本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬瘟病毒配體表位多肽SE241及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。是豬最嚴(yán)重的傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為烈性傳染病，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定的一類傳染病。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員之一，其基因組為線狀單股正鏈RNA，可以編碼12種成熟病毒蛋白，其中C、Erns、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白，其余為非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白Erns、E1和E2在病毒對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別、吸附及病毒抗原性上具有重要作用。因此，對(duì)CSFV結(jié)構(gòu)蛋白的研究主要集中在此三種蛋白上。

病毒配體通常是指與病毒受體發(fā)生特異性結(jié)合的病毒表面分子，即病毒的吸附蛋白。病毒受體是指位于宿主細(xì)胞表面能夠識(shí)別病毒配體并與之發(fā)生特異性結(jié)合的分子復(fù)合物。病毒配體與靶細(xì)胞表面病毒受體的特異性結(jié)合是病毒感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所以阻斷這兩者的結(jié)合可以有效抑制病毒性疾病感染的發(fā)生。近年來(lái)，以病毒受體或病毒配體作為抗病毒藥物的靶點(diǎn)，篩選抗病毒的多肽藥物和疫苗成為研究的熱點(diǎn)。

中國(guó)專利公開(kāi)了豬瘟病毒CSFV E2蛋白配體表位多肽及其應(yīng)用(CN2011101126535)，其公開(kāi)的多肽氨基酸序列為VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF，其分子量為5.73kDa；并以PK-15細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過(guò)CSFV的感染、收獲，測(cè)定了CSFV的TCID₅₀和感染比，進(jìn)行合成多肽與靶細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)、病毒阻斷試驗(yàn)和多肽阻斷CSFV感染靶細(xì)胞的試驗(yàn)，篩選了特異性結(jié)合靶細(xì)胞的能夠抑制病毒感染的配體表位多肽，對(duì)CSFV E2蛋白配體表位進(jìn)行了初步定位。但是由于上述專利的多肽氨基酸序列較長(zhǎng)，配體定位不夠精確，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中合成成本過(guò)高，其應(yīng)用推廣受到很大的限制，因此對(duì)配體表位多肽的精確定位顯得尤為重要。目前，尚未見(jiàn)E2蛋白配體表位精確定位的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供豬瘟病毒配體表位多肽SE241及其應(yīng)用，該多肽可以有效結(jié)合PK-15細(xì)胞，并且SE241和PK-15細(xì)胞的結(jié)合可以被CSFV阻斷，確定SE241為CSFV結(jié)合靶細(xì)胞的配體表位。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

豬瘟病毒配體表位多肽SE241，所述的多肽SE241的氨基酸序列為：VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSC。

一種豬瘟病毒配體表位多肽SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞和CFSV阻斷SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞試驗(yàn)中的應(yīng)用。

一種豬瘟病毒配體表位多肽SE241在抑制CFSV感染PK-15細(xì)胞中的應(yīng)用。

一種豬瘟病毒配體表位多肽SE241在研制抑制CSFV感染靶細(xì)胞的藥物或疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明設(shè)計(jì)合成位于SE24多肽上的短肽，得到了多肽SE241。多肽SE241與PK-15細(xì)胞的結(jié)合和阻斷試驗(yàn)顯示，多肽SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著高于FITC對(duì)照組，CSFV阻斷SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯低于結(jié)合試驗(yàn)，證實(shí)多肽SE241能夠有效結(jié)合PK-15細(xì)胞，并且SE241和PK-15細(xì)胞的結(jié)合可以被CSFV阻斷，確定SE241為CSFV結(jié)合靶細(xì)胞的配體表位。同時(shí)，本發(fā)明SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度高于SE24，被CSFV阻斷效果顯著高于SE24，證明配體表位SE241特異性比SE24強(qiáng)。

2、本發(fā)明公開(kāi)的多肽氨基酸序列較短，對(duì)豬瘟病毒結(jié)合靶細(xì)胞的配體表位進(jìn)一步精確定位，在實(shí)際應(yīng)用中比現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的多肽成本大幅降低。

