本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種取代二芳基嘧啶類衍生物，本發(fā)明還涉及這類衍生物的制備方法及其抗人免疫缺陷病毒(HIV)抑制劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

艾滋病(AIDS)是一種破壞人體免疫系統(tǒng)并嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，由感染HIV病毒引起。在抗艾滋病藥物中，HIV-1非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Non-nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NNRTIs)因其強(qiáng)選擇性、高活性、低毒性等優(yōu)點(diǎn)而發(fā)揮關(guān)鍵作用。但由于HIV-1病毒的高度變異性，頻繁出現(xiàn)耐藥菌株成為臨床治療的一大難題。此外，NNRTIs在臨床藥物治療中出現(xiàn)耐藥性差、毒副作用強(qiáng)以及藥物代謝動力學(xué)差的問題在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。因此，開發(fā)抗耐藥性強(qiáng)的新型高效低毒、藥代動力學(xué)性質(zhì)好的NNRTIs是當(dāng)今艾滋病研究的熱點(diǎn)和重要任務(wù)。

DAPY(Diarylpyrimidines)抑制劑是一類新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)具有良好柔韌性的NNRTIs，其對野生型和突變的HIV-1病毒具有很高抑制活性。目前已經(jīng)合成的部分化合物對突變株的活性達(dá)納摩爾水平，并有兩個藥物——依曲韋林etrivirine(TMC-125)和利匹韋林rilpivirine(TMC-278)已上市。它們作為新一代的NNRTIs，對多種耐藥株具有很高的抑制活性，但較低的水溶性和較差的透膜性導(dǎo)致其生物利用度低、口服劑量加大，引起毒副作用和交叉耐藥等問題。例如，依曲韋林需要每日多次給藥，且伴隨著嚴(yán)重的皮膚過敏反應(yīng)。利匹韋林藥代性質(zhì)有所提高，但仍存在抑郁、失眠、急性呼吸窘迫綜合征、頭痛及皮疹等毒副作用，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，研發(fā)高效、廣譜抗耐藥以及具有良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的NNRTIs是前抗艾滋病藥物研究的重要領(lǐng)域之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種取代二芳基嘧啶類衍生物及其制備方法，本發(fā)明還提供了取代二芳基嘧啶類衍生物的抗HIV-1活性篩選結(jié)果及其在抗病毒領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.取代二芳基嘧啶類衍生物

本發(fā)明所涉及的一種取代二芳基嘧啶類衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或前藥，具有如下通式I或II所示的結(jié)構(gòu)：

其中，

X為O或NH；

n＝0或1；

R¹為：一側(cè)直接與苯環(huán)連接的炔基或烯基，其另一側(cè)為環(huán)丙基、苯環(huán)、取代苯環(huán)、取代萘環(huán)、各種取代的六元雜環(huán)、各種取代的五元雜環(huán)、各種取代的六元并五元雜環(huán)、各種取代的六元并六元雜環(huán)、各種取代的五元并五元雜環(huán)、各種取代的苯并五元雜環(huán)或各種取代的苯并六元雜環(huán)以及各種不同長度的烴鏈結(jié)構(gòu)；

R²，R³各自獨(dú)立的為：H，鹵素，氰基，C₁-C₆烷基，C₁-C₆烷氧基，C₂-C₆烯基，三氟甲基，氨基或羥基氰基乙烯基；

R⁴為：取代苯環(huán)、取代萘環(huán)、各種取代的六元雜環(huán)、各種取代的五元雜環(huán)、各種取代的六元并五元雜環(huán)、各種取代的六元并六元雜環(huán)、各種取代的五元并五元雜環(huán)、各種取代的苯并五元雜環(huán)或各種取代的苯并六元雜環(huán)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，

R¹為具有通式III或IV的苯環(huán)、環(huán)丙基、單取代苯環(huán)、雙取代苯環(huán)、未取代苯環(huán)或吡啶環(huán)、取代吡啶環(huán)、烴鏈；

其中，

R⁵為H₂NC₆H₄、HOOCC₆H₄、C₅NH₄、C₃H₅、OH、C₆H₅、CONHC₆H₄或F₃CC₆H₄；

R⁶為C₆H₅或CH₃C₆H₄。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，

R⁴為具有通式V的取代苯環(huán)；

其中，R⁷為SO₂NH₂、CONH₂或CN。

本發(fā)明中所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指在可靠的醫(yī)藥評價(jià)范圍內(nèi)，化合物的鹽類適于與人或較低等動物的組織相接觸而無不適當(dāng)?shù)亩拘?、刺激及過敏反應(yīng)等，具有相當(dāng)合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其預(yù)期的用途。包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽和藥學(xué)上可接受的堿加成鹽，在這里是可做預(yù)期的用途并與式I、II化合物的化學(xué)性質(zhì)相容的。適宜的鹽的列表參見S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19頁。

