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一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光的檢測(cè)方法與流程

文檔序號(hào):12056654閱讀:來源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光檢測(cè)方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)預(yù)測(cè)RNA-RNA相互作用區(qū)域;

所述RNA-RNA包括miRNA及其靶基因或lncRNAs及其靶基因;

所述miRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括:利用psRNATarget在線預(yù)測(cè)工具進(jìn)行預(yù)測(cè),所述預(yù)測(cè)方法的規(guī)則包括:最大期望值:0~1.0;互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度:18~19bp;未匹配靶位點(diǎn)的最大能量:15~20;靶位點(diǎn)的側(cè)翼長(zhǎng)度:上游17bp/下游13bp;導(dǎo)致延伸抑制的中央錯(cuò)配范圍:9~11nt;

所述lncRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括:利用Blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算,所述序列互補(bǔ)計(jì)算時(shí)的參數(shù)設(shè)置為E value=1e-10,identity=90%;將所述互補(bǔ)計(jì)算得到的序列再利用RNAplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算,參數(shù)設(shè)置為e=-40;

2)對(duì)所述步驟1)得到的RNA-RNA相互作用區(qū)域內(nèi)序列進(jìn)行多態(tài)性分析,篩選得到多態(tài)性位點(diǎn)作為靶位點(diǎn);

所述多態(tài)性分析的方法包括:

當(dāng)分析對(duì)象為模式物種時(shí),通過物種重測(cè)序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs、InDels位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn),所述位點(diǎn)在群體中的頻率均大于5%;

當(dāng)分析對(duì)象為非模式物種時(shí),通過克隆相互作用區(qū)域cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn),至少利用20個(gè)沒有親緣關(guān)系的個(gè)體進(jìn)行序列多態(tài)性分析;

3)以所述步驟2)得到的相互作用區(qū)域內(nèi)的含1~5個(gè)靶位點(diǎn)的序列為模板,合成相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段;

4)將所述步驟3)得到的任意兩條相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段與飽和熒光染料混合,利用Realtime-PCR進(jìn)行升溫處理,通過相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的熔解;利用Realtime-PCR進(jìn)行降溫處理,通過相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的結(jié)合;

5)根據(jù)所述步驟4)得到的熒光強(qiáng)度繪制熒光隨溫度的變化曲線,曲線的峰值對(duì)應(yīng)的溫度代表寡核苷酸結(jié)合或熔解一半時(shí)所需要的溫度;在降溫處理中,所述峰值對(duì)應(yīng)的溫度越高,則代表RNA-RNA結(jié)合能力越強(qiáng);在升溫處理中,所述峰值的溫度越高,則代表RNA-RNA形成的互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越強(qiáng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法,其特征在于,所述步驟3)寡核苷酸片段的長(zhǎng)度為20~180bp。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法,其特征在于,所述步驟4)中Realtime-PCR的反應(yīng)體系為:每25μl體系包括11.25μl去離子水;0.625μl 10μM的寡核苷酸片段;12.50μl飽和熒光染料。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的熒光檢測(cè)方法,其特征在于,所述飽和熒光染料為L(zhǎng)C Green。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的熒光檢測(cè)方法,其特征在于,所述步驟4)Realtime-PCR的反應(yīng)條件為:

RNA-RNA寡核苷酸序列升溫處理體系:95℃,30s;95℃,30s,每個(gè)循環(huán)降低0.5℃,共40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)記錄熒光強(qiáng)度;

RNA-RNA寡核苷酸序列降溫處理體系:95℃,30s;自然冷卻至室溫(25℃);75℃,30s,每個(gè)循環(huán)提高0.5℃,共40個(gè)循環(huán);每個(gè)循環(huán)記錄熒光強(qiáng)度。

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