本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種用于肺腺癌診治的生物標(biāo)志物，具體地涉及生物標(biāo)志物為FIBIN。

背景技術(shù)：

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤之一。在很多國家其發(fā)病率仍處于高峰。WHO最新統(tǒng)計顯示全球每年有159萬患者死于肺癌。我國腫瘤登記中心2016年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：2015年，我國新發(fā)肺癌病例約73.3萬(男性50.93萬，女性22.4萬)，同期，我國肺癌死亡人數(shù)為61.02萬(男性43.24萬，女性17.78萬)。肺癌己成為我國患病率和死亡率最高的腫瘤，尤其近年女性肺癌患病率明顯升高。目前，外科手術(shù)、化療、放療仍是肺癌治療的主要方法。隨著以手術(shù)為主的多學(xué)科MDT綜合治療的發(fā)展，以及靶向治療和免疫治療的發(fā)展，肺癌的治療取得了長足進步。然而，這些并沒有從根本上改變肺癌高死亡率的現(xiàn)狀，尤其是缺乏靶向基因的肺癌患者總體預(yù)后仍然很差，5年生存率仍徘徊在15％左右。因此，如何提高這些患者的治療效果是臨床迫切需要解決的重大課題。

肺癌按病理類型可以分為小細胞肺癌(small lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC又分為鱗癌、腺癌、大細胞癌、肉瘤樣癌等。隨著對肺癌研究的不斷深入，根據(jù)驅(qū)動基因存在狀況，又把NSCLC分為鱗癌和非鱗非小細胞肺癌，而非鱗非小細胞肺癌主要就是指肺腺癌。目前資料表明，70％的肺腺癌組織都能檢測到驅(qū)動基因，而肺鱗癌中的比例只有20％-30％，并且兩者的驅(qū)動基因種類并不相似。眾所周知，有靶向驅(qū)動基因存在的患者會從靶向治療中明顯獲益。因此可以認為，在分子基因水平肺鱗癌和肺腺癌是“兩種疾病”。

隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，準(zhǔn)醫(yī)學(xué)模式的倡導(dǎo)為肺癌的診斷和治療打開了嶄新的思路。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是基于分子生物信息學(xué)的醫(yī)學(xué)模式，其關(guān)鍵是利用有效的生物標(biāo)志物，進行特異性個體化治療。因此，尋找肺腺癌新的有效的分子生物標(biāo)志物和信號通路，進一步闡明肺腺癌的發(fā)生發(fā)展機制，對當(dāng)今肺腺癌的個體化精準(zhǔn)治療具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于肺腺癌診治的基因生物標(biāo)志物，本發(fā)明所提供的基因生物標(biāo)志物對于人肺腺癌具有較高的靈敏度和特異性，可作為新型生物標(biāo)志物用于肺腺癌的檢測和治療。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了FIBIN基因或其蛋白在制備診斷肺腺癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進一步，所述產(chǎn)品包括芯片、制劑或試劑盒。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測FIBIN基因轉(zhuǎn)錄水平的針對FIBIN基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的FIBIN蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測FIBIN基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括FIBIN蛋白的特異性抗體

本發(fā)明提供了一種芯片、制劑或試劑盒，其包括檢測FIBIN基因或其蛋白的試劑，當(dāng)樣本中FIBIN表達顯著下調(diào)時，患者患有肺腺癌或者存在患肺腺癌的風(fēng)險。

進一步，所述試劑包選自：特異性識別FIBIN的探針或特異性性擴增FIBIN的引物；或特異性結(jié)合FIBIN蛋白的抗體或配體。

進一步，所述芯片可用于檢測包括FIBIN基因在內(nèi)的多個基因(例如，與肺腺癌相關(guān)的多個基因)的表達水平；所述試劑盒可用于檢測包括FIBIN基因在內(nèi)的多個基因(例如，與肺腺癌相關(guān)的多個基因)的表達水平。

本發(fā)明提供了上面所述的芯片、制劑或試劑盒在制備診斷肺腺癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述的FIBIN在篩選治療人肺腺癌的潛在物質(zhì)中的用途。

