本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

熒光定量PCR(Realtime quantitative PCR，qPCR)是一種基因表達(dá)定量技術(shù)。qPCR技術(shù)的基礎(chǔ)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，其以單鏈模板與引物鏈按照堿基配對(duì)原則正確配對(duì)為前提。所以，在包含堿基差異的區(qū)域，設(shè)計(jì)一組只有單堿基差異的qPCR引物，利用常見(jiàn)的qPCR擴(kuò)增儀，進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板堿基差異區(qū)域的初始濃度。利用雙鏈核酸在高溫下變性的特性，在70-94℃間記錄熔解曲線作為檢測(cè)核酸特異性的參數(shù)。核酸的熔解曲線完全取決于核酸序列特征，序列中由于單個(gè)堿基的改變?cè)斐珊怂岬慕怄湝囟劝l(fā)生改變?；パa(bǔ)的雙鏈核酸在經(jīng)過(guò)高溫變性后，隨著溫度的下降分開(kāi)的兩條鏈會(huì)重新締合，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性。利用核酸復(fù)性的特征，則可以判斷兩條互補(bǔ)的寡核苷酸是否可以發(fā)生相互作用。

飽和熒光染料是一種小分子的非序列特異熒光染料，可以和核酸雙鏈的小溝充分結(jié)合，在解鏈中不會(huì)發(fā)生重排，熒光信號(hào)強(qiáng)度可以準(zhǔn)確地反映解鏈難易程度。常用于檢測(cè)單堿基突變、小片段插入或缺失(Wittwer et al.,2003；Liew et al.,2004)。目前，可以用來(lái)檢測(cè)RNAs序列多態(tài)性干擾RNA-RNA分子相互作用的方法為表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance，SPR)，該方法價(jià)格比較昂貴，實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境要求嚴(yán)格，必須以相關(guān)的大型儀器平臺(tái)作為支撐，實(shí)驗(yàn)運(yùn)行靈活性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光的檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法檢測(cè)效率高、靈活性好，且配套條件簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本低。

本發(fā)明提供了一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)預(yù)測(cè)RNA-RNA相互作用區(qū)域；

所述RNA-RNA包括miRNA及其靶基因或lncRNAs及其靶基因；

所述miRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括：利用psRNATarget在線預(yù)測(cè)工具進(jìn)行預(yù)測(cè)，所述預(yù)測(cè)方法的規(guī)則包括：最大期望值:0～1.0；互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度：18～19bp；未匹配靶位點(diǎn)的最大能量：15～20；靶位點(diǎn)的側(cè)翼長(zhǎng)度:上游17bp/下游13bp；導(dǎo)致延伸抑制的中央錯(cuò)配范圍：9～11nt；

所述lncRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括：利用Blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，所述序列互補(bǔ)計(jì)算時(shí)的參數(shù)設(shè)置為E value＝1e-10，identity＝90％；將所述互補(bǔ)計(jì)算得到的序列再利用RNAplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e＝-40；

2)對(duì)所述步驟1)得到的RNA-RNA相互作用區(qū)域內(nèi)序列進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選得到多態(tài)性位點(diǎn)作為靶位點(diǎn)；

所述多態(tài)性分析的方法包括：

當(dāng)分析對(duì)象為模式物種時(shí)，通過(guò)物種重測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs、InDels位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，所述位點(diǎn)在群體中的頻率均大于5％；

當(dāng)分析對(duì)象為非模式物種時(shí)，通過(guò)克隆相互作用區(qū)域cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，至少利用20個(gè)沒(méi)有親緣關(guān)系的個(gè)體進(jìn)行序列多態(tài)性分析；

3)以所述步驟2)得到的相互作用區(qū)域內(nèi)的含1～5個(gè)靶位點(diǎn)的序列為模板，合成相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段；

4)將所述步驟3)得到的任意兩條相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段與飽和熒光染料混合，利用Realtime-PCR進(jìn)行升溫處理，通過(guò)相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的熔解；利用Realtime-PCR進(jìn)行降溫處理，通過(guò)相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的結(jié)合；