3、本發(fā)明通過(guò)結(jié)合試驗(yàn)和阻斷試驗(yàn)相互印證，CSFV與PK-15細(xì)胞的病毒受體結(jié)合后，阻止了多肽與病毒受體的結(jié)合，進(jìn)而證明多肽SE241和CSFV結(jié)合在同類細(xì)胞受體。提示該多肽是預(yù)防和治療豬瘟的理想藥物靶標(biāo)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研制新型抗病毒藥物和疫苗奠定基礎(chǔ)。同時(shí)為豬瘟的防治提供了新的途徑。

附圖說(shuō)明

圖1為細(xì)胞免疫化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)繁殖的CSFV(200×)。圖中，A為感染CSFV的PK-15細(xì)胞；B為空白對(duì)照細(xì)胞。

圖2為多肽SE241的LC-MS/MS圖譜。橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比值(m/z)，縱坐標(biāo)表示離子流的強(qiáng)度(最強(qiáng)離子流強(qiáng)度為100％)。

圖3為多肽SE241與PK-15細(xì)胞結(jié)合與阻斷試驗(yàn)結(jié)果。圖中，A為FITC對(duì)照；B為多肽SE241與PK-15細(xì)胞結(jié)合；C為CSFV阻斷多肽SE241與PK-15細(xì)胞的結(jié)合。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明對(duì)所用的豬瘟病毒石門株(細(xì)胞毒)進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，以確定該株石門株(細(xì)胞毒)CSFV能夠滿足本發(fā)明的使用要求。

1、CSFV的ELISA效價(jià)測(cè)定

將豬瘟病毒石門株(細(xì)胞毒)感染培養(yǎng)好的單層PK-15細(xì)胞，37℃經(jīng)48-56h培養(yǎng)后收獲病毒，反復(fù)凍融3次破碎細(xì)胞裂解出病毒，4℃、3000rpm離心10min，棄去沉淀，上清即為繁殖病毒液。用豬瘟病毒抗原檢測(cè)試劑盒(SERELISA HCV Ag Mono Indirect產(chǎn)品)檢測(cè)收獲的病毒液。將病毒液1:50、1:100、1:200、1:400倍稀釋，每個(gè)稀釋度均做6個(gè)重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。以與陰性對(duì)照OD₄₅₀值的比值為2.2倍且總值≥0.2的稀釋度為病毒的效價(jià)，從表中可以看出，病毒液的效價(jià)為1:200。

表1檢測(cè)豬瘟病毒的效價(jià)

注：“+”代表陽(yáng)性，“－”代表陰性。

2、CSFV的TCID₅₀測(cè)定

檢測(cè)病毒培養(yǎng)物的感染力，即毒力。病毒毒力的測(cè)定有2種方法，一種方法是采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定半數(shù)致死量(LD₅₀)或在雞胚上測(cè)定半數(shù)雞胚感染量(ELD₅₀)；另一種方法是在組織細(xì)胞上測(cè)定半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCD₅₀又稱TCID₅₀)。TCID₅₀可以用Reed-Muench兩氏法、內(nèi)插法、Karber法計(jì)算。本發(fā)明采用固定PK-15細(xì)胞稀釋病毒法計(jì)算繁殖病毒的TCID₅₀，結(jié)果見(jiàn)表2，在病毒液稀釋度為10^-1、10^-2、10^-3時(shí)，接種的4孔細(xì)胞全部感染，稀釋度為10^-4是，有2孔感染，稀釋度為10^-5、10^-6時(shí)全部不感染，正常細(xì)胞作為空白對(duì)照全部不感染。按照上述試驗(yàn)結(jié)果利用Reed-Muench兩氏法計(jì)算TCID₅₀。