本發(fā)明提供了一種篩選治療肺腺癌潛在物質(zhì)的方法，所述潛在物質(zhì)可以促進、FIBIN基因或其蛋白的表達或活性。

本發(fā)明提供了FIBIN基因或其蛋白在制備預(yù)防或治療肺腺癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進一步，所述藥物組合物包括FIBIN基因、FIBIN蛋白和/或其表達產(chǎn)物的促進劑。

本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療肺腺癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的FIBIN基因、FIBIN蛋白和/或其表達產(chǎn)物的促進劑。

進一步，所述藥物組合物還包括與所述促進劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療肺腺癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。

本發(fā)明的藥物組合物還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了FIBIN的差異表達與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過檢測受試者樣本中FIBIN的表達，可以判斷受試者是否患有肺腺癌或者患有肺腺癌的風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。

基因FIBIN作為潛在的分子靶標(biāo)，為肺腺癌的臨床診斷和治療提供了新的可能，同時為肺腺癌的機理研究提供了理論依據(jù)，為肺腺癌患者的個性化治療提供了新的途徑。

附圖說明

圖1是利用QPCR檢測FIBIN基因在肺腺癌組織中的表達情況圖；

圖2是利用QPCR檢測FIBIN在肺腺癌細胞中的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖3是用CCK-8法檢測FIBIN基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋车挠绊憟D；

圖4是用流式細胞儀檢測FIBIN基因?qū)Ψ蜗侔┘毎蛲龅挠绊憟D；

圖5是利用Transwell小室檢測FIBIN對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響圖；其中圖A是FIBIN對肺腺癌細胞遷移的影響圖；圖B是FIBIN對肺腺癌細胞侵襲的影響圖。

具體的實施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次發(fā)現(xiàn)了肺腺癌中FIBIN呈現(xiàn)特異性低表達。實驗證明，通過特異提高FIBIN的表達平或表達產(chǎn)物的活性，能夠有效地抑制肺腺癌細胞的生長和侵襲，從而達到抑制肺腺癌的效果

生物標(biāo)志物

術(shù)語“生物標(biāo)志物”是其在組織或細胞中的表達水平與正?；蚪】导毎蚪M織的表達水平相比發(fā)生改變的任何基因。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標(biāo)志物基因可具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的核苷酸序列或氨基酸序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標(biāo)志物的表達水平。

在一些實施方案中，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測生物標(biāo)志物的表達水平。利用核酸雜交技術(shù)進行具體DNA和RNA測量的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一些方法涉及電泳分離(例如，用于檢測DNA的Southern印跡和用于檢測RNA的Northern印跡)，但是也可以在不利用電泳分離的情況下進行DNA和RNA的測量(例如，通過斑點印跡)?；蚪MDNA(例如，來自人)的Southern印跡可用于篩選限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，以檢測影響本發(fā)明多肽的遺傳病癥的存在?？梢詸z測所有形式的RNA。

芯片

本發(fā)明的所述的基因芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應(yīng)于FIBIN所示的部分或全部序列。

具體地，可根據(jù)本發(fā)明所述的基因，設(shè)計出適合的探針，固定在固相載體上，形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區(qū)別性的，可訪問的地址為特征的位置)的陣列，每個可尋址位置均含有一個與其相連的特征性寡核苷酸。根據(jù)需要，可將寡核苷酸陣列分成多個亞陣。

在本發(fā)明中，所述固相載體包括塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通過非共價或物理吸附機制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合，最常用的塑料制品為聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板；所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米，由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團，易與抗體(抗原)形成化學(xué)偶聯(lián)，結(jié)合容量大；所述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。

術(shù)語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

術(shù)語“互補的”或“互補性”用于指代通過堿基配對原則相關(guān)的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”與序列“3'-T-C-A-5'”互補?；パa性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對原則匹配。或者，也可在核酸之間存在“完全”或“總”互補性。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間的雜交效率和強度具有顯著的影響。這在擴增反應(yīng)以及依賴核酸之間的結(jié)合的檢測方法中尤其重要。

