本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及基因疫苗、基因治療所用質(zhì)粒的純化分離工藝，更具體地說，涉及規(guī)模化質(zhì)粒純化的聯(lián)合液相層析分離方法。技術(shù)背景質(zhì)粒(pDNA)核酸疫苗是正在開發(fā)的新型疫苗，具有誘導機體產(chǎn)生細胞免疫應答的優(yōu)點，對于治療目前沒有有效疫苗的慢性乙型肝炎、艾滋病、結(jié)核病、癌癥等需要誘導細胞免疫力的疾病具有良好應用前景，質(zhì)粒純化技術(shù)也從實驗室階段向?qū)嵱卯a(chǎn)業(yè)化階段發(fā)展。質(zhì)粒是大腸桿菌細胞內(nèi)能獨立于染色體進行復制和表達的環(huán)形DNA。工程質(zhì)粒是將大腸桿菌質(zhì)粒經(jīng)基因工程改造，在其中插入了編碼病原體保護性抗原蛋白的編碼基因，和/或優(yōu)選的免疫增強性細胞因子編碼基因等。將純化的工程質(zhì)粒注射入人體肌肉等部位，能在相關(guān)抗原加工處理細胞(AntigenPresentCell,APC)或肌肉細胞中表達所編碼的抗原,誘導機體產(chǎn)生體液和細胞免疫應答反應來抵御消滅病原體和癌細胞。迄今較好而實用的質(zhì)粒純化方法的發(fā)展主要有：1)采用Qiagen公司首先提出的硅膠吸附法質(zhì)粒提取試劑盒進行純化，該方法必須采用得自牛胰腺的牛RNAse酶和能專一結(jié)合內(nèi)毒素將其除去的化學試劑，主要用于實驗室研究的小量質(zhì)粒提取或獸用核酸疫苗的制備[1]；2)由美國通用(GE)公司(原安瑪西亞Amersham-Pharmarcia)創(chuàng)立并于2003-2005年逐步完善的顆粒介質(zhì)中壓液相多步(瓊脂糖凝膠過濾+疏水層析+陰離子交換)層析分離法；和3)近年由歐洲BIA公司(總部位于奧地利的BIASeparations公司)創(chuàng)立推出的氯化鈣沉淀+整體柱二步(陰離子交換+疏水層析)中壓液相層析分離法。后兩種方法不用牛RNAse酶和可能有毒的化學試劑，而細菌內(nèi)毒素基本上不結(jié)合這類介質(zhì)，可在多步層析分離過程中被逐步洗滌去除無須專門處理，從而適合于規(guī)?；幬锛壓怂嵋呙绲闹苽?，但這兩種方法各有自己的優(yōu)點和缺點，詳述于下。目前，液相層析分離介質(zhì)的基質(zhì)材料可分為二大類，一類是已運用多年的顆粒或多孔顆粒分散園球狀瓊脂糖基質(zhì)，如美國通用(GE)公司使用的，以及后續(xù)改進的理化穩(wěn)定性和剛性更強的高度交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)系統(tǒng)材料，它們具有更高的分離效率，更好的穩(wěn)定性和更快的流速；另一類是固定相整體柱(Monoliths)層析分離基質(zhì)系統(tǒng)CIM(ConvectiveInteractionMedia，對流性相互作用介質(zhì))材料。Monoliths為單一連續(xù)整體結(jié)構(gòu)，是以大量緊密相聯(lián)的均一孔徑(1.2-1.5微米)放射狀網(wǎng)絡通道(形同硬質(zhì)海棉塊)基質(zhì)(甲基丙烯酸縮水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)組成的園盤狀、園桶狀或管狀整體柱，通道壁骨架含有大量反應基團，可進行各種需要的化學修飾高密度地連接不同配基，通道孔高度互聯(lián)無盲端和死腔，流動相在其中可高速對流傳輸，分子動態(tài)結(jié)合能力(dynamicbindingcapacity,DBC)和分辨率受流速的影響很小，分離速度比多孔顆粒球形介質(zhì)的經(jīng)孔擴散滲透快10-20倍，其單一連續(xù)的整體結(jié)構(gòu)導致穩(wěn)定性極高和耐壓，可耐受2-10Mpa高壓，而顆粒介質(zhì)低于0.5Mpa。從而，可實現(xiàn)生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)等的低壓和高通量高效分離純化。與顆粒介質(zhì)柱相比，整體柱體積小，動態(tài)結(jié)合能力(載量)高，高流速高通量縮短了生產(chǎn)時間減少了超螺旋質(zhì)粒的變構(gòu)或降解，且攜帶使用方便，沒有顆粒介質(zhì)柱的裝填柱、測柱效、預防和排氣泡、拆柱再裝填等煩惱，操作人員更樂于使用。顆粒液相層析分離系統(tǒng)有：凝膠過濾(又稱分子篩)層析，陰陽離子交換層析，疏水層析和親和層析四大類介質(zhì)；Monoliths液相層析分離系統(tǒng)沒有凝膠過濾而有其他三類層析分離介質(zhì)。此二系統(tǒng)均已成功地建立了自身體系的質(zhì)粒純化方法，并且在繼續(xù)研發(fā)新的氨基酸-DNA親和介質(zhì)改進提高開環(huán)與超螺旋質(zhì)粒的分離效果。目前從培養(yǎng)的工程菌制備pDNA時，第一步普遍采用堿裂解法裂解含pDNA的大腸桿菌。此法可使大腸桿菌碎片、細菌的幾乎全部基因組gDNA和細胞壁、絕大部分細菌蛋白質(zhì)、脂類、多糖等形成大塊凝聚物，通過離心或過濾而除去，遺留在裂解上清液中的主要成分為細菌自身的RNA，內(nèi)毒素及少量細菌蛋白質(zhì)和pDNA。其中與分子量較大的均一pDNA相比，細菌RNA是分子量較小而大小不均一的混合物，在凝膠電泳中呈現(xiàn)為位于pDNA單一致密條帶下方的云霧狀彌散帶，但其含量比pDNA高8-12倍，是純化pDNA時要去除的主要雜質(zhì)。BIA公司當前推薦的正式pDNA純化方法包括以下基本步驟[2,3]：1)第一步：用堿裂解法裂解含質(zhì)粒的大腸桿菌，在裂解上清液中加入終濃度0.5-1.0M的氯化鈣(CaCl2)，通過Ca++離子結(jié)合大部分RNA形成沉淀而離心去除，然后取上清液用德國產(chǎn)SartobrainP0.45/0.22μm囊式過濾器過濾又去除一部分Ca++離子結(jié)合的RNA，同時除去伴隨的內(nèi)毒素；2)第二步：向澄清裂解液加入數(shù)倍TE(10-50mMTris-HCl+10mMEDTA,pH7.2)液或純凈水使其電導率降至35-40ms/cm，然后不濃縮直接加載(上樣)到CIMDEAE弱陰離子交換柱上，pDNA和剩余的RNA均結(jié)合于柱內(nèi)孔道壁的配基，用0.6MNaCl-TE液洗滌除去結(jié)合不牢固的RNA，再用1.0MNaCl-TE液洗脫得到pDNA組分。此二步主要作用是去除RNA和收集pDNA組分；3)第三步：在收集的pDNA組分中加入終濃度3.0M的硫酸銨混合溶解均勻，加載(上樣)到CIMC4(丁基)疏水層析分離柱使質(zhì)粒吸附，然后用1.7M硫酸銨-TE液洗滌除去開環(huán)(oc)質(zhì)粒和殘留的內(nèi)毒素等所有其他雜質(zhì)，再用0.4M硫酸銨-TE液洗脫得到純化的超螺旋(sc)質(zhì)粒組分，其純度的各項指標，包括細菌gDNA\RNA\內(nèi)毒素等均可達到GMP(生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)的要求；將該純化組分用常規(guī)法脫鹽、濃縮、過濾除菌得到最終的藥物級質(zhì)粒。