本發(fā)明涉及胸膜肺炎放線桿菌的體內(nèi)誘導抗原及其應用。

背景技術(shù)：

豬傳染性胸膜肺炎是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要呼吸系統(tǒng)疾病之一，其病原為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。該病通過呼吸系統(tǒng)相互傳播，引起豬纖維素性胸膜炎和出血性肺炎。胸膜肺炎放線桿菌在1957年從豬肺臟中分離出，是豬的一種重要的呼吸系統(tǒng)病原微生物。APP引起豬的傳染性胸膜肺炎(PCP)，該病給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重危害。研究發(fā)現(xiàn)，對于豬肺炎的治療導致病原菌耐藥性的不斷提高?？咕鷦┳鳛榇偕L劑的日常使用也增強了病原菌的耐藥性。抗生素的殘留及病原菌耐藥性的增強引起養(yǎng)殖業(yè)成本增加，逐漸引起人們的重視。

APP商品滅活疫苗已被廣泛用于PCP的防控。此外，APP的一些重組抗原被證明為免疫保護抗原。當前使用的大部分商品疫苗為傳統(tǒng)的滅活菌苗，這些疫苗能提供部分免疫保護，能降低死亡率，但并不能降低發(fā)病率。在一個國家或地區(qū)，有多個流行血清型流行，同時有幾個優(yōu)勢血清型，滅活疫苗通常來源于一個或幾個優(yōu)勢血清。因為不同血清型間缺乏有效的交叉保護，使用商品滅活菌苗很難有效控制PCP。研究發(fā)現(xiàn)APP的一些保守的毒力因子(如apx毒素)，作為疫苗候選因子可以提供一定的交叉保護。

但是要制備得到保護效果比較好的重組毒力蛋白卻并非易事。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了新的胸膜肺炎放線桿菌的體內(nèi)誘導抗原及其應用。

本發(fā)明胸膜肺炎放線桿菌的體內(nèi)誘導抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～6任意一項所示。

本發(fā)明表達前述抗原的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～12任意一項所示。

本發(fā)明一種重組載體，它包括前述的基因片段；所述重組載體優(yōu)選為pET-28a載體。

本發(fā)明一種重組菌，它包括前述的載體；所述重組菌有選為重組大腸桿菌。

本發(fā)明一種制備前述抗原的方法，步驟如下：取前述的重組菌，誘導表達，純化，即可。

本發(fā)明前述抗原在制備預防豬傳染性胸膜肺炎的疫苗中的用途。

本發(fā)明一種疫苗，它包含前述抗原以及藥學上可接受的輔料或者載體制備而成。

其中，所述的輔料或者載體為免疫佐劑和/或防腐劑。其中，所述佐劑為弗氏佐劑，優(yōu)選為弗氏完全佐劑。

本發(fā)明還提供了前述的疫苗在制備預防豬傳染性胸膜肺炎的藥物中的用途。其中，所述的預防藥物是注射制劑。

本發(fā)明6種體內(nèi)誘導抗原可以有效促進淋巴細胞增殖，刺激機體產(chǎn)生胸膜肺炎放線桿菌特異性抗體以及γ-干擾素、IL-4等細胞因子，保護性強，并且穩(wěn)定性強，安全性好，臨床應用前景優(yōu)良。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1運用生物信息學方法對體內(nèi)誘導抗原表位的預測。

圖2重組菌株未誘導(A)和誘導(B)的SDS-PAGE分析。

圖3純化蛋白的SDS-PAGE和Western blotting。

A.6個純化重組蛋白的SDS-PAGE。B.6個重組蛋白的western blot分析。Lane M:protein marker.Lane 1-6:RnhB,GalU,GalT,APL_1061,APL_1166,HflX。

圖4IgG水平檢測。

采集免疫組和對照組未免疫和二免后兩周的血清，分析IgG水平。運用由相應重組蛋白包被的間接ELISA方法檢測IgG水平?？贵w水平用450nm吸光值表示。

圖5淋巴細胞增值實驗。

分離免疫組和對照組二免后兩周的脾細胞，用相應重組蛋白和conA刺激培養(yǎng)細胞。用MTT法檢測淋巴細胞的增殖水平，檢測結(jié)果以595nm吸光值表示。

圖6淋巴細胞亞群分析。

用流式細胞術(shù)分析小鼠脾細胞CD3+,CD3+CD4+和CD3+CD8+T-cell亞群的水平。

圖7運用夾心ELISA方法檢測脾細胞IFN-γ(A),IL-2(B)和IL-4(C)的分泌水平。

圖8肺臟組織病理分析。

采集各實驗組小鼠肺臟、固定并進行組織病理學分析。A：正常對照，B：陰性對照，C-H：分別RnhB,GalU,GalT,APL_1061,APL_1166和HflX免疫組。H&E染色,400×放大。(A)正常對照。(B)陰性對照小鼠肺組織表現(xiàn)為血管和支氣管周圍炎性細胞浸潤。(C)rRnhB表現(xiàn)為輕微的炎性細胞浸潤。(D)免疫組存活小鼠肺組織的炎性細胞浸潤明顯減少。

圖9免疫組織化學分析A：巨噬細胞的免疫組化分析。B：中性粒細胞的免疫組化分析。a:正常對照，b:陰性對照，c-h:分別為免疫RnhB,GalU,GalT,APL_1061,APL_1166and HflX組，i:炎性細胞統(tǒng)計分析。

圖10APP L20株攻毒后小鼠的生存曲線。

圖11pET-28a質(zhì)粒圖譜。

具體實施方式

實施例1本發(fā)明誘導抗原的制備及其效果驗證

1、實驗材料和方法

1.1菌株，質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

大腸桿菌DH5a，BL21(DE3)購自北京天根公司，APPL20株及其他血清型參考菌株均由本實驗保存。大腸桿菌在LB(Luria-Bert)液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)需要加入終濃度100μg/ml的卡那霉素(Amp)，所有細菌均在37℃靜止(固體)或振搖(液體)培養(yǎng)。

表1.IVI基因篩選結(jié)果

pET-28a質(zhì)粒圖譜如圖11所示。

1.2工具酶和試劑

各種限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ，HandⅢ，NotⅠ等)、Primerstar聚合酶、T4DNA連接酶等工具酶、DNA Marker均購于寶生物工程(大連)有限公司。DNA回收試劑盒購于天根公司。胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar，TSA)、胰蛋白大豆肉湯(Tryptic Soy Broth，TSB)粉劑購自西班牙Difco公司。HRP標記的羊抗鼠IgG二抗購自southern biotech公司。無支原體新生牛血清購自杭州四季青有限公司，使用前經(jīng)56℃滅活30min。IPTG異丙醇-β-D-硫代半乳糖苷溶液(RT108-01)、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、卡那霉素(kanamycin，Kan)、蛋白上樣Buffer購自天根公司。NAD、溶菌酶、蛋白酶K均購自美國Invitrogen公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，western blot顯色底物均購于碧云天生物技術(shù)公司。