術(shù)語“嚴(yán)格性”用于指代進行核酸雜交所處的條件：溫度、離子強度和其他化合物(諸如有機溶劑)的存在。在“低嚴(yán)格條件”下，所關(guān)注的核酸序列將與其精確互補序列、具有單個堿基錯配的序列、密切相關(guān)的序列(例如，具有90％或更高同源性的序列)以及只有部分同源性的序列(例如，具有50-90％同源性的序列)雜交。在“中等嚴(yán)格性條件”下，所關(guān)注的核酸序列將只與其精確互補序列、具有單個堿基錯配的序列和密切相關(guān)的序列(例如，90％或更高同源性)雜交。在“高嚴(yán)格性條件”下，所關(guān)注的核酸序列將只與其精確互補序列和(取決于諸如溫度的條件)具有單個堿基錯配的序列雜交。換句話講，在高嚴(yán)格性條件下，可升高溫度以排除與具有單個堿基錯配的序列雜交。

本發(fā)明中針對FIBIN基因的寡核苷酸探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。

本發(fā)明中所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。

所述的FIBIN芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的基因芯片。

試劑盒

本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測FIBIN的表達。

優(yōu)選的，所述的制劑或試劑盒中還含有用于標(biāo)記RNA樣品的標(biāo)記物，以及與所述標(biāo)記物相對應(yīng)的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于：抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

藥物篩選

本發(fā)明提供了FIBIN在篩選人肺腺癌診治藥物中的用途。即：用候選物質(zhì)處理表達FIBIN的體系；和檢測所述體系中FIBIN的表達或活性；若所述候選物質(zhì)可促進FIBIN的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制肺腺癌的潛在物質(zhì)。所述的表達FIBIN的體系例如可以是細胞(或細胞培養(yǎng)物)體系，所述的細胞可以是內(nèi)源性表達FIBIN的細胞；或可以是重組表達FIBIN的細胞。所述的表達FIBIN的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優(yōu)選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

FIBIN的促進劑和藥物組合物

基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含F(xiàn)IBIN的促進劑。

所述的FIBIN的促進劑是指任何可提高FIBIN基因或表達產(chǎn)物穩(wěn)定性、上調(diào)FIBIN的表達、增加基因FIBIN的有效作用時間或促進FIBIN基因的轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于上調(diào)FIBIN基因的表達有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療肺腺癌。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的FIBIN的促進劑是一種含有FIBIN的表達載體。所述的表達載體通常還含有啟動子、復(fù)制起點和/或標(biāo)記基因等。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。

在本發(fā)明中，是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。表達載體向宿主細胞中的導(dǎo)入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、顯微注射、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細胞膜透過性肽的結(jié)合等周知的方法。

術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。

藥物組合物

本發(fā)明中的藥物組合物包括FIBIN的促進劑、和/或與所述促進劑配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

藥學(xué)上可接受的載體可以是一種也可以是多種，所述載體包括但不限于稀釋劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合劑如淀粉、預(yù)膠化淀粉、糊精、麥芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸鹽、黃原膠、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤滑劑如硬脂酸鋅、單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末、氫化植物油、硬脂富馬酸鈉、聚氧乙烯單硬脂酸酯、單月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸鈉、月桂醇硫酸鎂、十二烷基硫酸鎂等；填充劑如甘露醇(粒狀或粉狀)、木糖醇、山梨醇、麥芽糖、赤蘚糖、微晶纖維素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉等；崩解劑如交聯(lián)乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基甲基、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、大豆多糖等。

本發(fā)明中的藥物組合物還可以包括穩(wěn)定劑、殺菌劑、緩沖劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑等添加劑。

術(shù)語“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量?！八帉W(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細胞轉(zhuǎn)染試劑。

本發(fā)明中，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的促進劑或其轉(zhuǎn)錄基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將FIBIN的促進劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶FIBIN的促進調(diào)劑的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，具體情況需視所述的促進劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明所述的FIBIN的促進劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于：所述的FIBIN的促進劑的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。

術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。在一種含義中，意在包括從任何來源獲得的標(biāo)本或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣本。生物樣本可獲自動物(包括人)并涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣本包括血液制品，諸如血漿、血清等。然而，此類樣本不應(yīng)解釋為限制適用于本發(fā)明的樣本類型。