本發(fā)明人在采用BIA推薦的正式方法純化質(zhì)粒的數(shù)十次實驗中，對裂解液沉淀所用的氯化鈣濃度，兩個整體柱的洗滌、洗脫液濃度等對純化質(zhì)粒的質(zhì)和量的影響進行了仔細研究，發(fā)現(xiàn)：1)裂解液中加入CaCl2結(jié)合RNA形成的沉淀顆粒有大有小，大的可離心除去，小的需通過0.45/0.22μm囊式過濾器過濾才能除去，因此對所用過濾器的質(zhì)量要求高，否則這些小顆?？赡芏氯w中的孔道減少其使用壽命。2)CaCl2沉淀去除RNA不完全，而且會同時去除相當部分的質(zhì)粒，嚴重減少其回收。3)BIA方法依仗其整體柱的高通量高流速對裂解澄清液不濃縮，還因含0.5-1.0MCaCl2而需要加數(shù)倍體積的TE液稀釋降低電導率，從而使CIMDEAE柱的上樣體積大大增加而未能縮短加工時間；并且質(zhì)粒依靠所帶電荷或疏水基團與介質(zhì)配體的結(jié)合在高速水流(如8ml整體柱允許的最高流速為100ml/min)的沖擊下不夠牢固而可能部分丟失。4)CIMDEAE弱陰離子交換柱標示的核酸載量為6-8mg/ml(8ml柱48-64mg)，由于CaCl2處理過的裂解液仍含有不少RNA，它們競爭占據(jù)柱中的結(jié)合位點而減少了pDNA的結(jié)合和回收，即該柱不能滿載回收pDNA。本發(fā)明人用8mlCIMDEAE柱進行了多次實驗，其pDNA回收大都為16-18mg僅為其載量的1/3，未能充分發(fā)揮CIMDEAE柱的載量優(yōu)勢。5)采用高靈敏HPLC分析用上述BIA推薦的二步層析分離方法獲得的最終純化質(zhì)粒，仍含有微量的細菌RNA。因此需要對BIA推薦的質(zhì)粒純化方法進行改進，本發(fā)明人通過大量實踐研究從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明目的是提供一種在超濾濃縮細菌裂解液大大減少處理量后聯(lián)合應用顆粒基質(zhì)層析柱與整體層析柱的規(guī)?；|(zhì)粒純化方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種用于藥物級核酸pDNA疫苗規(guī)?；苽涞馁|(zhì)粒純化方法，該方法聯(lián)合應用顆粒介質(zhì)液相分離系統(tǒng)與整體柱液相層析分離系統(tǒng)，包括以下步驟：1)對宿主大腸桿菌的堿裂解液進行超濾濃縮，2)在中壓液相層析分離裝置中，將濃縮裂解液加載到顆粒介質(zhì)凝膠過濾柱進行層析分離，收集第一峰質(zhì)粒組分，去除后續(xù)的RNA大峰；3)將所得質(zhì)粒組分加載到CIMC4疏水整體柱或氨基酸-DNA親和整體柱進行層析分離，洗滌去除主要雜質(zhì)，洗脫收集超螺旋質(zhì)粒組分；4)將所得超螺旋質(zhì)粒組分加載到CIMDEAE離子交換整體柱進行層析分離，洗滌去除殘留雜質(zhì)，洗脫收集得到純化的超螺旋質(zhì)粒組分。本發(fā)明方法中，第1)步的超濾濃縮可采用截留分子量100kD-500kD的常規(guī)超濾裝置，將細菌堿裂解液濃縮5-10倍，較佳為濃縮過程中通過滲濾洗濾濃縮8-10倍。所述常規(guī)超濾裝置選自PES(聚醚砜)或改性PES材質(zhì)制成的切向流中空纖維超濾裝置。本發(fā)明方法中，第2)步采用的顆粒介質(zhì)凝膠是高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠介質(zhì)，凝膠柱的平衡和洗滌液為TE液，加載的濃縮裂解液體積為柱體積的10-35％。本發(fā)明方法中，第3)步和第4)步先分別測定所加載質(zhì)粒組分液體中的質(zhì)粒含量，根據(jù)CIMC4疏水整體柱或氨基酸-DNA親和整體柱和CIMDEAE離子交換整體柱的核酸總載量，分別計算出所加載的上一步質(zhì)粒組分液的體積，再將該體積的質(zhì)粒組分液加載相對應整體柱進行層析分離去除雜質(zhì)。具體地說，這兩步中所加載的上一步所得質(zhì)粒組分液的體積略高于按各柱核酸總載量計算出的體積。較佳的是，第3)步先在所得質(zhì)粒組分中加入固體或高濃度硫酸銨溶解至硫酸銨終濃度2.5-3.0M，再加載到2.5-3.0M硫酸銨-TE液平衡的CIMC4疏水整體柱或氨基酸-DNA親和整體柱，采用相對中濃度的硫酸銨-TE液洗滌去除雜質(zhì)，采用相對低濃度的硫酸銨-TE液洗脫收集超螺旋質(zhì)粒組分。更佳的是，第3)步采用CIMC4柱時，先在所得質(zhì)粒組分中加入固體或高濃度硫酸銨液溶解成2.5-3.0M硫酸銨濃度后再加載到已用該濃度硫酸銨-TE液平衡的CIMC4疏水整體柱上，采用1.5-1.7M硫酸銨-TE液洗滌去除雜質(zhì)，采用0.2-0.4M硫酸銨-TE液洗脫收集超螺旋質(zhì)粒組分；采用氨基酸-DNA親和整體柱時，按照出品該整體柱公司提供的資料制備平衡、洗滌和洗脫液后，平衡該柱,洗滌除去oc質(zhì)粒，洗脫收集sc質(zhì)粒組分。較佳的是，第4)步中，將第3)步收集的sc質(zhì)粒組分液用純凈水或TE液稀釋后，加載TE液平衡的CIMDEAE離子交換整體柱，采用低濃度NaCl-TE液洗滌去除所有殘留雜質(zhì)，采用中濃度NaCl-TE液洗脫收集得到純化的超螺旋質(zhì)粒組分。更佳的是，第4)步采用0.5-0.6MNaCl-TE液洗滌去除所有殘留雜質(zhì)，采用0.8-1.0MNaCl-TE液洗脫收集得到純化的超螺旋質(zhì)粒組分。在第3)步中，除去的主要雜質(zhì)包括開環(huán)質(zhì)粒和內(nèi)毒素；第4)步中，去除的殘留雜質(zhì)包括所有殘留雜質(zhì)。本發(fā)明方法中，所有裝置(包括超濾濃縮裝置、顆粒介質(zhì)凝膠過濾柱、CIMC4疏水整體柱、氨基酸-DNA親和整體柱和CIMDEAE離子交換整體柱)分別連續(xù)使用2-3次，然后經(jīng)“清潔”和“再生”處理后重新使用。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是提供一種用于藥物級核酸pDNA疫苗規(guī)?；苽涞穆?lián)合中壓液相層析分離方法，在用堿裂解法裂解含質(zhì)粒的大腸桿菌收集澄清裂解液后，包括以下步驟：第一步采用載留分子量100kD-500kD的超濾裝置快速濃縮大腸桿菌堿裂解澄清液，所述超濾裝置優(yōu)選PES(聚醚砜)或改性PES材質(zhì)做的切向流中空纖維超濾濃縮裝置，并在超濾時加入純凈水或TE液滲濾，降低裂解液的鹽濃度，將裂解液濃縮5-10倍，優(yōu)選濃縮過程中通過滲濾洗濾濃縮8-10倍，以大大減少下一步所用的層析分離柱體積和操作時間；然后，在中壓液相層析分離裝置，如BIO-RAD公司的NGC系統(tǒng)、GEHealthcareLifeScience公司的Akta系統(tǒng)或其他簡易中壓液相層析分離裝置上，進行下述第二、第三和第四步：第二步采用高度交聯(lián)瓊脂糖凝膠顆粒層析分離柱，例如Bestrose6FF凝膠柱，將10-35％柱體積的濃縮裂解液加載到已用TE液平衡的該柱上進行層析分離，以TE液洗滌，收集洗滌下來的第一峰pDNA組分，丟棄第二大峰細菌RNA和其他雜質(zhì)，繼以TE液平衡此柱；如此連續(xù)重復進行第二、第三次濃縮裂解液層析分離，合并各次的pDNA組分；然后對該柱進行清潔和再生處理后，可重新用于下一輪層析分離。