1.3培養(yǎng)基及抗生素的配制

TSB(Tryptic Soy Broth)液體培養(yǎng)基：6g TSB粉末溶于180mL水中，121℃高壓蒸氣滅菌20min。使用時加入終溶度為10μg/mL的NAD和10％小牛血清。

TSA(Tryptic Soy Agar)固體培養(yǎng)基：8g TSA粉末溶于180mL水中，121℃高壓蒸氣滅菌30min，待溫度降至約50℃時加入終溶度為10μg/mL的NAD和10％小牛血清，鋪制平板，待培養(yǎng)基凝固后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NaCl10g，溶于ddH₂O中，完全溶解后用5mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0～7.2，定容至1000mL，121℃高壓蒸氣滅菌20min，室溫保存。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂粉，121℃高壓蒸氣滅菌20min，待培養(yǎng)基溫度降至50℃左右，加入相應的抗生素后，鋪制平板，待培養(yǎng)基凝固后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

氨芐青霉素(Amp)：用滅菌ddH₂O配成貯存濃度50mg/mL，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

卡那霉素(Kan)：用滅菌ddH₂O配成貯存濃度25mg/mL，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4主要緩沖液

1.4.1 ELISA緩沖液

包被液：1.59gNaCO₃，2.93gNaHCO₃，加ddH₂O至1,000mL。

洗滌液：8.0gNaCl，0.2g KCI，2.9g Na₂HPO4·12H₂O，0.2g KH₂PO4，0.5mL Tween-20，加ddH₂O到1,000mL。

封閉液：5g脫脂牛奶，洗滌液定容至100mL。

1.4.2蛋白純化緩沖液(Ni-NTA)

5×Native Purification Buffer：磷酸二氫鈉7g，氯化鈉29.2g，加ddH2O溶解定容至200mL，調(diào)pH值到8.0。3M咪唑：咪唑20.6g，Stock solution A(10×)8.77mL，Stock solutionB(10×)1.23mL，氯化鈉0.5M，加ddH2O溶解定容至100mL，調(diào)pH值到6.0。Native Binging Buffer：1×Native Purification Buffer 30mL，3M咪唑100uL。調(diào)pH值到8.0。Native Washing Buffer：1×Native Purification Buffer50mL，3M咪唑335uL，調(diào)節(jié)PH值到8.0。Native Elution Buffer：1×Native Purification Buffer13.75mL，3M咪唑l.25mL，調(diào)PH值到8.0。

1.4.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)溶液

5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液：Tris堿7.55g，甘氨酸(電泳級，pH8.3)47g，25mL 10％SDS(電泳級)，加ddH₂O溶解定容至500mL。

1.4.4 Western-blot相關(guān)溶液

電轉(zhuǎn)緩沖液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris堿，0.037％SDS(電泳級)，20％。甲醇。配制1000mL轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸，5.8gTris堿，0.37gSDS，加200mL甲醇，加水至總量為1000mL。

TBS(pH8.0)：10mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl。TBST：含0.05％Tween-20的TBS。

1.5重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

參照Genbank上公布的胸膜肺炎放線桿菌血清5型L20菌株的全基因組信息分別設計擴增6個體內(nèi)誘導抗原的基因設計引物，詳細的引物信息見表2，根據(jù)酶切反應緩沖液的優(yōu)化及基因片段內(nèi)是否包含特定酶切位點，在3’末端和5’末端設計特定的酶切位點(下劃線標記)，見表2，引物由上海生工公司合成。

表2APP IVI基因擴增和克隆所用引物

以APPL20菌株基因組為模板，擴增相應基因。擴增條件為：94℃10min后進入循環(huán)；95℃30s，57℃45s，72℃2min，共30個循環(huán)；72℃10min。擴增得到的基因片段經(jīng)過回收純化后連接入pET-28a載體并進行測序分析。

質(zhì)粒的化學轉(zhuǎn)化：參照DH5α和BL21感受態(tài)細胞(天根公司)使用說明，內(nèi)容如下：

(1)取100μL感受態(tài)細胞置于冰浴中，向感受態(tài)細胞中加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。(2)將離心管置于42℃90s，然后將離心管移到冰浴中，靜置3min。(3)向離心管中加入900μL無菌的LB培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)45min(150rpm)。(4)將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100μL已轉(zhuǎn)化的卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基，涂布均勻，室溫放置至吸收完全，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。

酶切鑒定：用相應的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pET-28a和PCR擴增產(chǎn)物，用核酸純化試劑盒回收目的片段和載體，用T4DNA連接酶進行連接反應(16℃水浴過夜)，然后轉(zhuǎn)化DH5α，然后小量提取質(zhì)粒，用相應的酶進行酶切鑒定，構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒分別命名為pET-0022，pET-0129，pEt-0618，pET-0651，pET-0994，pET-1060，pET-1061，pET-1166，pET-1233，pET-1709，pET-1962。

其中，rRnhB的目標基因片段為：(SEQ ID NO.7)595bp

rGalU的目標基因片段為：(SEQ ID NO.8)888bp

ORIGIN

rGalT的目標基因片段為：(SEQ ID NO.9)1050bp

ORIGIN

rApl_1061的目標基因片段為：(SEQ ID NO.10)597bp

ORIGIN

rApl_1166的目標基因片段為：(SEQ ID NO.11)756bp

ORIGIN

rHflX的目標基因片段為：(SEQ ID NO.12)1224bp

ORIGIN

1.6融合蛋白的表達、純化

大腸桿菌原核表達操作方法參考分子克隆實驗指南，組氨酸融合表達蛋白純化參考Bio-rad公司產(chǎn)品說明書進行，具體為:

用表達載體pET-28a作對照，與重組質(zhì)粒同步轉(zhuǎn)化表達宿主菌DE3感受態(tài)細胞，挑取菌落，接種于2mL LB培養(yǎng)基中(含卡那霉素50μg/mL)，37℃振搖培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6-1.0(約12-16h)，取0.1mL菌液接種10mL LB培養(yǎng)基(卡那抗性)，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)OD6₆₀₀＝0.6-1.0(約12-16h)，加IPTG至終濃度1mmol/L，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)3-4h，4℃5000rpm離心5min收集菌體。