5)根據(jù)所述步驟4)得到的熒光強(qiáng)度繪制熒光隨溫度的變化曲線，曲線的峰值對(duì)應(yīng)的溫度代表寡核苷酸結(jié)合或熔解一半時(shí)所需要的溫度；在降溫處理中，所述峰值對(duì)應(yīng)的溫度越高，則代表RNA-RNA結(jié)合能力越強(qiáng)；在升溫處理中，所述峰值的溫度越高，則代表RNA-RNA形成的互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越強(qiáng)。

優(yōu)選的是，所述步驟3)寡核苷酸片段的長(zhǎng)度為20～180bp。

優(yōu)選的是，所述步驟4)中Realtime-PCR的反應(yīng)體系為：每25μl體系包括11.25μl去離子水；0.625μl 10μM的寡核苷酸片段；12.50μl飽和熒光染料。

優(yōu)選的是，所述飽和熒光染料為L(zhǎng)C Green。

優(yōu)選的是，所述步驟4)Realtime-PCR的反應(yīng)條件為：

RNA-RNA寡核苷酸序列升溫處理體系：95℃，30s；95℃，30s，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)記錄熒光強(qiáng)度；

RNA-RNA寡核苷酸序列降溫處理體系：95℃，30s；自然冷卻至室溫(25℃)；75℃，30s，每個(gè)循環(huán)提高0.5℃，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)記錄熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明提供了一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光的檢測(cè)方法。利用Realtime-PCR，通過(guò)監(jiān)測(cè)升溫/降溫過(guò)程中相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來(lái)分析核酸相互作用能力。本發(fā)明在Realtime-PCR技術(shù)的靈活性與高通量特性的基礎(chǔ)上結(jié)合高分辨率熒光染料的靈敏性為核酸相互作用檢測(cè)提供了一種檢測(cè)效率高、靈活性好，且配套條件簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本低的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)觀測(cè)熒光強(qiáng)度變化曲線，就能得出RNA-RNA寡核苷酸序列結(jié)合或熔解的具體情況，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法靈敏度高，結(jié)果觀測(cè)簡(jiǎn)單，為核酸相互作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的毛白楊lncRNAs與靶基因結(jié)合熒光曲線；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的毛白楊lncRNAs與靶基因熔解熒光曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)預(yù)測(cè)RNA-RNA相互作用區(qū)域；

所述RNA-RNA包括miRNA及其靶基因或lncRNAs及其靶基因；

所述miRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括：利用psRNATarget在線預(yù)測(cè)工具進(jìn)行預(yù)測(cè)，所述預(yù)測(cè)方法的規(guī)則包括：最大期望值:0～1.0；互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度：18～19bp；未匹配靶位點(diǎn)的最大能量：15～20；靶位點(diǎn)的側(cè)翼長(zhǎng)度:上游17bp/下游13bp；導(dǎo)致延伸抑制的中央錯(cuò)配范圍：9～11nt；

所述lncRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括：利用Blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，所述序列互補(bǔ)計(jì)算時(shí)的參數(shù)設(shè)置為E value＝1e-10，identity＝90％；將所述互補(bǔ)計(jì)算得到的序列再利用RNAplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e＝-40；

2)對(duì)所述步驟1)得到的RNA-RNA相互作用區(qū)域內(nèi)序列進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選得到多態(tài)性位點(diǎn)作為靶位點(diǎn)；

所述多態(tài)性分析的方法包括：

當(dāng)分析對(duì)象為模式物種時(shí)，通過(guò)物種重測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs、InDels位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，所述位點(diǎn)在群體中的頻率均大于5％；

當(dāng)分析對(duì)象為非模式物種時(shí)，通過(guò)克隆相互作用區(qū)域cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，至少利用20個(gè)沒(méi)有親緣關(guān)系的個(gè)體進(jìn)行序列多態(tài)性分析；

3)以所述步驟2)得到的相互作用區(qū)域內(nèi)的含1～5個(gè)靶位點(diǎn)的序列為模板，合成相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段；

4)將所述步驟3)得到的任意兩條相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段與飽和熒光染料混合，利用Realtime-PCR進(jìn)行升溫處理，通過(guò)相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的熔解；利用Realtime-PCR進(jìn)行降溫處理，通過(guò)相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的結(jié)合；