第三步采用Monoliths整體結(jié)構(gòu)的CIMC4層析柱或氨基酸-DNA親和整體柱，將固體硫酸銨或4.0M硫酸銨液加入第二步得到的質(zhì)粒pDNA組分液中均勻溶解至硫酸銨終濃度2.5-3.0M，然后將計算出所加載的上一步質(zhì)粒組分液的體積加載到已用2.5-3.0M硫酸銨-TE液平衡的CIMC4柱上進行高通量快速液相層析分離，加載完畢繼續(xù)以1.5-1.7M硫酸銨-TE液洗滌除去開環(huán)(oc)質(zhì)粒，再以0.2-0.4M硫酸銨-TE液洗脫并收集超螺旋(sc)質(zhì)粒組分；然后用TE液洗滌，繼以2.5-3.0M硫酸銨-TE液平衡；如此對第二步得到的質(zhì)粒pDNA組分液連續(xù)進行第二、第三次層析分離，合并各次的超螺旋質(zhì)粒組分；采用氨基酸-DNA親和整體柱時，按照出品該整體柱公司提供的資料制備平衡、洗滌和洗脫液后，平衡該柱,洗滌除去oc質(zhì)粒，洗脫收集sc質(zhì)粒組分并合并；然后對該柱進行清潔和再生處理后，可重新用于下一輪層析分離。第四步采用Monoliths整體結(jié)構(gòu)的CIMDEAE層析柱，在第三步得到的sc質(zhì)粒組分合并液中加入純凈水或TE液稀釋使其電導率降至38-40ms/cm，取計算出所加載的上一步質(zhì)粒組分液的體積加載到已用TE液平衡的CIMDEAE層析柱上，進行高通量快速液相層析分離，用0.5-0.6MNaCl-TE液洗滌除去所有殘存雜質(zhì)后，再用0.8-1.0MNaCl-TE液洗脫并收集超螺旋(sc)質(zhì)粒組分；然后以TE液洗滌并平衡后可對第三步得到的sc質(zhì)粒組分液連續(xù)重復進行第二、第三次層析分離，合并已純化的各次超螺旋質(zhì)粒組分；然后對該柱進行清潔和再生處理后，可重新用于下一輪層析分離。此后是常規(guī)程序，將第四步得到的已純化的超螺旋(sc)質(zhì)粒組分液合并，用常規(guī)超濾濃縮器材和方法，優(yōu)選合格的切向流中空纖維超濾濃縮裝置對其進行洗濾脫鹽、更換液體并濃縮至所需濃度。這最后一步處理的是已高度純化的質(zhì)粒，對處理用的儀器、管道、用水、容器、環(huán)境等清潔凈化的GMP要求非常嚴格，應避免再帶入內(nèi)毒素造成污染。BIA公司推薦方法是先用CIMDEAE柱后用CIMC4柱。本發(fā)明先用CIMC4柱或?qū)砩鲜械男滦桶被?DNA親和整體柱，后用CIMDEAE柱，這樣所得純化的超螺旋質(zhì)粒液含0.8-1.0MNaCl，對其除用超濾法脫鹽并濃縮外，也可采用常規(guī)酒精或異丙醇沉淀質(zhì)粒，高速離心后收集無鹽的沉淀質(zhì)粒組分，用生理鹽水或適當緩沖液復溶至所需濃度。便于生產(chǎn)廠家根據(jù)自己的設(shè)備條件進行選擇。經(jīng)脫鹽更換液體并濃縮至所需濃度后，再按GMP要求常規(guī)過濾除菌、分裝、(或冷凍干燥)制成純化質(zhì)粒產(chǎn)品。正式生產(chǎn)時，上述各步驟應在GMP設(shè)施中一切按照國家的GMP要求進行，這是現(xiàn)代生物制藥業(yè)技術(shù)人員熟知的共識和基本要求，在此不作贅述。術(shù)語細菌“濕重”指離心收集培養(yǎng)的大腸桿菌，倒盡離心罐中的液體后，對罐底沉淀的含少許水份的(濕)細菌秤取的重量。術(shù)語“濃縮x倍”指通過超濾減少溶液保留溶質(zhì)使溶液的體積縮小到原先的幾分之一，如原先的五分之一即為濃縮了五倍，原先的十分之一即為濃縮了十倍，優(yōu)選濃縮8-10倍。術(shù)語“滲濾”指裂解液濃縮過程中，當濃縮到原始體積的約1/5或1/6時，在該初步濃縮液中加入大約等體積的純凈水或TE液再繼續(xù)濃縮，可滲透去除一些鹽份和小分子RNA，如此2-3次。“洗濾”指滲濾濃縮后從進水管注入一些純凈水，將中空纖維小管壁上貼附的質(zhì)粒沖洗下來增加回收，如此2-3次。最后濃縮8-10倍?！爸袎阂合鄬游鲅b置”是一種現(xiàn)代高科技生物制藥用裝置，其結(jié)構(gòu)包括計算機控制的水泵、管路、接頭、閥門；和壓力、流速、紫外及電導檢測器及熒光顯示屏等等。將層析柱連接入該裝置管路后，通過水泵灌注各種液體，熒光屏可實時以連續(xù)曲線和數(shù)字方式顯示流經(jīng)管道出口處液體的壓力、流速、體積、紫外吸收度和電導等數(shù)據(jù)，當核酸或蛋白質(zhì)流出時，顯現(xiàn)紫外吸收峰，可在出口處收集紫外峰包括的液體體積。術(shù)語“凝膠過濾”和“分子篩”二者含意相同，指層析分離時，所用介質(zhì)顆粒不會結(jié)合液體中的任何成分，這些成分只是依據(jù)其分子量，先大分子后小分子依次流出而分離。“氨基酸-DNA親和整體柱”是歐洲(葡萄牙和斯洛文尼亞)科研人員近年正在研發(fā)的已在國際雜志上公開發(fā)表的新型整體柱，其分離oc與sc質(zhì)粒的效率比C4整體柱更好。這類整體柱的通道壁骨架分別連接了組氨酸、精氨酸、賴氨酸、辛胺，或羰基二咪唑(CDI)等配基，兼有疏水作用+離子交換+親和多種功能，可發(fā)揮不同程度的選擇性，其核酸動態(tài)結(jié)合載量可高達5-11mg/ml。科研人員初步研究了他們各自的層析分離條件。例如，對L-組氨酸配基或1-芐基-L-組氨酸配基整體柱，可用1.3MNaCl-檸檬酸(或乙酸)緩沖液pH5.0平衡和1.7MNaCl-(50mM)檸檬酸緩沖液pH5.0洗滌去除oc質(zhì)粒，以2.08NaCl-檸檬酸緩沖液pH5.0洗脫得到sc質(zhì)粒，再以3.0MNaCl-檸檬酸緩沖液pH5.0洗滌除去RNA(離子交換條件)；也可用2.9或2.0M硫酸銨-TEpH8.0液平衡和洗滌去除oc質(zhì)粒，以1.32M硫酸銨-TE液pH8.0洗脫得到sc質(zhì)粒，再以1.29MNaCl-TE液pH8.0洗滌去除RNA(疏水條件)[4,5]。對于精氨酸配基整體柱，可用0.56MNaCl-TE液pH8.0平衡和洗滌除去oc質(zhì)粒，以2MNaCl-TEpH8.0洗脫得到sc質(zhì)粒[6]。預計經(jīng)過進一步改進后，在不久的將來就會在市場上正式推出這類整體柱產(chǎn)品和相應的優(yōu)選層析分離條件。術(shù)語“加載”，“上樣”和“上柱”含意相同，指在液相層析時，將準備好的液體(也稱為樣品液)加入層析柱中，進行層析分離其中諸成分。術(shù)語“洗滌”或“洗去”指離子交換、疏水及親和層析分離時，灌注的液體使弱貼附或弱結(jié)合于層析柱介質(zhì)(配基)的雜質(zhì)成分洗下而去除；術(shù)語“洗脫”指灌注的液體使結(jié)合于層析柱介質(zhì)(配基)的所需成分，如質(zhì)粒脫離而流出收集之。術(shù)語“高通量”和“高流速”二者含意基本相同，指層析分離時單位時間內(nèi)灌注進出層析柱的液體量大流速快，從而縮短加工時間減少超螺旋質(zhì)粒的變構(gòu)變性。整體離子交換層析柱、疏水層析柱或氨基酸-DNA親和柱的“核酸載量”或“動態(tài)載量”指生產(chǎn)廠家標示的該柱介質(zhì)在液體流動狀態(tài)下所能結(jié)合的最大核酸(包括RNA和DNA)量，包括每ml介質(zhì)能結(jié)合的核酸mg量，和該柱所能結(jié)合的核酸總量(總載量)。