表2固定PK-15細(xì)胞稀釋病毒法計(jì)算CSFV的TCID₅₀

本試驗(yàn)中高于50％病毒稀釋度的對(duì)數(shù)為–3，距離比例為0.5，稀釋度對(duì)數(shù)之間的差為–1。

LogTCID₅₀＝0.5×(–1)+(–3)＝–3.5

TCID₅₀＝10^-3.5，含義為將病毒液稀釋10^3.5倍，每孔接種100μL病毒液，可使半數(shù)細(xì)胞發(fā)生感染。

3、CSFV感染復(fù)數(shù)(MOI)的測(cè)定

感染復(fù)數(shù)或感染比(multiplicity of infection)：指在一個(gè)系統(tǒng)中感染病毒的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比。將2×TCID₅₀CSFV感染PK-15細(xì)胞后，用細(xì)胞免疫化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)繁殖的CSFV，CSFV感染PK-15細(xì)胞后顯棕紅色(圖1A)，正常對(duì)照PK-15細(xì)胞不顯色(圖1B)。計(jì)算MOI時(shí)要計(jì)數(shù)感染細(xì)胞和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔的細(xì)胞總數(shù)，然后分析試驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，取一滴細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計(jì)算斜對(duì)角線上四個(gè)大方格里的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算公式為：

每孔細(xì)胞總數(shù)＝n/4×稀釋倍數(shù)×10⁴×細(xì)胞液毫升數(shù)(n為四個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù))。

結(jié)果：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中感染的每孔細(xì)胞平均數(shù)為150個(gè)；計(jì)數(shù)板四個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù)為280個(gè)，每孔細(xì)胞液毫升數(shù)為0.1ml，稀釋倍數(shù)為10^-1倍，經(jīng)計(jì)算得知每孔細(xì)胞的總數(shù)為7.0×10³個(gè)，所以培養(yǎng)繁殖病毒的MOI為：1:47。

4、結(jié)論

通過(guò)測(cè)定CSFV的ELISA效價(jià)、TCID₅₀和感染復(fù)數(shù)(MOI)，證實(shí)了該株石門株(細(xì)胞毒)CSFV可以滿足本發(fā)明研究的需要。

實(shí)施例2、合成多肽

研究表明，多肽SE24(氨基酸序列：CVHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF)可以有效結(jié)合PK-15細(xì)胞，可以有效抑制CSFV感染PK-15細(xì)胞，且CSFV可以阻斷SE24結(jié)合PK-15細(xì)胞，因此證實(shí)多肽SE24為豬瘟病毒CSFV E2蛋白配體表位多肽。為進(jìn)一步精確定位多肽SE24上的配體表位信息，設(shè)計(jì)并合成了位于多肽SE24上的1條短肽，合成肽SE241的LC-MS/MS圖譜見(jiàn)圖2，序列如下：

SE241：VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSC(SEQ ID NO：1)

實(shí)施例3、SE241與PK-15細(xì)胞的結(jié)合和阻斷試驗(yàn)

取生長(zhǎng)良好的PK15細(xì)胞，PBS洗3次，用1％胰蛋白酶進(jìn)行消化細(xì)胞，約消化1min，棄掉消化液，加含10％胎牛血清的DMEM進(jìn)行懸浮，1000rpm離心5min，用適量PBS重懸PK15細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×10⁶個(gè)/ml，備用。

SE241與PK-15細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)：

將上述PK15細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1.0×10⁶個(gè)/ml)，混合均勻置于EP管中，每管中100μl，即每管中細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.0×10⁵個(gè)。于管中加入多肽SE241(已FITC標(biāo)記)使SE241終濃度達(dá)到0.2mg/ml，同時(shí)設(shè)FITC陽(yáng)性對(duì)照，做三個(gè)重復(fù)，冰上避光作用2h，PBS洗3次，每次洗1000rpm離心5min，最后一次離心后加800μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，判定分析結(jié)果。

CSFV阻斷SE241與PK15細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)：

取1.0ml上述PK15細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1.0×10⁶個(gè)/ml)，加200μl TCID₅₀為10^-3.5的CSFV液，混合均勻，4℃作用40min。離心棄掉CSFV液，再用PBS洗2次，最后用PBS重懸細(xì)胞，混合均勻后分裝于EP管中，使每管中細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.0×10⁵個(gè)。