5)根據(jù)所述步驟4)得到的熒光強(qiáng)度繪制熒光隨溫度的變化曲線，曲線的峰值對(duì)應(yīng)的溫度代表寡核苷酸結(jié)合或熔解一半時(shí)所需要的溫度；在降溫處理中，所述峰值對(duì)應(yīng)的溫度越高，則代表RNA-RNA結(jié)合能力越強(qiáng)；在升溫處理中，所述峰值的溫度越高，則代表RNA-RNA形成的互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越強(qiáng)。

本發(fā)明預(yù)測(cè)RNA-RNA相互作用區(qū)域。在本發(fā)明中，所述RNA-RNA包括miRNA及其靶基因或lncRNAs及其靶基因；在本發(fā)明中，所述miRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括：利用psRNATarget在線預(yù)測(cè)工具進(jìn)行預(yù)測(cè)，所述預(yù)測(cè)方法的規(guī)則包括：最大期望值:0～1.0；互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度：18～19bp；未匹配靶位點(diǎn)的最大能量：15～20；靶位點(diǎn)的側(cè)翼長(zhǎng)度:上游17bp/下游13bp；導(dǎo)致延伸抑制的中央錯(cuò)配范圍：9～11nt。本發(fā)明所述RNA優(yōu)選為植物RNA。

所述lncRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域的預(yù)測(cè)方法包括：利用Blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，所述序列互補(bǔ)計(jì)算時(shí)的參數(shù)設(shè)置為E value＝1e-10，identity＝90％；將所述互補(bǔ)計(jì)算得到的序列再利用RNAplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e＝-40，得到lncRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域。

得到預(yù)測(cè)的RNA-RNA相互作用區(qū)域后，本發(fā)明對(duì)所述RNA-RNA相互作用區(qū)域內(nèi)序列進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選得到多態(tài)性位點(diǎn)作為靶位點(diǎn)。在本發(fā)明中，所述多態(tài)性分析根據(jù)是否為模式物種有兩種不同的方法，具體的當(dāng)分析對(duì)象為模式物種時(shí)，所述多態(tài)性分析的方法包括：通過(guò)物種重測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs、InDels位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，所述位點(diǎn)在群體中的頻率均大于5％；在本發(fā)明中，所述模式物種指的是在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中存有群體基因組的物種，具體如擬南芥、楊樹(shù)、桉樹(shù)等植物。在本發(fā)明中，所述物種重測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)指的具有儲(chǔ)存該物種群體基因組數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)，如Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)等。在本發(fā)明中，所述SNPs、InDels位點(diǎn)的頻率代表該多態(tài)性位點(diǎn)在群體中發(fā)生的頻率，本發(fā)明所述位點(diǎn)在群體中的頻率優(yōu)選均大于5％，更優(yōu)選大于10％。

當(dāng)分析對(duì)象為非模式物種時(shí)，所述多態(tài)性分析的方法包括：通過(guò)克隆相互作用區(qū)域cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行相互作用區(qū)域內(nèi)的SNPs位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，至少利用20個(gè)沒(méi)有親緣關(guān)系的個(gè)體進(jìn)行序列多態(tài)性分析；在本發(fā)明中，所述非模式物種指的是在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中存在群體基因組的物種，所述物種優(yōu)選為植物，具體優(yōu)選為柳樹(shù)、槐樹(shù)、油松和楊樹(shù)等。在本發(fā)明中，所述沒(méi)有親緣關(guān)系的個(gè)體是指所屬同一個(gè)物種，但不具有遺傳關(guān)系的個(gè)體。所述序列多態(tài)性分析指的是發(fā)現(xiàn)用于該區(qū)域內(nèi)的SNPs位點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的靶位點(diǎn)。限定個(gè)體數(shù)下限是為了提高SNPs位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的機(jī)率。

進(jìn)行多態(tài)分析后，以得到的相互作用區(qū)域內(nèi)的含1～5個(gè)靶位點(diǎn)的序列為模板，合成相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段。即本發(fā)明根據(jù)得到的序列多態(tài)性分析結(jié)果即靶位點(diǎn)，選擇miRNA及其靶基因相互作用區(qū)域或lncRNAs及其靶基因相互作用區(qū)域內(nèi)存在1～5個(gè)靶位點(diǎn)的序列為模板，合成寡核苷酸片段。在本發(fā)明中，所述寡核苷酸片段的長(zhǎng)度為20～180bp。本發(fā)明對(duì)所述寡核苷酸片段的合成方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基因序列合成方法即可，如人工合成等。