本發(fā)明第3)步和第4)步中所述的“計算出所加載的上一步質(zhì)粒組分液的體積”指對上一步準備好的樣品液測定其質(zhì)粒濃度后，以略高于BIA公司CIM各種層析柱產(chǎn)品所標示的核酸總載量，計算出要加入此柱的各樣品液的體積。例如，樣品液質(zhì)粒含量80μg/ml，某柱的標示總載量為64mg，可加載820-850ml(含65.6-68mg質(zhì)粒)的該樣品液。本發(fā)明第3)步和第4)步中所述的“相對中濃度”、“相對低濃度”、“中濃度”和“低濃度”是相對于“2.5-3.0M的高濃度”而言，即低于2.5-3.0M濃度或更低，如1.2-2.0M為中濃度；0.2-0.8M為低濃度等。術(shù)語“清潔”指中空纖維超濾濃縮裝置、6FF凝膠柱、CIM各種整體柱連續(xù)使用2-3次后，必須分別以3-5倍或10-20倍柱體積(CV)的0.5-1.0MNaOH液洗滌清除殘留的內(nèi)毒素等雜質(zhì)，再以純凈水或TE液洗去NaOH液，稱為“清潔”。每輪分離采用清潔后的裝置和層析柱，方能保證最終純化的質(zhì)粒液內(nèi)毒素水平低于10EU/mg，否則將受前次用后殘留的內(nèi)毒素污染而超過此標準。以相應的平衡液平衡層析柱后，使其能接受下一次或下一輪層析的樣品液稱為“再生”此層析柱。附圖的簡單說明圖1顯示20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml濃度的純化HG85abA質(zhì)粒液和兩個裂解液樣品的層析峰圖，及峰高與濃度的標準曲線。圖2為BIA氯化鈣沉淀法CIMDEAE層析步驟用0.7MNaCl洗脫HG85abA質(zhì)粒組分的HPLC分析。圖3為本發(fā)明方法CIMC4層析步驟所得HG85abA質(zhì)粒組分的HPLC分析。圖4為本發(fā)明方法含HG85abA質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌濃縮澄清裂解液經(jīng)6FF凝膠柱液相層析分離圖。圖5為本發(fā)明方法含SVK-CAVA質(zhì)粒的XL10-gold大腸桿菌濃縮澄清裂解液經(jīng)6FF凝膠柱液相層析分離圖。圖中細線為緩沖液的電導線，粗線是紫外吸收線，以下同此。圖6為氯化鈣(終濃度0.2M)沉淀后含SVK-CAVA質(zhì)粒的XL10-gold大腸桿菌濃縮澄清裂解液經(jīng)6FF凝膠柱液相層析分離圖。圖7為氯化鈣(終濃度0.4M)沉淀后含SVK-CAVA質(zhì)粒的XL10-gold大腸桿菌濃縮澄清裂解液經(jīng)6FF凝膠柱液相層析分離圖。圖8為BIA法用0.5-1.0M不連續(xù)NaCl梯度液洗脫CIMDEAE結(jié)合組分的層析分離圖。圖9為說明圖8洗滌去除RNA組分和收集洗脫質(zhì)粒DNA組分的示意圖。圖10為BIA法CIMC4液相層析步驟采用不連續(xù)遞減濃度硫酸銨梯級液洗滌或洗脫的層析分離圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例與附圖和表格，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將屬于本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。主要實驗裝置和材料BIO-RAD公司的NGC中壓液相層析分離裝置GELifeScience公司的NanoVuePlus超微量核酸測定儀Agilent(安捷倫)Technologies公司的1260HPLC高效液相色譜儀用含抗結(jié)核桿菌治療基因的HG85abA質(zhì)粒(4.4kb)轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌的發(fā)酵罐培養(yǎng)物(菌),該質(zhì)粒衍生自Invitrogen公司的pVAX1原始質(zhì)粒[7]。用含廣譜抗腫瘤治療基因的SVK-CAVA質(zhì)粒(15kb)轉(zhuǎn)化XL10-gold大腸桿菌的發(fā)酵罐培養(yǎng)物(菌)[8,9,10]。分析純Tris、EDTA、NaOH、乙酸鉀(KAC)、氯化鈣(CaCl2)、NaCl、硫酸銨、濃HC1等化學制劑購自中國醫(yī)藥集團化學試劑公司。實施例1：堿裂解法裂解細菌和中空纖維超濾濃縮的基本方法用純凈水配制以下三種液體：P1液：50mMTris-HC1+10mMEDTA,pH8.0；P2液：0.2MNaOH+1％SDS；P3液：3MKAC用冰乙酸調(diào)節(jié)至pH5.5。離心沉降收集發(fā)酵罐培養(yǎng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，稱濕重。在刻度大玻璃或塑料瓶中按每克菌加入P1液10ml均勻重懸細菌，繼加入P2液20ml快速攪拌8-10秒鐘裂解細菌，靜置6-8分鐘呈淡黃色膠狀液，移至冰浴中加入經(jīng)4-10℃預冷的P3液15ml(每克濕重菌也可采用P1：P2：P3＝15ml：15ml：15ml比例)攪拌8-10秒鐘靜置20分鐘，出現(xiàn)漂浮的大塊黃白色凝聚物(如采用BIA的氯化鈣法，觀看刻度所示裂解液體積，據(jù)此計算出終濃度0.5-1.0M所需氯化鈣用量，稱取該量的固體氯化鈣邊攪拌邊逐步加入裂解液中溶解；靜置30分鐘左右)。將裂解液全部移入離心罐內(nèi)5000-10000rpm離心20-30分鐘，棄沉淀取上層清液用國產(chǎn)0.45μm囊式過濾器或德國產(chǎn)SartobrainP0.45/0.22μm囊式過濾器過濾后測量體積。用載留分子量100kD或300kD的中空纖維(材質(zhì)為PVDF或PES)超濾濃縮裝置(上海藍景膜工程技術(shù)公司專制)超濾，濃縮縮小體積5-10倍，優(yōu)選通過滲濾洗濾濃縮8-10倍。得到的全部濃縮裂解液再經(jīng)0.45μm濾器過濾澄清才能上層析柱，這是各種液相層析分離法對上柱液的普遍要求。實施例2：測定各步驟諸組分的pDNA含量和分析核酸各組分比例的方法(1)用小6FF柱檢測裂解液和濃縮裂解液中質(zhì)粒含量的方法采用博格隆公司的4.4mlBestrose6FF小柱和配制1.0MKAC液a)制作質(zhì)粒濃度標準曲線取事先純化的質(zhì)粒液用GE公司的NanoVuePlus超微量核酸測定儀測定準確濃度后，用1.0MKAC液制作20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml濃度的系列稀釋液各1.2ml。在BioRadNGC中壓層析儀上用1.0MKAC液平衡6FF小柱至基線；取上述一份稀釋液1.0ml上樣，流速1.0ml/min，電腦屏上出現(xiàn)峰后隔4-5分鐘再上樣第二份稀釋液；5個濃度液體全部跑完出峰后，電腦屏幕上顯示各自對應的峰高與面積，用儀器內(nèi)的相應軟件制作峰高(或峰面積)與對應質(zhì)粒濃度的標準曲線。b)測樣品中的質(zhì)粒含量：用1.0MKAC液平衡6FF柱后，取裂解液樣品1.0ml上樣，流速1.0ml/min；如果預計其質(zhì)粒含量較高(如濃縮裂解液)，可先用1.0MKAC液作適當稀釋。裂解液產(chǎn)生兩個相連的峰，前面的較小峰為質(zhì)粒峰，根據(jù)其峰高或峰面積，查標準曲線得出質(zhì)粒的濃度。每種質(zhì)粒需制作自身的標準曲線。