用1/10培養(yǎng)基體積PBS重懸菌體，分別取適量誘導表達菌體及其對照菌體，加等量2×SDS加樣緩沖液，100℃煮沸5min后，冰浴5min，反復3次，4℃5000rpm離心5min，分別取20μL上清加樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察分析。

取1mL菌液至EP管中。將收集于EP管中的細菌5000r/min離心5min，棄上清，加100μL無菌去離子水吹散混勻，加100μL 2×SDS凝膠加樣緩沖液，混勻后沸水浴5min，于12％的SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達。

用無菌槍頭挑取大腸桿菌表達菌株BL21單菌落，接種于5mL含合適抗生素的LB培養(yǎng)基中于37℃，180r/min振蕩培養(yǎng)約12-14h，至OD600達到0.6～1.0時，取培養(yǎng)物4mL接種于400mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)約3h-4h，至OD600約為0.6時，加IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3h-4h。將菌液12000r/min，離心10min后用40mL在4℃預冷的1×binding buffer來懸浮菌體，超聲波破碎后，12000r/min離心10min后將上清液加入到提前預裝好的鎳離子親和層析柱中，靜放置30-60min，然后進行過柱，待液體流干之后，再加入2倍柱體積的binding buffer進行洗滌3次，然后再加入1倍體積的Elution buffer在室溫作用30min使重組蛋白從層析柱上洗脫下來，并且取洗脫的重組蛋白進行電泳檢測。將純化好的蛋白進行分裝保存，并置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS-PAGE操作方法參照碧云天試劑盒說明書，具體為:

固定灌制聚丙烯酰胺凝膠的玻璃板，將制好的12％的SDS丙烯酰胺分離膠約5mL迅速灌入兩玻板的間隙中，留出灌注積層膠所需空間，在分離膠上面加入1層異丙醇。分離膠聚合后，傾出覆蓋層的異丙醇液體，用去離子水洗凝膠頂部2次，將剛制好的5％積層膠灌入分離膠上，立即插入梳子。待膠全部聚合后拔出梳子，固定于電泳裝置。加電泳緩沖液，每孔加20μL樣品，將電泳裝置與電源相接，將電壓調(diào)到80V，待溴酚藍泳動到分離膠時，將電壓調(diào)到120V，等溴酚藍到達分離膠底部時關(guān)掉電源，取出聚丙烯酰胺凝膠。將聚丙烯酰胺凝膠置于考馬斯亮藍染色液中染色6h以上，然后取出凝膠放入脫色液中脫色數(shù)次，每次60-120min，至背景色變?nèi)?、目的蛋白帶變清晰為止?/p>

使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(Beyotime,China)測定蛋白濃度。

1.7融合蛋白的免疫印跡分析

電轉(zhuǎn)：當SDS-PAGE電泳將結(jié)束時，用蒸餾水淋洗石墨板，用不被吸收的紙巾擦干。戴上手套，切6張濾紙和1張硝酸纖維素濾膜。濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或略小于凝膠。在托盤中加入少量電轉(zhuǎn)緩沖液，把6張濾紙浸泡于其中。戴上手套安裝轉(zhuǎn)移裝置，平放底部電極(將為陽極)，石墨一邊朝上，在這一電極上放置3張浸泡過的濾紙，精確對齊，趕出氣泡，把硝酸纖維素濾膜放在濾紙上，保證對齊，沒有氣泡。從電泳槽上取下凝膠，轉(zhuǎn)移到去離子水中略為漂洗一下，然后精確平放于硝酸纖維素濾膜上，凝膠左下角與濾膜標記對齊，戴手套排除氣泡。把最后3張濾紙放在凝膠上方，同樣保證精確對齊不留氣泡。將靠上方的電極(陰極)放于夾層物上，石墨一邊朝下，連接電源，電壓調(diào)至25v，電轉(zhuǎn)印20min。

封閉：把硝酸纖維素濾膜放入可加熱封接的塑料袋中，加入適量封閉液(含1％BSA的TBST)，盡可能排除氣泡后密閉袋口，平放于搖床上室溫溫育1h，棄去封閉液。

第一抗體和靶蛋白結(jié)合：把硝酸纖維素濾膜放入一新的塑料袋中，按0.1-15mL/cm2的量加入用TBST以1:100稀釋的一抗，排除氣泡后密閉袋口，平放于搖床上室溫溫育1h。剪開塑料袋口，將硝酸纖維素濾膜用TBST洗3遍，每次5～10min。

二抗體與硝酸纖維素濾膜的溫育：把硝酸纖維素濾膜放入新的塑料袋中，加入適量用TBST以1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗體，排除氣泡后密閉袋口，平放于搖床上室溫溫育1h。剪開塑料袋口，將硝酸纖維素濾膜用TBST洗5遍，每次10min。

加入底物顯色：把硝酸纖維素濾膜放入10mL底物液中，顯色1-15min，一旦出現(xiàn)蛋白帶，立即用去離子水終止，即可觀察。

1.8動物免疫及攻毒

6-8周雌性BALB/c小鼠(18-22g)購于成都達碩實驗動物有限公司。參照文獻，半數(shù)致死量的測定[10]。將小鼠隨機分成8組，每組8只，每組攻擊菌液濃度依次為3×10⁷、1.5×10⁷、7.5×10⁶、3.75×10⁶、1.875×10⁶CFU，每只小鼠注射細菌懸液0.1mL，對照組注射等體積無菌PBS。觀察一周,記錄每天的發(fā)病及死亡情況。參照Reed-Muench法計算APP L20對小鼠的半數(shù)致死量。為了獲得一個精確的攻毒劑量，本研究運用Reed-Muench法測定了LD₅₀[10]。將實驗動物隨機分為7個組，每組15只。初次免疫使用等體積的弗氏完全佐劑分別與50μg rRnhB,rGalU,rGalT,rAPL_1061,rAPL_1166和rHflX乳化，皮下注射免疫6組小鼠。以PBS和等體積的弗氏完全佐劑乳化免疫陰性對照組。首免兩周后，以等劑量的蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化對小鼠加強免疫一次。分別在免疫前及加強免疫兩周后，進行尾部采血收集血清。加強免疫兩周后，以5×10⁸CFU(10LD50)的App L20對各實驗組進行腹腔攻毒。攻毒后觀察動物死亡情況，記錄一周內(nèi)的免疫保護率。對攻毒動物進行安樂死，分離肺臟用于病理學分析。