得到寡核苷酸片段后，將得到的任意兩條相互作用區(qū)域內(nèi)的寡核苷酸片段與飽和熒光染料混合，利用Realtime-PCR進(jìn)行升溫處理，通過(guò)相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的熔解；利用Realtime-PCR進(jìn)行降溫處理，通過(guò)相互作用的寡核苷酸片段產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度檢測(cè)寡核苷酸序列的結(jié)合。在本發(fā)明中，所述飽和熒光染料為L(zhǎng)C Green染料，所述飽和熒光染料的作用為均勻的嵌合在核酸雙鏈上，在核酸雙鏈結(jié)構(gòu)改變時(shí)提供熒光指示。在本發(fā)明中，所述Realtime-PCR的反應(yīng)體系為：每25μl體系包括11.25μl去離子水；0.625μl 10μM的寡核苷酸片段；12.50μl飽和熒光染料。

在本發(fā)明中，所述步驟4)Realtime-PCR的反應(yīng)條件為：

RNA-RNA寡核苷酸序列升溫處理體系：95℃，30s；95℃，30s，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)記錄熒光強(qiáng)度；

RNA-RNA寡核苷酸序列降溫處理體系：95℃，30s；自然冷卻至室溫(25℃)；75℃,30s，每個(gè)循環(huán)提高0.5℃，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)記錄熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明根據(jù)所述得到的熒光強(qiáng)度繪制熒光隨溫度的變化曲線，在繪制曲線前，本發(fā)明優(yōu)選對(duì)得到的熒光強(qiáng)度數(shù)值進(jìn)行Z-score值均一化處理，利用均一化后的數(shù)據(jù)繪制熒光變化曲線；本發(fā)明對(duì)所述Z-score值均一化的方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的Z-score值均一化處理方法即可。得到的熒光曲線中，曲線的峰值對(duì)應(yīng)的溫度代表寡核苷酸結(jié)合或熔解一半時(shí)所需要的溫度；在降溫處理中，所述峰值對(duì)應(yīng)的溫度越高，則代表RNA-RNA結(jié)合能力越強(qiáng)；在升溫處理中，所述峰值的溫度越高，則代表RNA-RNA形成的互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越強(qiáng)。

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明提供的一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是不能將它們理解為對(duì)本申請(qǐng)保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

利用高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光檢測(cè)方法對(duì)lncRNAs(TCONS_00031377，如SEQUENCE ID NO:1所示)及其靶基因相互作用區(qū)域存在的SNPs位點(diǎn)對(duì)RNA-RNA相互作用的干擾效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

1)預(yù)測(cè)lncRNAs(TCONS_00031377)靶基因，利用Blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為E-value＝1e-10，identity＝90％；利用RNAplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為e＝-40。預(yù)測(cè)得到其靶基因?yàn)镻otri.001G204300，在基因組中的位置為Chr01:20271786..20276405，如SEQUENCE ID NO:2所示，位于反義鏈上。RNA-RNA相互作用區(qū)域?yàn)镃hr01:20276090-20276215，如SEQUENCE ID NO:3所示。

2)利用毛白楊重測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)所述相互作用區(qū)域內(nèi)SNPs、InDels位點(diǎn)進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為在群體中的頻率需要大于5％，SNP(Chr01：20276166-C/U)位點(diǎn)滿足以上要求，該SNP候選區(qū)域被篩選為候選區(qū)域。

3)根據(jù)所述篩選得到的候選區(qū)域，確定需要合成的寡核苷酸長(zhǎng)度為51bp。合成寡核苷酸片段如下：

SEQUENCE ID NO:4(TCONS_00031377SNP20276166C F:5'-GUUGCGUCGAAAUUUGAAAGATAGAUGCACCCGUUGCUGCCAUUUUAGUUG-3')，

SEQUENCE ID NO:5(TCONS_00031377SNP20276166U F:5'-GUUGUGUCGAAAUUUGAAAGAUAGAUGCACCCGUUGCUGCCAUUUUAGUUG-3')，

SEQUENCE ID NO:6(Potri.001G204300interact region F:5'-CAACUAAAAUGGCAGCAACGGGUGCAUCUAUCUUUCAAAUUUCGACGCAAC-3')；