圖1A為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml濃度的純化HG85abA質(zhì)粒液和兩個裂解液樣品的層析峰圖；圖1B為峰高與濃度的標準曲線。(2)測定第二、三、四步各組分核酸含量的方法采用NanoVuePlus超微量核酸測定儀，開通電源→選擇LifeScience→選擇測定DNA→選擇稀釋系數(shù)1.000→在樣品檢測點滴加3μl純凈水→按下100％T鍵調(diào)零→再滴加3μl樣品用的同一緩沖液，按下100％T鍵調(diào)零→在樣品檢測點滴加3μl樣品液，按下100％T鍵屏幕顯示核酸濃度μg/ml和260/280nm比值(1.75-1.85為質(zhì)粒純度合格)。此法適合不含或含很少RNA的第二、三、四步組分的質(zhì)粒(DNA)含量測定。(3)用HPLC分析樣品中核酸組分的組成比例采用Agilent(安捷傖)Technologies公司1260高效液相色譜(HPLC)儀和日本TOSOH公司的TSKgelDNA-NPR分析柱(W00039)(4.6mmIDx7.5cm,2.5μm)，流速0.5ml/min，上樣體積20μl，流動相A：20mMTris-HCL(pH＝9)，流動相B：20mMTris-HC1+1MNaCl(pH＝9)，檢測波長260mm，所有檢測液預先經(jīng)過0.45μm濾膜過濾后上分析柱。圖2是BIA氯化鈣沉淀法CIMDEAE層析步驟用0.7MNaCl洗脫HG85abA質(zhì)粒組分的HPLC分析圖。圖中，保留時間5.5min左右的峰為溶液電解質(zhì)峰，9.5min左右的峰為RNA峰，16min左右的峰為OC質(zhì)粒峰，17min左右的峰為SC質(zhì)粒峰。該圖顯示0.7MNaCl洗脫質(zhì)粒組分含有少量RNA，大部分為pDNA(oc+sc質(zhì)粒)。圖3是本發(fā)明方法CIMC4層析步驟所得HG85abA質(zhì)粒組分的HPLC分析圖，該圖顯示本發(fā)明方法CIMC4層析步驟所得質(zhì)粒組分幾乎沒有RNA，全部都是pDNA，其中oc質(zhì)粒峰很小，比例低于5％。實施例3：裂解液通過凝膠過濾液相層析分離pDNA組分去除RNA的基本方法在BIO-RAD公司的NGC中壓液相層析分離裝置上，采用博格隆(上海)生物技術(shù)公司的1升或0.5升Bestrose6FF凝膠柱，以TE(10-50mMTris-HC1+10mMEDTA,pH7.2)液平衡后，加載中空纖維超濾濃縮后經(jīng)0.45μm濾器過濾的澄清裂解液。加載量經(jīng)預實驗確定。上樣完畢繼續(xù)用TE洗滌，收集先下來的大分子第一峰即為pDNA組分，然后下來的RNA大峰丟棄之，二者的峰面積比通常為1：8-12之間。繼以TE液洗滌至電腦屏上出現(xiàn)平直基線后，再進行第二、第三次上樣分離收集pDNA組分。然后需用3CV(柱體積)的0.5MNaOH液清潔(主要目的是去除殘留的內(nèi)毒素)該柱，用潔凈水洗盡NaOH以TE液平衡后再用，或灌入20％酒精保存。所述預實驗目的是確定能使pDNA第一峰與后續(xù)RNA大峰明顯分開的最大上樣量，視宿主大腸桿菌和質(zhì)粒種類不同而不同，通常為10％-35％柱體積。經(jīng)預實驗確定，DH5α大腸桿菌培養(yǎng)的含4.4kbHG85abA質(zhì)粒細菌裂解液上樣量為柱體積(CV)的30-35％(見圖4)；XL10-gold大腸桿菌培養(yǎng)的含15kbSVK-CAVA質(zhì)粒細菌裂解液上樣量為柱體積的10-15％(見圖5、6、7)。圖4為本發(fā)明方法含HG85abA質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌濃縮澄清裂解液(上樣體積為柱體積的35％)經(jīng)6FF凝膠柱液相層析的分離圖，顯示前面的pDNA峰與后面的RNA大峰明顯分開，可分別收集或丟棄。圖5為本發(fā)明方法含SVK-CAVA質(zhì)粒的XL10-gold大腸桿菌濃縮澄清裂解液(上樣體積為柱體積的20％)經(jīng)6FF凝膠柱液相層析的分離圖，顯示前面的pDNA峰與后面的RNA大峰融合，表明上樣液體積過多二峰不能分開。圖6為氯化鈣(終濃度0.2M)沉淀后含SVK-CAVA質(zhì)粒的XL10-gold大腸桿菌濃縮澄清裂解液(上樣體積為柱體積的12％)經(jīng)6FF凝膠柱液相層析的分離圖，顯示前面的pDNA峰與后面的RNA大峰(比圖5不用氯化鈣沉淀的RNA大峰小許多)分開，表明上樣液體積適當。圖7為氯化鈣(終濃度0.4M)沉淀后含SVK-CAVA質(zhì)粒的XL10-gold大腸桿菌濃縮澄清裂解液(上樣體積為柱體積的12％)經(jīng)6FF凝膠柱液相層析的分離圖，顯示前面的pDNA峰與后面的RNA大峰分開，表明上樣液體積適當。與圖6相比RNA峰更小，表明采用更高濃度氯化鈣沉淀去除了更多的細菌RNA，但RNA峰后退不明顯，提示上樣液體積不能增加過多(也許可以增加到15％)。以含SVK-CAVA質(zhì)粒的XL10-gold大腸桿菌裂解液為例，用6FF凝膠過濾層析分析BIA法裂解液加氯化鈣沉淀去除RNA的效果，比較了分離的pDNA：RNA峰面積，不加氯化鈣為1：11.3，加終濃度0.2M氯化鈣為1：6.9，加終濃度0.4M氯化鈣為1：3.74，加終濃度1.0M氯化鈣為1：1.5。表明BIA法氯化鈣沉淀去除RNA不夠滿意。本發(fā)明方法第一第二步質(zhì)?；厥章蕦嵗喝GAg85abA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌45.5克經(jīng)堿裂解后得到2430ml澄清裂解液。用小6FF柱測得其中質(zhì)粒含量36μg/ml總量87.5mg。經(jīng)中空纖維超濾濃縮至550ml,質(zhì)粒含量140μg/ml總量77mg。此步質(zhì)粒回收率88％。通過1L體積Bestore6FF柱液相層析分離二次，收集含質(zhì)粒的第一峰合并約800ml，質(zhì)粒含量87μg/ml總量69.6mg，此步質(zhì)?；厥章?0.4％?；厥盏馁|(zhì)粒組分經(jīng)凝膠電泳成像檢測沒有RNA條帶。實施例4：BIA法中裂解液加入不同濃度氯化鈣對pDNA回收的質(zhì)和量的影響(1)分析BIA法裂解液中加入不同濃度氯化鈣對pDNA回收量的影響每次取含HG85abA質(zhì)粒(4.4kb)的DH5α大腸桿菌，或含SVK-CAVA質(zhì)粒(15kb)的XL10-gold大腸桿菌同批培養(yǎng)菌各20克，按實施例1方法裂解，將DH5α菌裂解液不加或加0.9M氯化鈣處理，濃縮后加載6FF凝膠柱過濾；XL10-gold菌裂解液不加或加不同濃度氯化鈣處理，濃縮后或加載6FF凝膠柱過濾，或直接加載CIMDEAE柱進行液相層析分離，收集各自質(zhì)粒組分用NanoVuePlus超微量核酸測定儀測定其質(zhì)粒濃度(μg/ml)，乘以體積計算出質(zhì)?？偟昧?，并用HPLC分析部分樣品中的RNA比例，表1列舉幾次實驗的結(jié)果：表1從表1可見，裂解液中加氯化鈣可造成相當部分的質(zhì)粒同時被沉淀而損失，加氯化鈣越多質(zhì)粒損失越大，0.9-1.0M終濃度的氯化鈣可導致50-65％的質(zhì)粒損失。