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與肺腺癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集8例肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織樣本。肺腺癌腫瘤組織標(biāo)本取材部位為主要腫瘤區(qū)域，位于腫瘤腫塊中外1/3與正常組織交接處，排除腫瘤中心明顯壞死、鈣化部分以及腫瘤外圍正常肺組織；癌旁正常肺組織標(biāo)本取自腫瘤邊緣5cm以上的部位，肉眼觀察無明顯變化。上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、RNA樣品的制備(利用miRNA kit進行操作)

在研缽中導(dǎo)入液氮，取上述獲得的組織放入研缽中，在液氮中剪碎并研磨成粉末，剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀，隨后轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中；組織勻漿在玻璃勻漿器中加入Trizol試劑，在冰上研磨組織。將勻漿后組織勻漿液轉(zhuǎn)入無RNA酶的EP管中，室溫下靜置5min。按照試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下：

1)RNA的分離：

在EP管中加入0.2m1氯仿，蓋緊EP管蓋，手動劇烈振蕩15s，使其充分混勻。室溫下孵化5min。然后在4℃下以14000g離心15min。離心后樣品分為三層，RNA存在于上層水相中。

2)RNA沉淀

將分離得的水相取450μl移至新的無RNA酶的EP管中，按照1:1的比例加入450μl異丙醇，上下顛倒混勻后在室溫下孵化10min，4℃14000g離心10min。

3)RNA洗脫

離心后小心移去上清，加入1ml 75％乙醇(滅酶處理，現(xiàn)用現(xiàn)配并在冰上預(yù)冷)沖洗RNA，隨后4℃7500g離心5min。

4)RNA再溶解

小心移去洗滌之后的上清，在超凈工作臺中打開EP管管蓋，在室溫下放置RNA樣本5-10min，晾干。加入無RNA酶處理水20-50μl，55-60℃水浴箱中水浴10min。

5)RNA樣品的質(zhì)量分析

分光光度計檢測：

NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：

將上述提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整性指數(shù)合格、濃度達到要求，可以用于芯片的基因表達譜及篩選實驗。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時用Cy3分別標(biāo)記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達譜芯片，按芯片使用說明書的步驟進行。

5、數(shù)據(jù)分析

利用Agilent GeneSpring軟件對芯片結(jié)果進行分析，篩選表達量具有顯著性差異(標(biāo)準(zhǔn)為該基因在癌與癌旁的表達量相差2倍以上，而且p<0.05)的基因。

6、結(jié)果

結(jié)果顯示，F(xiàn)IBIN在肺腺癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織中的表達量。

實施例2 QPCR測序驗證FIBIN基因的差異表達

1、對FIBIN基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織各50例。

2、RNA提取步驟如實施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄

1)反應(yīng)體系：

RNA模板 1μl，隨機引物1μl，雙蒸水加至12μl，混勻，低轉(zhuǎn)速離心，65℃5min，然后放在冰上冷卻。

繼續(xù)在12μl反應(yīng)液中加入下列成分：

5×反應(yīng)緩沖液4μl，RNA酶抑制劑(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液 2μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)1μl；充分混勻并進行離心處理；

2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶鏈反應(yīng)

引物設(shè)計：

根據(jù)Genebank中FIBIN基因和GAPDH基因的序列設(shè)計QPCR擴增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

FIBIN基因：

正向引物為5’-TCTACCCAGAGATGTCCAA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物為5’-GGTCATCGTTCTCCTCATAG-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因：

正向引物為5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物為5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.6)。

配制PCR反應(yīng)體系：

2×qPCR混合液 12.5μl，基因引物2.0μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl，ddH₂O 8.0μl。

PCR反應(yīng)條件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40個循環(huán)，60℃5min延伸反應(yīng)。75℃至95℃，每20s升溫1℃，繪制溶解曲線。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進行相對定量。

5、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，癌與癌旁組織的配對比較采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與肺腺癌癌旁組織相比，F(xiàn)IBIN在肺腺癌組織中表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同芯片檢測結(jié)果一致。

實施例3 FIBIN過表達

1、細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞株A549，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

將培養(yǎng)瓶中的細胞用胰酶進行消化并接種在6孔板中，保證細胞數(shù)為2-8×10⁵個/孔，加入細胞培養(yǎng)基。過夜，第二天觀察細胞密度，細胞密度為70％以上可進行轉(zhuǎn)染。