SEQUECE NO:4和SEQUENCE NO:5分別與SEQUENCE NO:6存在相互作用區(qū)域。

4)將寡核苷酸片段與熒光染料混合，所述混合體系為：25μl體系包括去離子水，11.25μl；0.625μl 10μM的lncRNA互作區(qū)域寡核苷酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5；0.625μl 10μM的lncRNA互作區(qū)域寡核苷酸序列SEQ ID NO:6；LC Green飽和熒光染料，12.50μl。Realtime-PCR檢測(cè)條件為：①RNA-RNA寡核苷酸序列結(jié)合檢測(cè)體系為：95℃，30s；40個(gè)循環(huán)95℃，30s(-0.5℃/循環(huán))，每個(gè)循環(huán)記錄熒光強(qiáng)度。②RNA-RNA寡核苷酸序列熔解檢測(cè)體系為：95℃，30s；自然冷卻至室溫(25℃)；40個(gè)循環(huán)75℃,30s(+0.5℃/循環(huán))。

5)對(duì)得到熒光強(qiáng)度數(shù)值進(jìn)行Z-score值均一化處理，利用均一化后的數(shù)據(jù)繪制熒光變化曲線。曲線的峰值所對(duì)應(yīng)的溫度代表寡核苷酸結(jié)合或熔解一半時(shí)所需要的溫度。在結(jié)合測(cè)試中，TCONS_00031377SNP20276166C熒光變化峰值處溫度為81.5℃，TCONS_00031377SNP20276166U熒光變化峰值處溫度為81℃，證明TCONS_00031377SNP20276166C與靶基因結(jié)合能力較強(qiáng)。在熔解測(cè)試中，TCONS_00031377SNP20276166C熒光變化峰值處溫度為83℃，TCONS_00031377SNP20276166U熒光變化峰值處溫度為82.5℃，證明TCONS_00031377SNP20276166C與靶基因結(jié)合后形成的雙鏈結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。

毛白楊lncRNAs與靶基因結(jié)合熒光曲線如圖1所示，虛線代表lncRNAs(TCONS_00031377SNP20276166C)與靶基因結(jié)合熒光變化曲線；實(shí)線代表lncRNAs(TCONS_00031377SNP20276166U)與靶基因結(jié)合熒光變化曲線。虛線代表結(jié)合過(guò)程中熒光變化峰值處的溫度。

毛白楊lncRNAs與靶基因熔解熒光曲線如圖2所示，虛線代表lncRNAs(TCONS_00031377SNP20276166C)與靶基因熔解熒光變化曲線；實(shí)線代表lncRNAs(TCONS_00031377SNP20276166U)與靶基因熔解熒光變化曲線。虛線代表熔解過(guò)程中熒光變化峰值處的溫度。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京林業(yè)大學(xué)

<120> 一種高分辨率核酸結(jié)合/熔解熒光的檢測(cè)方法

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 212

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgctcttttc ttcttagtag tgctccgttg caaagaagaa ccgatgaaag aactagcaag 60

agtgttcgag acggatggat tagcattatt aatattagca gtagtaattg gcctcgtgaa 120

gacacgaggt tgcgtcgaaa tttgaaagat agatgcaccc gttgctgcca ttttagttga 180

ttacatatat ctatatctat atctatgatt tt 212

<210> 2

<211> 4620

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgcttgctt tttgtctgtt tccatgcact tactttgtgt gtttgtaaag atatttcctt 60