(2)分析BIA法裂解液中加不同濃度氯化鈣對CIMDEAE步驟所得質(zhì)粒組分純度的影響取含HG85abA質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌20克一式多份，按實施例1方法分別裂解并在裂解液中加入不同終濃度的氯化鈣，將所得裂解液濃縮后分別上CIMDEAE柱，用0.52MNaCl液洗滌去除吸附的大部分RNA后，用1.0MNaCl液洗脫收集質(zhì)粒組分，取各質(zhì)粒組分樣品作HPLC分析，結(jié)果見表2。表2裂解液中加入的氯化鈣終濃度(M)0.520.60.70.80.91.0質(zhì)粒組分中的RNA比例(％)11.4813.4611.853.942.112.34質(zhì)粒組分中的oc+scpDNA比例(％)88.5286.5488.1596.0697.8997.66可見BIA法在裂解液中加氯化鈣雖可去除大部分RNA，再經(jīng)CIMDEAE層析步驟中的0.5MNaCl液洗滌又去除了一些RNA，但遺留結(jié)合于柱上的RNA仍不少，它們與質(zhì)粒一起被1.0MNaCl液洗脫。裂解液中加入的氯化鈣濃度越高(0,8-1.0M)，CIMDEAE層析所得質(zhì)粒組分含有的RNA比例越低，如此看來裂解液應加入高濃度的氯化鈣為好，但本實施例中(1)的結(jié)果又說明加入高濃度氯化鈣造成的pDNA損失更大。因此，需對加入的氯化鈣量權(quán)衡利弊，這是BIA法難以解決的矛盾。實施例5：BIA法CIMDEAE層析步驟中采用不連續(xù)遞增濃度NaCl梯級液洗脫所得pDNA組分的純度分析取含HG85abA質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌20克，按實施例1方法裂解并加1.0M終濃度的氯化鈣，將所得裂解液上CIMDEAE柱，用0.5MNaCl液洗滌后，依次用0.52、0.54、0.56、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0M的NaCl梯級液分段洗脫質(zhì)粒，圖8為該層析的分離圖，并對所得各組分取樣作HPLC，分析各核酸的比例，結(jié)果如表3所示。表3洗脫用的梯級NaCl液濃度(M)0.50.520.540.560.60.70.80.91.0所得組分的oc+scpDNA比例(％)016.339.246.496.796.478.7670所得組分的RNA比例(％)10083.660.853.63.33.621.333100圖9為說明圖8洗滌去除RNA組分和收集洗脫質(zhì)粒DNA組分的示意圖，顯示殘留的極少量RNA拖尾到最后才被洗下來。將表3與圖8各峰面積結(jié)合分析，顯示0.5MNaCl液洗下來的是RNA，從0.52M開始到0.56M濃度的NaCl液洗脫下小部分質(zhì)粒但含較高比例的RNA，0.6-0.7MNaCl液才洗脫下大部分的高純度質(zhì)粒。0.8和0.9MNaCl洗下的質(zhì)粒極少但RNA比例很高，說明有極少的RNA與DEAE配基結(jié)合很牢，圖9顯示洗脫時這種極少量的RNA拖尾一直到0.9-1.0MNaCl液才被洗下來混入質(zhì)粒DNA組分中。CIMDEAE柱去除RNA的效果不大好，需要下一步的CIMC4柱繼續(xù)去除這些殘留的RNA。實施例6：BIA法CIMC4疏水層析步驟中采用不連續(xù)遞減濃度硫酸銨梯級液洗滌或洗脫所得組分的超螺旋質(zhì)粒比例和純度分析培養(yǎng)GH85abA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌，裂解液中加入終濃度0.9M氯化鈣，澄清并濃縮的裂解液經(jīng)CIMDEAE柱去除RNA，收集的質(zhì)粒組分加入終濃度3.0M的硫酸銨后上CIMC4柱，用不連續(xù)遞減濃度硫酸銨梯級液洗滌或洗脫。圖10是該液相層析的分離圖，表4是收集的梯級液所含核酸成分的HPLC分析。表4洗滌或洗脫液硫酸銨濃度(M)1.81.61.41.21.00.80.60.40所得組分的RNA比例(％)00003.06.565.2N/A100所得組分的sc質(zhì)粒比例(％)0093.897.495.893.134.8N/A0所得組分的oc質(zhì)粒比例(％)1001006.22.61.20.40N/A0將層析分離圖10中的各峰面積與表4中核酸各組分的比例結(jié)合分析，可見1.8-1.6M硫酸銨液洗出的微小峰為少量oc質(zhì)粒，1.4-1.2M硫酸銨液洗脫的兩個大峰為占總量80％以上的高純(90％以上)sc質(zhì)粒，1.0-0.8M硫酸銨液洗脫的兩個小峰為占總量10％左右的高純sc質(zhì)粒但仍含少量(3.0-6.5％)RNA,而0.6M硫酸銨液洗脫的小峰除sc質(zhì)粒外還含有65.2％但量極少(峰很小)的RNA。將1.4-0.6M硫酸銨液洗脫的質(zhì)粒組分合并后取樣作HPLC分析，仍有占比例約1％的RNA小峰，sc質(zhì)粒峰比例為92-95％，其余為oc質(zhì)粒。實施例7：用本發(fā)明方法提取不同大小質(zhì)粒的實例A.提取DH5α大腸桿菌產(chǎn)生的4.4kbHG85abA質(zhì)粒取50克菌按實施例1所述方法裂解，不加氯化鈣，得到2250ml裂解液，用實施例2(1)所述小6FF柱方法測定質(zhì)粒含量為38μg/ml，總量85.5mg。經(jīng)中空纖維裝置超濾濃縮至約400ml，分二次共加入約800ml純凈水再超濾濃縮至350ml；取約100ml純凈水沖洗并透濾中空纖維管腔，收集可能附著在管壁上的質(zhì)粒，共得450ml濃縮裂解液，經(jīng)0.45μm濾器過濾澄清，同法測得質(zhì)粒含量160μg/ml，總量72mg。中空纖維超濾濃縮裝置使用三次后以0.5MNaOH液洗滌除去可能殘留的內(nèi)毒素等雜質(zhì)，再以TE液洗去NaOH液后(再生)可重復使用。在BIO-RAD公司的NGC中壓液相層析分離裝置上進行以下三步：1.采用博格隆(上海)生物技術(shù)公司的0.5升Bestrose6FF凝膠柱，以TE液平衡后，加載150ml上述濃縮裂解液，上樣完畢繼續(xù)用TE洗滌，收集第一峰pDNA組分，丟棄后下來的RNA大峰，繼以TE液洗滌至電腦屏上出現(xiàn)平直基線。如此進行第二、第三次各150ml濃縮裂解液上樣、分離收集其pDNA組分，流速25ml/min。合并三次收集的pDNA組分液共620ml，用實施例2(2)所述裝置和方法測定其質(zhì)粒含量為109.6μg/ml，總量68mg。然后灌注3個CV(柱床體積)的0.5MNaOH液清潔6FF柱，繼用潔凈水洗盡NaOH后以TE液平衡，此柱可再使用三次。不算NaOH液清潔和TE液平衡耗時，三次上樣濃縮裂解液分離pDNA組分耗時3小時多。2.采用BIA公司的CIMC4(8ml，標示核酸載量2-2.5mg/ml，總載量16-20mg)整體柱。秤取245g分析純固體硫酸銨一點一點地加入620mlpDNA組分液中攪拌溶解(硫酸銨終濃度約3.0M)，然后每次取約200-210ml(約含22mg質(zhì)粒)該液加載到已用3.0M硫酸銨-TE液平衡的CIMC4柱上，加載完畢以20CV的1.6M硫酸銨-TE液洗滌除去大部分開環(huán)(oc)質(zhì)粒，再以0.4M硫酸銨-TE液洗脫收集超螺旋(sc)質(zhì)粒組分，每次約40ml(4CV)，然后用15CV的TE液洗滌，繼以10CV的3.0M硫酸銨-TE液平衡，流速30ml/min，如此三次。