctc 900

gtctcgggtg aggctccggc tcgtgtactt tgtaatatgc tggtcgactt ctcggaagat 960

actcagtgtg ctcgcctcgc ttcgtttctg aggcagcttc ttccactgct cccagctgcc 1020

gtccatgtaa gacacgccgt tgaataatcc cggccgtacg aaatcgcaca gacgtctctc 1080

ctcggggtcg tgatagaatt caaagggtag gtctattgct tctgggcagg ccattccttc 1140

gcattcccag tacatctgct gttccgtaaa gacgaggcgt cgtcgcgaga ggagcccctc 1200

ctggtaggtc cagcctctag tgaaccacgt agagcgctct atcagcagtc gcggatcttg 1260

cagactcgaa accagggtga tgttcgacgt ggtgaatttg tactttggct gagcaggtcg 1320

<210> 7

<211> 781

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 黑曲霉基因同源片段后段2

<400> 7

ttcttgtgaa attgtaggcg ctgggatgca tccgatatgc aaggcgttca tgatttgatt 60

gtttgctgaa taaagagatt gagactgtat tatattcaat ttggtaacca gttagttgat 120

caaccatacg atgatgtatg cgataacact agttcagcag cttgttcttg tgttgatacg 180

cgggagtaga tttaaaagga agtttgtgat aacgttgcgt gcatttgagg cacttgggga 240

gcaacgtata acatacatcg catagatgat acaaagttac tgacacattc cacgcctgat 300

ggggtgggag ttattttagg aaggcagctt atctgacaga tgaaacaggt gatccaatgg 360

aatgcacctt cctctttcct cttgtctctt cctccatcat tgtcagagac ctccacatct 420

tcttcccttt cgatgtgcgt gtcagatacg ttgaccagca agccaccact atattatcga 480

gcacctttgg agatctttca gctcatctat gatgcttacg ttcgagtcga cgattcgttc 540

agcactaagc acgcaagtgc ctcaccatgt gatatgatta gttcgatcac ccgcgcagac 600

gcctaagagg tggggttcca tgcattgagc agatccctat ctttcagctc tgccaactca 660

gcagagaggg ctcttattga agaattggaa caaacctcca ccccagcctc ctgaaaaccg 720

actactacgc ttgctctgct tgtcacagct tgttgcattt taaatctttg gggtgatcct 780

t 781