ggaaaattgg tgcttgtggc tgtctctcct tctatatatc tccttatctc atactctgtc 120

tcataactaa taggttcaag ctatttcctc tctttttttt aattctttgc tgtcttgata 180

gttaaagcag aatcaactaa aatggcagca acgggtgcat ctatctttca aatttcgacg 240

caacctcgtg tcttcacgag gccaattact actgctaata ttaataatgc taatccatcc 300

gtctcgaaca ctcttggtga gtgtatcttt aaaaccttgt cactttctta ttttattcat 360

gttagaatcc tagagaattt tgtagtgtga tttctaatat acttgaactc atatcttatt 420

aatgacatgt atgcaaagta attactagga agaaatggca aggtaagaat ggatgaaacc 480

actgacaatt taatttcatc aagaaaacga ttgaaagatg ttctgacaaa caagttgcta 540

ggtacgtagt tccaagagct ctaagttgtt tatcatcact ggagactgct tgttaactgt 600

ttgaatgaga gtatatggtg aataccatga atttcttggg caatcttgta ctttaccatc 660

agacttgaat ggcttgactg gattttggtt tgtaaaaaaa ttggctgttt tcctttttcc 720

ccgattttaa tcttgaatgg ctatggttat ccgtgactgc actgtgtttt catctgtaat 780

attgttttaa ggcgtttttg ctttcaaatt taagtagcaa gttagccaaa cctcgtgcgt 840

tgatcttttt ttactaagct gctccgtctg tgttctatct ccatcacaag tacaagtaca 900

gcaacgagtt ttgaccttaa gcttcaaaaa gcttgacatt tttatgtttc ttattgcagc 960

tagttctttc atcggttctt ctttgcaacg gagcactact aagaagaaaa gagcagttaa 1020

gattggtagg aaagtgatcg ctgcagctgc tgttactgtt gccactcctt caagggagga 1080

agttaaggag tatgaatttc ctcttccttc catttaatgg gattttatct tacttgtgta 1140

aagggctcta tcacaagtcc tctacctcac agttctgttc ataaaggaag tttttcccat 1200

tccattaata cttgcgttct tgtagagcgg gtaaacgaga aacaagcaaa ccagcataaa 1260

aaaggataca gcaaatacta cagtcgtatc atgaggctta attttctatt acaaaagcag 1320

cttttttgtt atcatttcct tttaaaagag cagaatcgta atggtcatct aattctgtaa 1380

tcacttcttt ccagatatgc acgtcctaca tgggccatgt ttgaacttgg aagtgccccc 1440

gtcttctgga aaaccatgaa cggccttcct ccatcttctg taagttagcg ctcacaggat 1500

tcttttctct cttttgaagg tggtgctagt ctttcaatga tgttgaactt gaaatcaatt 1560

gacaggggga aaacctaaag cttttctaca atccagctgc aaacaagctt gttccaaacg 1620

aagaatttgg gattgctttt aatggtaatt tgttattcaa ctcatctcag taagtgtcac 1680

aaaatactcc ttgcaataaa gggtctgtaa aatttccaca agtaataact tgctgccctt 1740

ggaatgtcat agagcatcag attaaagcac tttgaacata acgatatcat gcataatttc 1800

aaataccaga agaatttaca tttcattggt ggtgctctgc tcggcataca aggagtgctc 1860

ggtggttcca ccttcctcaa gatatcaagt attgtttaat caatctccaa ccccttactt 1920

tgcaggaggt tttaatcagc ccatcatgtg tggtggtgag ccaagggcaa tgctgaggaa 1980

agttagaggg aaggctgatc cgccatttta caccatccag atatgcgttc ctaagcatgg 2040

tatggttggt accattttca caattttatt gctttatggg acatttaatt ccttgtaaga 2100

aactctcgta tcctttttgc agctgtgaac ttgatattct cgttcacaaa tggagttgac 2160

tgggatggtc cttacaggct gcagtttcaa gttcacaatg gctggcgaaa caagcccatc 2220

gaattcttca acgaggtact aacacataaa caaagttttg atatatccct tgagaatttc 2280

ctcaagcttt gtaataacta ggtgtcaatc ccaaacgtga caaccttgaa tgataagaaa 2340

agagaaggta tgaactttac tgatacatgc acggactgtt ttattcattt atcacaaagc 2400

atatgcattt tactaattga tgcgaaccca tagaaataat ataaaaagct aatatcataa 2460

aatctccatc caaagattat cttgaattga aaaatccaag ttattgaatg aaaaatccaa 2520

aactttaatt ataaagaatc aagaactgaa tgtataagag aaaatattac aaaaacattt 2580