合并三次所得sc質(zhì)粒組分液共約120ml，測得質(zhì)粒濃度0.49mg/ml，總量58.8mg。三次層析分離共耗時2小時。然后用10CV的0.5MNaOH液灌洗清潔該柱，再以15-20CV的TE液洗去NaOH再生此柱，流速30ml/min。3.采用BIA公司的CIMDEAE(8ml，標示核酸載量6-8mg/ml,總載量48-64mg)整體柱。在上一步得到的120mlsc質(zhì)粒組分液中加入約二倍體積的純凈水稀釋使電導率降至38-40ms/cm，然后一次加載到已用TE液平衡的CIMDEAE柱上。加載完畢用約20CV的0.52MNaCl-TE液洗滌去除可能殘留的所有雜質(zhì)，再以0.9MNaCl-TE液洗脫收集sc質(zhì)粒組分68ml，用實施例2(2)方法測定純化質(zhì)粒濃度為0.80mg/ml，總量約54.56mg，接近此柱的總載量，流速為30ml/min，由于其載量比CIMC4柱大約三倍，僅作一次層析分離即可，耗時0.5小時。取樣作HPLC分析，幾無RNA峰，sc質(zhì)粒峰95％，gDNA和內(nèi)毒素等檢測達標，全程質(zhì)?；厥章?3.8％。B.提取XL10-gold大腸桿菌生產(chǎn)的15kbSVK-CAVA質(zhì)粒此質(zhì)粒比HG85abA質(zhì)粒大三倍多，宿主大腸桿菌也不同，為檢驗本發(fā)明方法是否也適合不同菌種產(chǎn)生的較大質(zhì)粒的純化，進行了該實驗。其程序與A所述基本相同，僅將要點簡述如下：50克菌裂解得到2200ml裂解液，質(zhì)粒含量為20μg/ml，總量44.8mg。經(jīng)中空纖維裝置超濾并滲濾洗濾濃縮共得210ml濃縮裂解液，質(zhì)粒含量181μg/ml，總量38mg。經(jīng)6FF凝膠柱三次分離得到合并的質(zhì)粒液450ml,質(zhì)粒含量77.8μg/ml，總量35mg。經(jīng)CIMC4(8ml)柱三次后所得sc質(zhì)粒組分液共約110ml，測得質(zhì)粒濃度0.280mg/ml，總量約30.75mg。再經(jīng)CIMDEAE(8ml)柱(以0.54MNaCl-TE液洗滌,0.8MNaCl-TE液洗脫)后收集到sc質(zhì)粒組分45ml，濃度為0.68mg/ml，總量約30.6mg。全程sc質(zhì)粒組分回收率68.3％。表明本發(fā)明方法也可成功用于規(guī)?；兓煌竽c桿菌產(chǎn)生的較大質(zhì)粒，但這兩種整體柱對該較大質(zhì)粒的結(jié)合載量偏低約30％，不如小質(zhì)粒。實施例8：本發(fā)明方法與BIA和GE推薦方法的簡要比較本發(fā)明人自2005年來一直使用顆粒介質(zhì)三步層析分離法來純化質(zhì)粒，起初用GE公司產(chǎn)品，后來用國產(chǎn)(博格隆公司)同類產(chǎn)品效果基本相同，并對該方法進行了改進，加入了中空纖維超濾濃縮步驟，將原來需要多個大凝膠柱減少為一個，獲得了經(jīng)驗積累了資料數(shù)據(jù)。2010年起使用BIA公司整體柱甚感興趣，認為不愧為更新?lián)Q代的創(chuàng)新型液相層析分離工具，攜帶使用維修方便，高通量快速省時又省力，但美中不足是氯化鈣沉淀去除RNA不佳影響了整個方法的效果。以下依據(jù)我們多次具體實施結(jié)果對三種方法作一簡要的大致比較。以在準備工作充分和操作順利的狀態(tài)下，按每次提取獲得50mg左右純化質(zhì)粒的規(guī)模進行衡量，分別采用每克菌含1.2-1.4mgHG85abA質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌55-150g。時間的計算包括一個柱(因載量較低)需連續(xù)使用三次提取質(zhì)粒時，每次用后再平衡的時間。層析時顆粒介質(zhì)柱采用各柱允許的最大流速的一半，8ml整體柱采用30ml/min流速(允許的最高流速為100ml/min)進行，所計時間是各步驟的最短時間。比較結(jié)果見表5。表5說明：[1]BIA法的氯化鈣沉淀步驟造成質(zhì)粒損失一半以上，需要用約2.1-2.3倍菌量才能最終獲得50mg左右的質(zhì)粒。[2]BIA法所用菌量多，裂解液也多2.1-2.3倍，離心過濾時間延長至4h；加上不濃縮且需用水稀釋4.6倍降低電導至38-40ms/cm才能上CIMDEAE柱，使得整個上柱液體積很大。[3]我們嘗試在BIA法中加入超濾濃縮裂解液以減少CIMDEAE柱上樣的體積和時間，但因裂解液多2.1-2.3倍還要加4.6倍水稀釋故濃縮耗時增加到約4h。[4]16h為不濃縮裂解液的耗時。3h為采用超濾濃縮裂解液減少上柱液體積后的耗時，由于BIA法該柱的核酸載量(48-64mg)一大半被氯化鈣未能去除的RNA占據(jù)，每次只能得到16-18mg質(zhì)粒，需連續(xù)使用三次才能得到50mg以上質(zhì)粒，耗時3h。而本發(fā)明方法只需一次0.5h。[5]由于CIMC4柱的核酸載量(16-20mg)只有CIMDEAE柱(48-64mg)的1/3,需連續(xù)使用三次才能處理50mg左右純化質(zhì)粒，耗時2h。若按我們提議BIA公司生產(chǎn)了25ml的CIMC4柱則只需一次0.5h。討論：1.顆粒介質(zhì)層析系統(tǒng)與monoliths層析系統(tǒng)都已成功地建立了自身體系的質(zhì)粒純化方法，但迄今未見將這二類系統(tǒng)聯(lián)合應用于質(zhì)粒純化的報道[11]。由于Monoliths是創(chuàng)新開發(fā)的更具優(yōu)勢的低壓、高通量高效層析分離材料，我們認為應以其為基礎(chǔ)積極采用，以站在更高起點創(chuàng)造出更優(yōu)良的質(zhì)粒規(guī)模純化技術(shù)。我們分析，堿裂解法產(chǎn)生的裂解液中pDNA和RNA為主要成分，后者含量為前者的8-12倍。就理化性質(zhì)而言，pDNA和RNA在溶液中的帶電性質(zhì)相似，它們與Ca++離子結(jié)合和與DEAE陰離子交換介質(zhì)或氨基酸-DNA親和介質(zhì)配基的結(jié)合沒有專一選擇性，主要是二者結(jié)合力的差異。然而分子量均一的pDNA與分子量高度不均一的RNA混合物在大小上差別較大，較小的4.4kb的HG85abA質(zhì)粒分子量就大于2000kD，比裂解液中最大的細菌RNA分子還大，因此采用顆粒介質(zhì)層析獨有的凝膠過濾(分子篩)層析可分離二者。本發(fā)明首先考慮采用近年發(fā)展的中空纖維切向流超濾裝置濃縮裂解液。堿裂解法每克菌可產(chǎn)生約45ml裂解液，100克菌產(chǎn)生4.5L裂解液，GE推薦的三步液相層析分離質(zhì)粒純化方法的第一步是采用交聯(lián)瓊脂糖顆粒凝膠柱過濾(不濃縮)裂解液除去細菌RNA，上樣量為柱體積的10-35％；按30％算，100克菌的裂解液需要三個5L凝膠柱，或一個5L柱使用三次。我們先用載留分子量200-300kD的中空纖維超濾裝置濃縮裂解液8-10倍以0.45微米濾膜過濾后上凝膠柱，100克菌獲得約500ml濃縮液用一個5L凝膠柱足夠有余或一個1L柱用二次，既節(jié)約凝膠柱又節(jié)約操作時間甚為經(jīng)濟。而且，GE法中為了與第二步疏水性PlasmidSelect柱層析分離相銜接，凝膠過濾柱的平衡、洗滌、再生液都采用三倍柱體積的2.1M硫酸銨-TE液。