1.9間接ELISA檢測抗體水平

參考文獻(Fu et al.,2013)，采用間接ELISA方法檢測免疫組IgG水平，方法簡述如下。將蛋白用碳酸鹽緩沖液(PH 9.6)稀釋到固定濃度(w/v；2.5μg/mL)。用蛋白稀釋液(100μL)包被96微孔板(COSTAR,USA)，4℃孵育過夜。加入封閉液室溫孵育1h，用洗滌液洗滌3次，每次3min(BEYOTIME,China)。用一抗稀釋液(BEYOTIME,China)以1:100倍稀釋血清樣品，加入微孔板，孵育過夜。微孔板洗滌三次。用二抗稀釋液(BEYOTIME,China)將山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記IgG以1:2000稀釋，加入微孔板室溫孵育1h。洗滌3次，加入可溶性TMB底物(100μL)，避光室溫孵育30min。加入2M H2SO4終止反應，并讀取450nm波長的吸光值(BIO-RAD,USA)。

1.10淋巴細胞增殖試驗

淋巴細胞增殖實驗參考文獻(Fu et al.,2013)，稍作修改。首先，用無菌不銹鋼篩和無菌注射器的橡膠塞輕柔處理脾臟，無菌分離獲得脾細胞。用RPMI不完全培養(yǎng)基重懸脾細胞(THERMO,USA)。首先，按照操作說明用紅細胞裂解緩沖液(SOLARBIO,China)處理細胞懸液。首先用Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)(THERMO,USA)將細胞洗滌3次，并將細胞重懸于RPMI完全培養(yǎng)基(THERMO,USA)。對分離的脾細胞計數(shù)，并在96孔培養(yǎng)板(COSTAR,USA)中加入100μL細胞。分別向培養(yǎng)板中加入重組蛋白(5μg/well)和刀豆蛋白A(ConA)(SIGMA-ALDRICH,USA)，37℃，5％的CO₂中培養(yǎng)72h。淋巴細胞增殖實驗按照MTT Cell Proliferation Assay Kit(BEYOTIME,China)操作說明操作。在培養(yǎng)板中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后將100μL Formanzan溶液加入培養(yǎng)板接著培養(yǎng)，直到Formanzan完全溶解。最后讀取595nm波長培養(yǎng)板的吸光值(BIO-RAD,USA)。

1.11細胞因子測定

用ELISA方法(NEOBIOSCIENCE,China)檢測淋巴細胞培養(yǎng)上清中細胞因子(IFN-γ,IL-2and IL-4)，比較免疫前及加強免疫后Th1和Th2細胞水平。

1.12流式細胞分析

加強免疫兩周后，分離脾細胞用流式細胞術(shù)細菌T細胞亞群分析，方法簡述如下。收集脾細胞，進行細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×10⁶個/mL。取100μL細胞懸液到另一個離心管，加入rat anti-mouse CD3-FITC SPRD(Southern Biotech,USA)，rat anti-mouse CD4-PE(Southern Biotech)，和rat anti-mouse CD8a-PerCP(Southern Biotech)，4℃避光孵育15min。用PBS洗滌染色過的細胞并重懸于450μL PBS。用BD FACS Calibur flow cytometer(BD,USA)分析對重懸細胞進行T細胞亞群分析并記錄結(jié)果。

1.13組織病理學

分離不同組動物肺臟并用10％中性福爾馬林固定。將固定組織進行HE染色和石蠟切片，厚度為5μm。在Olympus DP71顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.14免疫組織化學分析

免疫組化方法分析不同組織中中性粒細胞和巨噬細胞浸潤。制備不同組織的石蠟切片，并用單克隆抗體孵育。Rabbit anti-mouse CD68和rabbit anti-mouse MPO分別為巨噬細胞和中性粒細胞的單克隆抗體(Guge Biotech,Wuhan,China)。參考之前的研究，對切片進行進步處理(Oh et al.,2013)。200倍放大觀察IHC切片并照相保存。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析IHC照片，以光密度值(Integrated optical density，IOD)作為照片的陽性指數(shù)。

1.15統(tǒng)計分析

用SPSS19.0軟件Student’s t-test分析相關(guān)數(shù)據(jù)。以P值<0.05為具有統(tǒng)計學差異，文中以“*”表示，P值<0.001以“**”表示。

2結(jié)果

2.1重組蛋白的表達

圖1為運用生物信息學方法對體內(nèi)誘導抗原表位的預測結(jié)果。

測序分析表明重組表達載體構(gòu)建成功。本研究成功將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E.coli BL21，并成功表達了His-標簽融合蛋白。SDS-PAGE分析顯示BL21表達的重組蛋白分子量與預測大小相符(圖2)。用鎳柱親和層析法純白蛋白，并用SDS-PAGE分析純化結(jié)果(圖3A)。比較每個IVI抗原蛋白的SDS-PAGE，在western blotting相應位置都有曝光條帶(圖3B)，這表明這些蛋白都能與相應的抗血清反應。

其中，重組蛋白rRnhB、rGalU、rGalT、rApl_1061、rApl_1166和rHflX的氨基酸序列為：

胸膜肺炎放線桿菌RnhB蛋白(SEQ ID NO.1)

ORIGIN

胸膜肺炎放線桿菌GalU蛋白(SEQ ID NO.2)295aa

ORIGIN

胸膜肺炎放線桿菌GalT蛋白(SEQ ID NO.3)349aa

ORIGIN

胸膜肺炎放線桿菌Apl_1061蛋白(SEQ ID NO.4)198aa

ORIGIN

胸膜肺炎放線桿菌Apl_1166蛋白(SEQ ID NO.5)251aa

ORIGIN

胸膜肺炎放線桿菌HflX蛋白(SEQ ID NO.6)407aa

ORIGIN

2.2體液免疫反應

二免后兩周收集血清，采用間接ELISA方法檢測血清IgG水平。由間接ELISA結(jié)果(圖4)可以看出，各個免疫組二免后的IgG水平與免疫前相比都有大幅的提高。與陰性對照組比較，IVI抗原蛋白組IgG水平有顯著提高(P<0.001)。

2.3細胞免疫反應

重組蛋白刺激后，除了rRnhB的其它免疫組的淋巴細胞增殖水平都高于陰性對照組(圖5)。相似的，ConA刺激同樣刺激了這些免疫組的淋巴細胞增殖。

本研究對運用流式細胞術(shù)分析了CD3+,CD4+和CD8+T細胞在脾細胞中的比例。免疫組中CD3+和CD4+T細胞的比例總體要高于對照組(圖6)。在rGalT組，CD3+,CD4+和CD8+表現(xiàn)為最高水平，并顯著高于對照組(P<0.05)。