aacttttttt ataagtatga agaatcaaga atatgcataa cctcaccact cacaaaatat 2640

tattcataaa taataagcaa tttgaaaaaa aaaactaaat acaagctaaa taatcatttt 2700

tatattaggt aaaaacatcc taaataaagc tagaaaaata aaaaaaaaat attaatccaa 2760

ataagaaaaa gaatcttaaa ctaactaaga aaataatgca aatctcgcat agtaacttct 2820

aaatcttatt gtaaggcttt ctcgatatct gatcgttaca acattttaac cctataaaaa 2880

acaaaacctt tagaatcttt aggaaaaatt tcaataaaat tcaatggtca aattaaaagt 2940

tatatttatt agcataaaaa tatgtattgg aaaaaataaa ctcaaaacac cctctaatgt 3000

ccttgaataa taaggattgt tgttgtataa agaatctttc taaaataagg attgttgcct 3060

aattaatctt attggaaagt aagaaatcga tttcacatat aatgaaatcc ttaccttgaa 3120

agaatacaca aatcatgatg aaaataataa ttttccgact ttccttgttt actggcagat 3180

ttcaagtttg acttcaaaca cgtcgttctc tcatatctag atgagttaat aagcctatca 3240

tatttagatg gaaagcttaa gatatatagt ttttatctca actagaatcg caataaaact 3300

ccatttatag ctttaaatct ggttcaaaca ctacatgaag gtctagtcta gtaaatatgc 3360

aatttgttaa cccaaatatc atgaatcaac ttaaataatt tctctttgat ttttttagtt 3420

ttaaacctaa ttagtccact tctaagtact ttaataatgc tccctaattt atttattttg 3480

gaaagttttg gtgcttaaat caattgtaat atctggttgt ttggaatgct acgacatctt 3540

agtgttgttg gtgcaacaaa tccttgggta cttcgcatcc gaaaacatca aatttccagg 3600

tttccttata ccagaatata taagaaagct gggagattat ttgcctaaat ctagaagact 3660

ttgctcattt tgacatggct tataacatgt taaataagtg attcaattct gaccaattta 3720

gccacaaatt tagataaaag gaacaaacaa aagacgtttc cattttgaca gggcctggca 3780

gaagagttga gtaaagaagg tgcgtgcgaa aaagcaattt ttccggatac agatatcatt 3840

gttacgagat gtgctatgat cggcaactta tccattgaag gggtaagagt actcattgtt 3900

tcatctgtct cggtttcctt gcttccattt ttcttgaaat atgacaaatt gacttttaat 3960

ttcacaaatg aaactttctt gcagggtgat cgttgcgatc ttgatctagt ctcaggatgc 4020

atggatccta gctcacattt atataacccc cttgccaatg tggatgatgg aacctgccca 4080

attgagatgg aagattagca gtagcctggc aatacccctt tgatgttgat gtaaatacca 4140

tatacattta ctgtatacct aaggccttcc tcatacataa tggcaaatat actaatgaaa 4200

ttactacttg ctcaagtaaa aatgcttgct ttgagcgagg tctatatgaa acatctccag 4260

ttcccttgat gatgacaaga agtatagtgc acatcctgat agtaatttga aggcaacatt 4320

ccagtttgaa gctatgcttc aaagggaagg tgtggatcga ctttcagttt ggcaaaccta 4380

aaatggaacg agcctctttc agcacagagt ctcaggctgc aagtatgaag taattattct 4440

tacaagacaa agtgaatgga atttttagat tttatttgtg tcagaatagt ggctgtgtca 4500

gctcgcagaa aagcgactcc aaaagaaata ttataaactt catagtcgtt ccgatagaaa 4560

aaaactgacc attttttttt cctctttatt ttgttatatt gcacaggctt agttatttca 4620

<210> 3

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caagagtgtt cgagacggat ggattagcat tattaatatt agcagtagta attggcctcg 60

tgaagacacg aggttgcgtc gaaatttgaa agatagatgc acccgttgct gccattttag 120

ttgatt 126

<210> 4

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

guugcgucga aauuugaaag auagaugcac ccguugcugc cauuuuaguu g 51

<210> 5

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

guugugucga aauuugaaag auagaugcac ccguugcugc cauuuuaguu g 51

<210> 6

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

caacuaaaau ggcagcaacg ggugcaucua ucuuucaaau uucgacgcaa c 51