若不濃縮裂解液需使用多個大柱，大規(guī)模生產(chǎn)時硫酸銨用量很大，廢液污染環(huán)境會產(chǎn)生嚴重問題需專門處理；本發(fā)明方法此步采用TE液則無問題。我們先用中空纖維超濾將不加CaCl2的裂解液濃縮8-10倍后，以凝膠過濾柱過濾，只要上樣體積適當(柱體積的10-35％，視宿主菌的不同而不同)，收集的pDNA第一峰與后續(xù)的RNA大峰可分開，回收的pDNA組分幾乎完全不含RNA，此為充分利用以后步驟的CIMDEAE柱和CIMC4柱或氨基酸-DNA親和配基整體柱的功能和核酸載量創(chuàng)造了有利條件。本發(fā)明方法的優(yōu)點是：1)采用中空纖維超濾濃縮裂解液大大減少了下一步凝膠過濾柱的體積和操作時間及成本，其質(zhì)粒損失和獲得同等量純化質(zhì)粒需要處理的細菌和裂解液量比BIA法的氯化鈣沉淀少得多；2)6FF凝膠過濾可基本上除盡細菌RNA，為下一步的整體柱高通量疏水層析或氨基酸-DNA親和層析省略去除RNA步驟并滿載結(jié)合回收質(zhì)粒創(chuàng)造了條件；3)雖然增加了凝膠過濾步驟，但本發(fā)明的聯(lián)合液相層析方法的總耗時比即使采用了超濾濃縮的BIA推薦方法還少，比不采用超濾濃縮的BIA法或顆粒介質(zhì)柱層析法則少得多(參見實施例8的表5)，有利于sc質(zhì)粒的保存和回收。2.BIA公司目前提供的質(zhì)粒純化產(chǎn)品為：現(xiàn)有配套的各裝8ml，80ml或800ml的CIMDEAE和CIMC4兩個整體柱，但這二種柱的核酸載量不同，CIMDEAE為6-8mg/ml而CIMC4為2-2.5mg/ml。選擇8mlCIMDEAE柱與8mlCIMC4柱配套，是因為他們知道CIMDEAE柱加載的經(jīng)氯化鈣處理的稀釋裂解液中仍含不少RNA將占據(jù)其約2/3核酸載量，剩下的1/3可結(jié)合的質(zhì)粒量正好與CIMC4柱的載量相當。按照本發(fā)明方法用凝膠過濾先除盡RNA后，CIMDEAE柱的載量將全部提供給質(zhì)粒，我們將建議BIA公司生產(chǎn)總核酸載量相當?shù)亩N整體柱，即8mlCIMDEAE柱與25mlCIMC4柱配套；或80mlCIMDEAE柱與250mlCIMC4柱配套。3.歐洲的科研人員還制備了同時包含疏水性C4(或C8)和離子交換DEAE二種配基的整體柱，采用0.6MNaCl-TEpH7.2洗滌除去RNA，以3M硫酸銨-TE液pH7.2激發(fā)疏水結(jié)合然后用3M硫酸銨+1MNaCl-TE液pH7.2最大程度減少離子交換反應，最后以1MNaCl-TE液洗脫收集質(zhì)粒組分[12]。他們希望用這類整體柱對經(jīng)初步處理的澄清裂解液作一步層析就能得到純化的sc質(zhì)粒，但加載的仍是用氯化鈣沉淀等方法初純的裂解液，氯化鈣沉淀質(zhì)粒損失大，最多只能去除80％左右的RNA及其伴隨的內(nèi)毒素。要求一步即能兼顧去除RNA、去除oc質(zhì)粒和去除內(nèi)毒素并盡量多回收sc質(zhì)粒等多項任務對這類整體柱來說可能難以實現(xiàn)，因為一步法去除內(nèi)毒素的洗滌過程顯然不足，難以將其殘留量降到低于10EU/mg質(zhì)粒的要求。本發(fā)明方法的第二步采用顆粒凝膠柱過濾可以去除幾乎全部RNA及其伴隨的內(nèi)毒素，比氯化鈣沉淀去除的內(nèi)毒素更多；第四步的CIMDEAE層析目的是通過其洗滌過程保證徹底去除殘余的內(nèi)毒素等雜質(zhì)。如果第三步采用上述二種配基整體柱或氨基酸-DNA親和整體柱時將去除RNA的步驟變更為洗滌去除內(nèi)毒素步驟能使內(nèi)毒素殘留量降到低于10EU/mg質(zhì)粒，也許有可能省略掉第四步的CIMDEAE層析。我們期待這類新產(chǎn)品盡快上市以便進一步嘗試省略掉第四步的可能性。參考文獻1)張平靜，李忠明等；“一種簡便易行核酸疫苗質(zhì)粒純化工藝的開發(fā)”，中國生物工程雜志，2011，31(4)：1062)N.L.Krajncetal：“PurificationoflargeplasmidsfromE.coli”，JournalofChromatographyA,1218(2011)2413-2424.3)F.Smrekar,etal：“ANovelPlasmidPurificationProcess:FromLaboratorytoProductionScale”，Vaccine28(2010)2039-2045.4)SousaA,AlmeidaAM,etal：“HistaminemonolithversatilitytopurifysupercoiledplasmiddeoxyribonucleicacidfromEscherichiacolilysate”,JChromatogrA.2014Aug15；1355:125-33.5)AmorimLF,SousaF,QueirozJA,etal：“ScreeningofL-histidine-basedligandstomodifymonolithicsupportsandselectivelypurifythesupercoiledplasmidDNAisoform”,JMolRecognit.2015Jun；28(6):349-358.6)SoaresA,QueirozJA,SousaF,etal：“Purificationofhumanpapillomavirus16E6/E7plasmiddeoxyribonucleicacid-basedvaccineusinganargininemodifiedmonolithicsupport”,JChromatogrA.2013Dec13；1320:72-9.7)李忠明，吳雪瓊等“結(jié)核桿菌Ag85ab嵌合基因疫苗、其制備方法及應用”，中國發(fā)明專利CN201010191243.X8)“一種復制子DNA疫苗載體及其構(gòu)建方法與應用”，中國發(fā)明專利CN20131017958.89)“黑色素瘤治療性質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制備方法及其專用工程菌及發(fā)酵培養(yǎng)基”，中國發(fā)明專利CN201310131566.310)YinX等；“SynergisticantitumorefficacyofcombinedDNAvaccinestargeting，Tumorcellsandangiogenesis”,BiochemBiophysResCommun.,2015,465(2):239-24411)GhanemA,HealeyR,AdlyFG：“CurrenttrendinseparationofplasmidDNAvaccines:Areview”,AnalChimActa760(2013)1-15.12)SmrekarV,SmrekarF,StrancarA,etal：“SinglestepplasmidDNApurificationusingmethacrylatemonolithbearingcombinationofion-exchangeandhydrophobicgroups”,JChromatogrA.2013Feb8；1276:58-64.當前第1頁1 2 3