此外，免疫組細胞上清中IFN-γ,IL-2and IL-4的水平顯著高于對照組(P<0.05)(圖7)。重組蛋白刺激后，IL-4的分泌水平要高于IFN-γ和IL-2(圖7)。除APL_1166組外，其它免疫組IFN-γ的分泌水平均顯著高于對照組(p<0.05)。除了rHflX組，免疫組IL-2和IL-4的分泌水平均顯著高于對照組(p<0.05)。

2.4小鼠保護率實驗

攻毒保護試驗得出rGalT，rAPL_1166和rHlfX分別提供87.5％,62.5％和62.5％的保護率(圖10)。10LD₅₀L20攻毒后，陰性對照組動物全部死亡。rRnhB，rGalU和rAPL_1061免疫組均提供25％保護率(圖10)。

2.5組織病理學分析

組織病理學檢查表明在肺組織中有中性粒細胞和巨噬細胞浸潤(圖8)。對照組小鼠肺臟表現(xiàn)出嚴重損傷，同時肺泡結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出病理變化(圖8B)。同時肺實質(zhì)表現(xiàn)水腫(圖8B)。而免疫組的存活小鼠未表現(xiàn)出明顯的病理損傷(圖8)。免疫組小鼠的組織僅表現(xiàn)出溫和的中性粒細胞和巨噬細胞浸潤(圖8C-H)。

2.6免疫組織化學分析

免疫組化結(jié)果顯示，陰性對照中性粒細胞的光密度值(IOD)顯著高于正常對照組(p<0.05)(圖9B)。除GalU外，其他免疫組中中性粒細胞的IOD與正常對照中差異均不顯著。然而，陰性對照和免疫組巨噬細胞的IOD值與正常組的差異均不顯著(圖9A)。

本研究對6個體內(nèi)誘導抗原RnhB,GalU,GalT,Apl_1061,Apl_1166和HflX進行了小鼠免疫保護試驗。結(jié)果顯示，免疫組的IgG水平顯著高于陰性對照組(P<0.001)。在淋巴細胞增殖實驗中，除了rRnhB組，其他免疫組都能觀察到淋巴細胞增殖，特別是在rGalU和rGalT組觀察到了相對高水平的淋巴細胞增殖(P<0.05)。在rGalT免疫組，CD4+T細胞的比例顯著高于陰性對照組。此外，其他免疫組CD4+T細胞的比例都有不同程度的升高。同時，檢測到Th1(IFN-γ,IL-2)和Th2(IL-4)細胞因子水平升高。攻毒保護試驗表明rGalT,rAPL_1166和rHflX能提供較高的免疫保護保護率分別為87.5％,62.5％和62.5％，其余三個蛋白免疫保護率均為25％。組織病理學試驗結(jié)果顯示，免疫組存活動物肺組織表現(xiàn)出輕微病理變化。這些結(jié)果證明IVI抗原作為APP的候選疫苗可以提高部分的免疫保護。

取本發(fā)明6種體內(nèi)誘導抗原，加上疫苗上常用的輔料，如弗氏完全佐劑，制成疫苗，其中，制劑可以是注射制劑。其中，rGalT，rAPL_1166和rHflX的保護率較高，rGalT的保護率最高，取得了意料不到的效果。

本發(fā)明6種體內(nèi)誘導抗原可以有效促進淋巴細胞增殖，刺激機體產(chǎn)生胸膜肺炎放線桿菌特異性抗體以及γ-干擾素、IL-4等細胞因子，保護性強，并且穩(wěn)定性強，安全性好，臨床應用前景優(yōu)良。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學

<120> 胸膜肺炎放線桿菌的體內(nèi)誘導抗原及其應用

<130> GY151-17P1091

<150> 201610825560.X

<151> 2016-09-14

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 197

<212> PRT

<213> 胸膜肺炎放線桿菌RnhB蛋白

<400> 1

Met Ser Thr Asn Phe Ile Tyr Pro Asn Ala His Leu Ile Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Glu Val Gly Arg Gly Pro Leu Val Gly Ala Val Val Thr Ala Ala

20 25 30

Val Ile Leu Ala Pro Asn Asn Pro Ile Glu Gly Leu Ala Asp Ser Lys

35 40 45

Lys Leu Ser Glu Lys Lys Arg Leu Leu Leu Ala Glu Glu Ile Lys Ala

50 55 60

Lys Ala Leu Cys Trp Ser Leu Gly Arg Ala Glu Pro Glu Glu Ile Asp

65 70 75 80

Arg Leu Asn Ile Leu His Ala Thr Met Leu Ala Met Gln Arg Ala Val

85 90 95

Ala Gly Leu Asn Ile Gln Pro Asp Phe Val Leu Val Asp Gly Asn Arg

100 105 110

Ile Pro Thr Leu Pro Met Pro Ala Gln Ala Val Ile Lys Gly Asp Ser

115 120 125

Leu Val Ala Glu Ile Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val Ala Arg

130 135 140

Asp Gln Glu Met Ala Glu Leu Asp Val Gln Tyr Pro Glu Tyr Gly Phe

145 150 155 160

Ala Lys His Lys Gly Tyr Pro Thr Lys Leu His Phe Glu Lys Leu Glu

165 170 175

Gln Phe Gly Ala Thr Pro Phe His Arg Lys Ser Phe Ala Pro Val Lys

180 185 190

Lys Ile Leu Gly Leu

195

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> 胸膜肺炎放線桿菌GalU蛋白

<400> 2

Met Lys Val Ile Ile Pro Val Ala Gly Leu Gly Thr Arg Met Leu Pro

1 5 10 15

Ala Thr Lys Ala Ile Pro Lys Glu Met Leu Thr Ile Ala Asp Lys Pro

20 25 30

Leu Ile Gln Tyr Ile Val Asn Glu Cys Val Ala Ala Gly Ile Lys Glu

35 40 45

Ile Val Leu Val Thr His Ser Ser Lys Asn Ala Ile Glu Asn His Phe

50 55 60

Asp Thr Ser Phe Glu Leu Glu Thr Met Leu Glu Lys Arg Val Lys Arg

65 70 75 80

Gln Leu Leu Glu Glu Val His Ser Ile Val Pro Lys Asp Val Thr Leu

85 90 95

Met His Val Arg Gln Gly Gln Ala Lys Gly Leu Gly His Ala Val Leu

100 105 110

Cys Gly Arg Ala Val Val Gly Asn Glu Pro Phe Ala Val Val Leu Pro

115 120 125

Asp Val Ile Leu Ala Asp Phe Thr Ala Asn Gln Lys Thr Glu Asn Leu

130 135 140

Ala Ala Met Ile Lys Arg Phe Asn Glu Thr Gln His Ser Gln Ile Met

145 150 155 160

Val Ala Pro Val Pro Arg Glu Asp Val Ser Ser Tyr Gly Val Ala Asp

165 170 175

Cys Ala Gly Val Glu Ile Pro Ala Gly Glu Thr Ala Lys Ile Val Lys

180 185 190

Met Val Glu Lys Pro Ser Val Glu Glu Ala Pro Ser Asn Leu Ala Val

195 200 205

Val Gly Arg Tyr Val Phe Ser Ala Gly Ile Trp Asp Leu Leu Glu Lys

210 215 220

Thr Pro Val Gly Val Gly Asp Glu Ile Gln Leu Thr Asp Ala Ile Asp

225 230 235 240

Met Leu Ile Glu Gln Glu Thr Val Glu Ala Phe His Met Thr Gly Arg

245 250 255

Thr Phe Asp Cys Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Met Gln Ala Phe Thr Glu