于管中加入多肽SE241(已FITC標(biāo)記)使SE241終濃度達(dá)到0.2mg/ml，同時(shí)設(shè)FITC陽(yáng)性對(duì)照，做三個(gè)重復(fù)，冰上避光作用2h，PBS洗3次，每次洗1000rpm離心5min，最后一次離心后加800μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，判定分析結(jié)果。

結(jié)合試驗(yàn)和阻斷試驗(yàn)結(jié)果表明，多肽SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著高于FITC陽(yáng)性對(duì)照組，CSFV阻斷SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯低于結(jié)合試驗(yàn)(圖3、表3)，證實(shí)多肽SE241可以有效結(jié)合PK-15細(xì)胞，并且SE241和PK-15細(xì)胞的結(jié)合可以被CSFV阻斷，確定SE241為CSFV結(jié)合靶細(xì)胞的配體表位。進(jìn)一步精確了CSFV結(jié)合靶細(xì)胞的配體表位信息，為研制抑制CSFV感染靶細(xì)胞的藥物或疫苗奠定基礎(chǔ)。

表3多肽SE241與PK-15細(xì)胞結(jié)合和CSFV阻斷多肽結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P＜0.05)；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P＞0.05)。

表4 SE24、SE241多肽與PK-15細(xì)胞結(jié)合和CSFV阻斷多肽結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果比較

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P＜0.05)；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P＞0.05)。

從表4可以看出SE24、SE241與PK15細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)熒光強(qiáng)度差異不顯著，但SE241結(jié)合試驗(yàn)平均熒光強(qiáng)度高于SE24；SE24、SE241被CSFV阻斷試驗(yàn)熒光強(qiáng)度差異顯著，證明CSFV更有效阻斷SE241和PK15細(xì)胞結(jié)合。

實(shí)施例4、其它短肽的結(jié)合驗(yàn)證

通過(guò)以上結(jié)合試驗(yàn)和阻斷試驗(yàn)結(jié)果表明，SE241可以有效結(jié)合PK-15細(xì)胞，CSFV可以阻斷SE241結(jié)合PK-15細(xì)胞。為再進(jìn)一步精確定位SE24多肽上的配體表位信息，設(shè)計(jì)并合成了位于SE24多肽上的3條短肽，序列如下：

SE24-1：CVHASDERLGPMPCRPKEIG(SEQ ID NO：2)

SE24-2：PKEIGSSAGPVRKTSCTFNYA(SEQ ID NO：3)

SE24-3：TFNYAKTGKNKYYEPRDSYF(SEQ ID NO：4)

上述3條短肽經(jīng)過(guò)多次與PK-15細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)，證實(shí)此三條短肽不與PK-15細(xì)胞結(jié)合。

本發(fā)明將SE24多肽設(shè)計(jì)合成1條短肽SE241后，該短肽仍然與靶細(xì)胞結(jié)合，且在結(jié)合試驗(yàn)和病毒阻斷結(jié)合試驗(yàn)表明SE241與靶細(xì)胞結(jié)合和其結(jié)合被豬瘟病毒阻斷的效果明顯高于SE24。證明本發(fā)明的多肽SE241具有很好的特異性和精確性。進(jìn)一步將SE24多肽設(shè)計(jì)合成3條短肽后，3條短肽均不與靶細(xì)胞結(jié)合，說(shuō)明更精確定位CSFV配體表位有待進(jìn)一步篩選研究。

以上所述僅為本發(fā)明最佳的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技學(xué)院

<120> 豬瘟病毒配體表位多肽SE241及其應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys

1 5 10 15

Glu Ile Gly Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys

20 25 30

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro

1 5 10 15

Lys Glu Ile Gly

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Pro Lys Glu Ile Gly Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys

1 5 10 15

Thr Phe Asn Tyr Ala

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg

1 5 10 15

Asp Ser Tyr Phe

20