2、基因過表達載體的構(gòu)建

根據(jù)FIBIN的cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)合成特異的PCR擴增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGAAGCTTGCCACCATGGTGTTTCTGAAGTTC-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGCTCGAGTACTTTAAGATAATCATTTTTCAGCC-3’(SEQ ID NO.8)

在5’端引物和3’端引物分別添加HindIII和XhoI兩個限制性酶切位點。以肺腺癌患者組織提取和反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為擴增模板，上述cDNA序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切后插入到經(jīng)HindIII和XhoI雙酶切的真核細胞表達載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-1用于后續(xù)實驗。

3、轉(zhuǎn)染

將肺腺癌細胞分為3組，分別為對照組(A549)、空白對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC)、實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-1)。使用脂質(zhì)體2000進行載體的轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染方法按照說明書的指示進行。pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-1的轉(zhuǎn)染濃度均為0.5μg/ml。

4、QPCR檢測FIBIN基因的轉(zhuǎn)錄水平

4.1細胞總RNA的提取

1)將6孔板中的細胞培養(yǎng)液倒掉，用PBS沖洗兩次，各孔加入1ml Trizol試劑，室溫放置5min。

2)加入0.2m1氯仿，劇烈震蕩15s，4℃，12000g離心15min。

3)水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入4.5m1異丙醇，室溫放置10min；4℃，10000g離心10min。

4)倒掉液體，用lml的75％乙醇洗EP管壁。4℃，7500g，離心5min。

5)倒掉清洗后的75％乙醇，室溫晾置5-10min。

6)加入25μl無RNA酶的DEPC水，-70℃保存。

4.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。

4.3 QPCR擴增步驟同實施例2。

5、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，F(xiàn)IBIN基因過表達組與對照組之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2顯示，與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染FIBIN組中過表達FIBIN，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

實施例4 FIBIN基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋车挠绊?/p>

采用CCK-8實驗檢測FIBIN基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋衬芰τ绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。

2、第二天將細胞取出，顯微鏡下觀察細胞生長情況，1ml/孔加入含EDTA的胰酶，進行細胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入細胞培養(yǎng)基混勻使細胞懸浮，然后進行細胞計數(shù)。

3、將細胞懸液濃度稀釋為15000個/ml，之后往96孔板中進行接種，每孔加入細胞懸液200μl，細胞控制在3000個左右，接種8個復(fù)孔。設(shè)置pcDNA3.1-1實驗組和pcDNA3.1-NC對照組。共鋪4塊96孔板分別用于24h、48h、72h、96h4個檢測時間點。

4、24h后，將第一塊96孔板取出，每孔中加入10μl的CCK-8檢測液，將96孔板繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱中孵育4h左右，用酶標(biāo)儀檢測各孔在450nm波長處的吸光度值并記錄數(shù)據(jù)。

5、在48h、72h、96h后分別重復(fù)步驟4中的操作，最后統(tǒng)計出各時間點的吸光度值，作出生長曲線圖。

6、統(tǒng)計學(xué)分析

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，與對照相比，實驗組在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-1后，細胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)說明FIBIN具有抑制細胞增殖的作用。

實施例5 FIBIN基因?qū)Ψ蜗侔┘毎蛲龅挠绊?/p>

使用流式細胞儀檢測FIBIN基因?qū)毎蛲龅挠绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例3。

2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。

3、步驟

1)將3m1 10×上樣緩沖液用27m1蒸餾水稀釋。

2)收集細胞樣本并用預(yù)冷的PBS清洗。

3)將細胞加入lml 1×上樣緩沖液，300g離心10min，吸出緩沖液。

4)再次加入lml 1×上樣緩沖液，將細胞懸液中細胞濃度調(diào)整為1×10⁶個/ml。

5)將細胞懸液取出100μl，加入EP管中。

6)將5μl的Annexin V FITC加入EP管中，混勻EP管中的液體，在室溫下避光孵育10min。

7)向EP管中加入5μl PI染液，在室溫下避光5min。

8)在EP管中加入500μl的PBS溶液，輕輕混勻，1h內(nèi)上流式細胞儀進行檢測。

3、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖4所示，實驗組與對照組相比，細胞凋亡率無明顯的變化(P<0.05)，該結(jié)果說明，F(xiàn)IBIN差異表達對肺腺癌細胞的凋亡無明顯的影響。