260 265 270

Tyr Ser Leu Arg His Asp Lys Phe Gly Asn Asp Phe Lys Glu Phe Ile

275 280 285

Lys Lys Leu Ala Lys Thr Leu

290 295

<210> 3

<211> 349

<212> PRT

<213> 胸膜肺炎放線桿菌GalT蛋白

<400> 3

Met Ser Gln Gln Phe Ile Leu Asn Asp His Pro His Arg Arg Phe Asn

1 5 10 15

Pro Leu Lys Asn Gln Trp Ile Leu Val Ser Pro His Arg Ala Lys Arg

20 25 30

Pro Trp Gln Gly Gln Gln Glu Glu Thr Val Ala Asp Asn Lys Pro Ser

35 40 45

Tyr Asp Pro Thr Cys Tyr Leu Cys Pro Gly Asn Lys Arg Ile Thr Gly

50 55 60

Glu Gln Asn Pro Val Tyr Ser Lys Pro Phe Val Phe Lys Asn Asp Phe

65 70 75 80

Ser Ala Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ala Pro Glu Ala Gly Ser Asp Pro

85 90 95

Leu Phe Gln Ile Ser His Thr Gln Gly Glu Ser Arg Val Ile Cys Phe

100 105 110

Ser Pro Asp His Ser Lys Thr Leu Pro Gln Leu Ser Val Ala Glu Ile

115 120 125

Glu Gln Val Val Gln Val Trp Gln Glu Gln Ala Asn Glu Leu Lys Thr

130 135 140

Arg Tyr Gln Trp Val Gln Ile Phe Glu Asn Lys Gly Ser Met Met Gly

145 150 155 160

Cys Ser Asn Pro His Pro His Gly Gln Ile Trp Ala Ser Asn Phe Leu

165 170 175

Pro Asn Glu Ile Ala Ile Glu Asp Glu Cys Gln Ala Asn Tyr Phe Ala

180 185 190

Gln Tyr Gly Arg Pro Leu Leu Leu Asp Tyr Ala Glu Arg Glu Leu Thr

195 200 205

Lys Lys Glu Arg Ile Val Val Glu Thr Glu Asp Trp Ile Ala Val Val

210 215 220

Pro Tyr Trp Ala Gly Trp Pro Phe Glu Thr Leu Leu Leu Pro Lys His

225 230 235 240

Lys His Phe Lys Arg Ile Thr Asp Leu Asn Glu Ala Glu Arg Ala Asp

245 250 255

Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Leu Thr Thr Arg Tyr Asp Asn Leu Phe

260 265 270

Asn Ile Ser Phe Pro Tyr Ser Met Gly Phe His Phe Ala Pro Phe Asn

275 280 285

Glu Ser Asp Asn Pro His Trp Gln Leu His Ala His Phe Tyr Pro Pro

290 295 300

Leu Leu Arg Ser Ala Thr Val Arg Lys Phe Met Val Gly Tyr Glu Met

305 310 315 320

Met Ala Glu Ser Gln Arg Asp Leu Thr Pro Glu Gln Ala Ala Glu Arg

325 330 335

Leu Asn Ala Val Ser Asp Ser Val His Tyr Lys Asn Gln

340 345

<210> 4

<211> 198

<212> PRT

<213> 胸膜肺炎放線桿菌Apl_1061蛋白

<400> 4

Met Lys Lys Phe Met Thr Met Thr Ser Ile Leu Ala Leu Ser Ser Met

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ser Phe Ala Asn Ala Glu Glu Thr Thr Ala Gln Ala Gln

20 25 30

Asn Asn Val Gln Thr Glu Met Pro Ala Thr Ala Glu Lys Ala Val Pro

35 40 45

Val Ile Gly Gln Gln Ala Val Glu Phe Thr Arg Lys Ala Ala Asp Gln

50 55 60

Met Met Gln Gly Gln Gly Arg Gly Gln Asn Phe His Ser Phe His His

65 70 75 80

Asn Gly Lys His Pro Tyr Asp Met Met Arg Met Met Ala Tyr His His

85 90 95

Pro His Gln Phe Gly Gly Tyr Lys Pro Gln Gly Phe Ile Asp Gln Asn

100 105 110

Ala Val Ala Lys Asp Ala Lys Ala Ala Leu Glu Ala Lys Asp Arg Ser

115 120 125

Phe Val Gln Leu Glu Gly Ser Ile Ser Lys Gln Val Asn Asp Thr Glu

130 135 140

Tyr Thr Phe Val Asp Ser Thr Gly Gln Ile Lys Ile Glu Val Pro Pro

145 150 155 160

Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ser Val Gly Pro Gln Asp Lys Val Arg Ile

165 170 175

Asp Gly Ile Leu Asp Lys Gln Trp Glu Gln Pro Glu Ile Lys Val Lys

180 185 190

Asn Ile Thr Arg Leu Lys

195

<210> 5

<211> 251

<212> PRT

<213> 胸膜肺炎放線桿菌Apl_1166蛋白

<400> 5

Met Lys Lys Ser Ile Tyr Asp Thr Pro Ile Phe Phe Glu Arg Tyr Gln

1 5 10 15

Gln Leu Arg Glu Asn Pro Ile Ser Met Asn Glu Val Val Glu Lys Pro

20 25 30

Thr Met Phe Ser Leu Leu Pro Asp Leu Thr Asn Lys Lys Val Leu Asp

35 40 45

Leu Gly Cys Gly Thr Gly Val His Leu Ala His Tyr Leu Glu Leu Gly

50 55 60

Ala Ser Lys Val Val Gly Leu Asp Leu Ser Glu Leu Met Leu Lys Gln

65 70 75 80

Ala Glu Ser Asp Leu Ala Lys Asn Trp Gln Lys Ser Thr Ala Phe Ser

85 90 95

Leu His Cys Leu Pro Met Glu Gln Leu Asp Lys Ile Pro Glu Asp Asn

100 105 110

Phe Asp Val Val Thr Ser Ser Phe Ala Phe His Tyr Ile Glu Asp Phe

115 120 125

Ala Asp Leu Leu Ala Lys Ile Ser Ala Lys Met Thr Ala Cys Gly Thr

130 135 140

Leu Ile Phe Ser Gln Glu His Pro Ile Val Thr Cys Tyr Lys Asp Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Trp Glu Lys Asn Glu Gln Lys Gln Gln Val Ala Tyr Arg Leu

165 170 175

Asn Phe Tyr Arg Asp Glu Gly Glu Arg Asp Arg Ser Trp Phe Gln Gln

180 185 190

Ala Phe Lys Thr Tyr His Arg Thr Met Ala Thr Ile Cys Asn Gln Leu

195 200 205

Ile Gln Ala Glu Phe Glu Ile Val Gln Val Glu Glu Pro Met Leu Ala

210 215 220

Glu Gln Pro Gln Trp His Asn Glu Phe Lys Asp Leu Gln His Arg Pro

225 230 235 240

Pro Leu Leu Phe Ile Lys Ala Val Lys Lys Asn

245 250

<210> 6

<211> 407

<212> PRT

<213> 胸膜肺炎放線桿菌HflX蛋白

<400> 6

Met Glu Phe Gln Thr Leu Ala Glu Ser Ala Gly Val Glu Ile Leu Ala

1 5 10 15

Thr Leu Thr Thr Ser Arg Ser Ala Pro His Ile Lys Tyr Phe Val Gly

20 25 30

Gln Gly Lys Ala Asp Glu Ile Ala Gln Ala Val Lys Asp Leu Glu Ala

35 40 45

Thr Val Val Leu Val Asn His Glu Leu Ser Pro Ser Gln Thr Arg Asn

50 55 60

Leu Gln Ala Leu Cys Glu Cys Arg Val Val Asp Arg Thr Gly Leu Ile

65 70 75 80

Leu Asp Ile Phe Ala Gln Arg Ala Arg Ser His Glu Gly Lys Leu Gln

85 90 95

Val Glu Leu Ala Gln Leu Lys His Leu Ala Thr Arg Leu Val Arg Arg

100 105 110

Leu Gly Asn Gln Asp Gln Gln Lys Gly Gly Ala Val Gly Leu Arg Gly

115 120 125

Pro Gly Glu Thr Gln Leu Glu Thr Asp Arg Arg Leu Ile Lys Val Arg

130 135 140

Ile Gln Gln Leu Gln Asn Arg Leu Glu Lys Val Asn Lys Gln Arg Ser

145 150 155 160

Gln Asn Arg Lys Thr Arg Gln Lys Ala Asp Ile Pro Thr Val Ser Leu

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Asn Ala Gly Lys Ser Thr Leu Phe Asn Ala Ile Thr