實施例6細胞遷移及侵襲實驗

1、Transwell小室制備

無菌條件下Matrigel冰浴融化，用PBS進行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel膠聚合成凝膠后取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含BSA的無血清培養(yǎng)液對基底膜進行水化處理，37℃放置30min。

2、配置細胞懸液

細胞撤血清饑餓處理12-24h，對細胞進行消化處理，終止消化后進行離心，去除上層培養(yǎng)液。用PBS對沉淀細胞進行清洗，加入含有BSA的無血清培養(yǎng)基對其進行重懸。調(diào)整細胞的密度至5×l0⁵個/ml。

3、細胞接種

取細胞懸液200μl(遷移實驗為100μl，侵襲實驗為200μl)加入到Transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基。把細胞放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

4、染色

細胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用DAPI染色。把小室細胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室溫染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，在肺腺癌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒之后，與對照組相比，實驗組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結(jié)果說明FIBIN能夠抑制肺腺癌的遷移及侵襲。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120> 一種用于肺腺癌診治的生物標(biāo)志物

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 636

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atggtgtttc tgaagttctt ctgcatgagt ttcttctgcc acctgtgtca aggctacttc 60

gatggccccc tctacccaga gatgtccaat gggactctgc accactactt cgtgcccgat 120

ggggactatg aggagaacga tgaccccgag aagtgccagc tgctcttcag ggtgagtgac 180

cacaggcgct gctcccaggg ggaggggagc caggttggca gcctgctgag cctcaccctg 240

cgggaggagt tcaccgtgct gggccgccag gtggaggatg ctgggcgcgt gctggagggc 300

atcagcaaaa gcatctccta cgacctagac ggggaagaga gctatggcaa gtacctgcgg 360

cgggagtccc accagatcgg ggatgcctac tccaactcgg acaaatccct cactgagctg 420

gagagcaagt tcaagcaggg ccaggaacag gacagccggc aggagagcag gctcaacgag 480

gactttctgg gaatgctggt ccacaccagg tccctgctga aggagacact ggacatctct 540

gtggggctca gggacaaata cgagctgctg gccctcacca ttaggagcca tgggacccga 600

ctaggtcggc tgaaaaatga ttatcttaaa gtatag 636

<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Val Phe Leu Lys Phe Phe Cys Met Ser Phe Phe Cys His Leu Cys

1 5 10 15

Gln Gly Tyr Phe Asp Gly Pro Leu Tyr Pro Glu Met Ser Asn Gly Thr

20 25 30

Leu His His Tyr Phe Val Pro Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Asn Asp Asp

35 40 45

Pro Glu Lys Cys Gln Leu Leu Phe Arg Val Ser Asp His Arg Arg Cys

50 55 60

Ser Gln Gly Glu Gly Ser Gln Val Gly Ser Leu Leu Ser Leu Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Glu Phe Thr Val Leu Gly Arg Gln Val Glu Asp Ala Gly Arg

85 90 95

Val Leu Glu Gly Ile Ser Lys Ser Ile Ser Tyr Asp Leu Asp Gly Glu

100 105 110

Glu Ser Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Arg Glu Ser His Gln Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Tyr Ser Asn Ser Asp Lys Ser Leu Thr Glu Leu Glu Ser Lys Phe

130 135 140

Lys Gln Gly Gln Glu Gln Asp Ser Arg Gln Glu Ser Arg Leu Asn Glu

145 150 155 160

Asp Phe Leu Gly Met Leu Val His Thr Arg Ser Leu Leu Lys Glu Thr

165 170 175

Leu Asp Ile Ser Val Gly Leu Arg Asp Lys Tyr Glu Leu Leu Ala Leu

180 185 190

Thr Ile Arg Ser His Gly Thr Arg Leu Gly Arg Leu Lys Asn Asp Tyr

195 200 205

Leu Lys Val

210

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tctacccaga gatgtccaa 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtcatcgtt ctcctcatag 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagccccagc cttctccat 19

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgaagcttg ccaccatggt gtttctgaag ttc 33

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggctcgagt actttaagat aatcattttt cagcc 35