180 185 190

Asn Ala Gly Val Tyr Ala Ala Asp Gln Leu Phe Ala Thr Leu Asp Pro

195 200 205

Thr Leu Arg Arg Met Gln Ile Gln Asp Val Gly Thr Thr Ile Leu Ala

210 215 220

Asp Thr Val Gly Phe Ile Arg Phe Leu Pro His Asp Leu Val Ser Ala

225 230 235 240

Phe Lys Ser Thr Leu Gln Glu Thr Thr Glu Ala Ser Leu Leu Leu His

245 250 255

Val Ile Asp Ala Ala Asp Asp Arg Lys Asn Glu Asn Ile Asp Ala Val

260 265 270

Asn Gln Val Leu Asp Glu Ile Gly Ala Leu Asp Ile Pro Thr Leu Leu

275 280 285

Val Tyr Asn Lys Val Asp Lys Leu Glu Gly Ile Val Pro His Ile Glu

290 295 300

Arg Asn Asp Asp Gly Lys Pro Val Ala Val Tyr Leu Ser Ala Gln Ala

305 310 315 320

Asn Gln Gly Ile Asp Leu Leu Tyr Glu Ala Ile Arg Glu Cys Leu Arg

325 330 335

Asn Glu Leu Val Cys Glu Lys Val Leu Leu Pro Ala Thr Ala Gly Gln

340 345 350

Ile Tyr Thr Gln Leu His Leu Gln His Cys Ile Lys Asn Glu Ser Phe

355 360 365

Asn Gln Phe Gly Asp Arg Leu Val Glu Val Glu Val Asp Leu Val Gln

370 375 380

Trp Asn Lys Trp Leu Lys Gln Phe Pro Glu Leu Thr Glu Tyr Ile Glu

385 390 395 400

Phe Ala Ser Trp Glu Glu Asn

405

<210> 7

<211> 595

<212> DNA

<213> rRnhB的目標基因片段為

<400> 7

tttataaacc taagattttc ttcaccgggg cgaagctctt tcggtgaaaa ggggttgccc 60

cgaattgttc cagtttttca aaatgtagtt tagtcggata gcctttatgc tttgcaaagc 120

cgtattccgg atattgcaca tctaattcag ccatttcctg atctcgggca actttggcta 180

aaatggaagc tgcgctgatc tcggcaacta aactatctcc ttttatgacc gcttgtgccg 240

gcatcggtaa agttggaata cggttgccgt ccaccaacac gaaatcgggc tgaatattga 300

gtccggcaac cgcccgctgc atagcgagca ttgttgcgtg caagatattc aaccgatcga 360

tttcttccgg ttcggcacgc cctaaagacc aacaaagcgc ttttgcttta atttcctccg 420

ctaaaagcaa acgcttcttc tccgacagtt ttttagagtc ggctaatcct tcaatcggat 480

tattcggagc taaaatcacg gcagcggtga ccaccgcacc gactaacggg cctctaccga 540

cttcgtccac acctgcgatc aagtgggcat taggataaat gaaatttgta ctcat 595

<210> 8

<211> 888

<212> DNA

<213> rGalU的目標基因片段

<400> 8

ttataacgtt ttagctaatt ttttaataaa ttctttaaag tcattgccga acttatcatg 60

acgtaaacta tattcggtaa atgcctgcat ataacctaat ttatcgccgc agtcgaaagt 120

acgacctgtc atatgaaatg cttctaccgt ttcttgctca attaacatat caatagcatc 180

ggttaattgg atctcatcgc ctacaccaac cggtgttttc tctaataaat cccaaatacc 240

tgcggagaat acgtaacgac cgacaaccgc taaattagaa ggtgcttctt ctacactcgg 300

tttttcaacc atcttcacga tttttgcagt ttcgccggca ggaatttcca cgcctgcaca 360

atccgctacg ccatagctac ttacatcttc tctcggtacc ggtgcaacca taatttggct 420

atgttgtgtt tcgttgaaac gtttgatcat cgccgcaagg ttttccgttt tttgattcgc 480

agtaaaatcg gctaaaatta catccggtaa tacgactgca aaaggttcgt taccgactac 540

cgctctaccg cataataccg catgacctaa acctttagct tgaccttgac gtacatgcat 600

taatgtaacg tcttttggca caattgagtg cacttcttct aataattggc gtttaacacg 660

tttttccaac atagtttcaa gttcaaaaga cgtatcaaaa tggttctcga tagcattttt 720

tgaagaatga gtcactaata cgatctcttt aataccagcc gctacacatt cgttcacgat 780

atattgaata agcggtttat ccgcaatcgt cagcatttct tttggaatcg cttttgttgc 840

aggaagcatt cgcgtcccta aacccgctac cggaataatt actttcat 888

<210> 9

<211> 1050

<212> DNA

<213> rGalT的目標基因片段

<400> 9

atgagccaac aatttatcct aaacgatcac cctcatcgtc gttttaatcc gttaaaaaat 60

caatggattt tagtttctcc gcatcgtgcg aaacgtccgt ggcaaggtca gcaggaagaa 120

acggttgcgg ataataaacc gagctatgat ccgacttgtt atctctgtcc gggaaataaa 180

cgcattaccg gcgaacaaaa tcccgtttat agcaaacctt tcgtctttaa aaacgatttc 240

tccgcactac tgccggatac accggcgccg gaagccggtt ccgatccgct tttccaaatt 300

tcacatactc aaggcgaaag ccgtgtaatt tgcttctcgc ctgatcacag taaaacctta 360

ccgcaacttt cggtggctga aattgagcaa gtggtacaag tctggcaaga gcaagcgaat 420

gagttaaaaa cacgttatca gtgggtacaa atttttgaaa acaaaggctc gatgatgggc 480

tgctctaatc cgcacccgca cggtcaaatt tgggcaagca atttcttacc gaacgaaatt 540

gcgattgaag acgaatgtca ggcaaattac tttgctcaat acggtcgtcc attgcttctt 600

gattatgccg agcgtgaatt aactaaaaaa gaacgtatcg tcgtcgaaac cgaagactgg 660

attgcagtgg tgccttactg ggctggctgg ccgtttgaaa ctttactgtt gccgaaacac 720

aagcacttta aacgcattac cgatttaaac gaagcggaac gagcggattt agctctcgca 780

cttaaaaagc taaccactcg ctacgataac ttatttaata tcagtttccc atattcgatg 840

ggcttccatt tcgctccgtt taatgaaagt gataatccgc attggcaact tcacgcccat 900

ttctatccgc cgttgttacg ttcggcaacc gtgcgtaaat ttatggtcgg ctacgagatg 960

atggcggaaa gtcagcgaga tctgacaccg gaacaagcgg cggaaagatt aaatgctgtg 1020

agcgacagcg ttcactataa aaatcaatag 1050

<210> 10

<211> 597

<212> DNA

<213> rApl_1061的目標基因片段

<400> 10

atgaaaaaat ttatgacaat gacttctatt cttgcacttt cttctatggc tttaacttcc 60

ttcgctaatg cggaagaaac gaccgcacaa gcgcaaaata acgtacaaac cgaaatgccg 120

gcaactgcgg aaaaagcggt accggttatc gggcaacaag cggttgaatt tacgcgtaaa 180

gcggcggatc aaatgatgca aggacaaggt cgcggacaga acttccattc gtttcatcac 240

aacggcaaac atccgtacga tatgatgaga atgatggcgt atcatcaccc gcatcagttc 300

ggcggctata aaccgcaagg ttttattgat caaaatgcgg tggcgaaaga tgcgaaagcg 360

gcgttagaag cgaaagatcg ttcgttcgtt caattagaag gttcgatttc aaaacaagta 420

aacgataccg aatacacttt tgtcgatagt accggtcaaa tcaaaattga agtgccgcca 480

agcttatggc gcggtttatc ggtaggtcca caggataaag ttcgtattga cggtatttta 540

gataaacaat gggaacaacc tgaaattaaa gtgaaaaaca tcacgagatt gaaatag 597

<210> 11

<211> 756

<212> DNA

<213> rApl_1166的目標基因片段

<400> 11

ttgaaaaaaa gtatttacga taccccgatt ttctttgaac gttatcaaca attacgtgaa 60

aacccaatca gtatgaatga agtggtggaa aagcctacga tgttttcact tttaccggat 120

cttaccaata agaaagtgtt agatttgggt tgtggtaccg gggtgcattt ggcgcattat 180

ttagaattag gtgcgagtaa agttgtcggg ctggatttat cggagctaat gctaaaacag 240

gcggaaagtg atttagcaaa aaattggcaa aaatcgaccg ctttctcact gcactgcttg 300

ccaatggaac aattagataa aattccggaa gataattttg atgtggtcac cagttcattt 360

gcgtttcact atattgagga ttttgccgat ttacttgcaa aaatttctgc aaaaatgacc 420

gcttgcggca cattgatttt ttcccaagaa catccgattg tcacttgcta taaagacggc 480

tatcgttggg agaaaaatga gcaaaaacaa caagttgctt atcgtttaaa tttctatcga 540

gatgaggggg agcgagatag aagttggttc caacaagcat tcaaaaccta tcatcgcacg 600

atggcaacga tttgcaatca gctgattcaa gccgagtttg aaatcgtgca agtggaagag 660

ccgatgctgg cggaacaacc gcaatggcat aatgagttta aagatctcca acatcgcccg 720

ccacttttat ttattaaggc agttaaaaaa aattaa 756

<210> 12

<211> 1224

<212> DNA

<213> rHflX的目標基因片段

<400> 12

atggaattcc aaacgcttgc cgaatcggcc ggtgttgaaa ttcttgccac attaactact 60

tctcgttccg caccgcatat caaatatttt gtcggacaag gcaaagccga tgaaatcgca 120

caagcggtta aagatttaga agctacggtt gttttagtca atcacgagct tagtccgtca 180

caaacccgta atttacaagc gttatgcgaa tgtcgagttg tggacagaac cggtctgatt 240

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caacttaaac acttggcaac acgtttggta cgtcgtttgg gcaatcagga tcagcaaaag 360

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aatgcgggga aatcgacttt attcaatgcg attactaatg ccggtgttta tgcggcggat 600

cagttattcg caacgcttga tccgacttta cgccgaatgc agattcaaga tgtcggcact 660

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