本發(fā)明中所述的“前藥”是指藥學(xué)上可接受的衍生物，以便這些衍生物所得的生物轉(zhuǎn)換產(chǎn)物是如式I、II化合物所定義的活性藥物。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，通式I或II所示的取代二芳基嘧啶類衍生物為具有下列通式的化合物之一：

其中，R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶同上述通式I或II所示。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，通式I或II所示的取代二芳基嘧啶類衍生物是如下化合物之一：

2.取代二芳基嘧啶類衍生物的合成路線與制備方法

取代二芳基嘧啶類衍生物的制備方法，步驟如下：以化合物1為起始原料，與4-氨基苯腈于180℃進(jìn)行熔融反應(yīng)，生成的中間體2與三氯氧磷在100℃條件下回流生成中間體3；原料4在碘化亞銅和雙(三苯基膦)二氯化鈀做催化劑，三乙胺做堿的條件下與炔基取代的中間體發(fā)生薗頭耦合反應(yīng)得到炔基取代的中間體化合物5，此外，原料4在醋酸鈀條件下與烯基取代的中間體發(fā)生赫克反應(yīng)得到烯基取代的中間體5；中間體3與中間體5在DMF作溶劑，碳酸鉀的堿性條件發(fā)生取代反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物I；另外，以中間體6為起始原料與中間體5溶于N,N-二甲基甲酰胺在室溫下反應(yīng)得到中間體7，然后中間體7在N,N-二甲基甲酰胺中與N-Boc-4-氨基哌啶反應(yīng)并隨后在三氟乙酸條件下脫Boc基團(tuán)保護(hù)生成關(guān)鍵中間體9；最后此關(guān)鍵中間體9在N,N-二甲基甲酰胺溶液中和碳酸鉀做堿的條件下，與各種取代芳鹵反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物II；

合成路線如下：

試劑及條件：a：4-氨基苯腈，180℃，熔融法，8h；b：三氯氧磷，0.5h；c：中間體5，碳酸鉀，N,N-二甲基甲酰胺，100℃，10h；d：(i)取代苯乙炔，雙三苯基磷二氯化鈀，碘化亞銅，取代苯酚，三乙胺，四氫呋喃，60℃，10h；(ii)取代苯乙烯，醋酸鈀，Tol₃P，4-碘-2,6-二甲基苯酚，乙醇鈉，N,N-二甲基乙酰胺，60℃，10h；e：取代苯乙炔，碳酸鉀，N,N-二甲基甲酰胺，室溫；f：N-Boc-4-氨基哌啶，碳酸鉀，N,N-二甲基甲酰胺，120℃，12h；g：三氟乙酸，二氯甲烷，室溫，5h；h：取代芳鹵，碳酸鉀，N,N-二甲基甲酰胺，室溫。

R¹、R²、R³、R⁴、n同上述通式I或II所示。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，取代二芳基嘧啶類衍生物的制備方法，具體步驟如下：

(1)準(zhǔn)確稱量起始原料1對氨基苯腈于反應(yīng)瓶，氮?dú)獗Ｗo(hù)，升溫至180℃反應(yīng)8h；反應(yīng)完全后，用乙腈溶解反應(yīng)物，超聲處理，過濾，用乙腈洗滌濾餅，固體干燥得到中間體化合物2的粗品；

(2)準(zhǔn)確稱取中間體2，溶于三氯氧磷中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，100℃回流0.5h；反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液，將反應(yīng)液緩慢滴加入干凈的冰水中淬滅三氯氧磷，劇烈攪拌后，過濾，沉淀用水溶解，氫氧化鈉調(diào)pH等于7，再次過濾，干燥得黃色固體；丙酮重結(jié)晶，析出固體即為中間體3的純品；

(3)準(zhǔn)確稱量起始原料4溶于四氫呋喃，依次加入炔類取代基、雙(三苯基膦)二氯化鈀、碘化亞銅、三乙胺,氮?dú)獗Ｗo(hù)，60℃回流10h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用硅藻土過濾，溶液用飽和氯化鈉溶液萃取，濾液蒸干后拌樣，柱分離，得中間體5；原料為烯類取代基時(shí)，將其與中間體4、醋酸鈀、Tol₃P、乙醇胺溶于N,N-二甲基乙酰胺，升溫至60℃反應(yīng)10h；反應(yīng)結(jié)束后，溶劑減壓蒸干，用乙酸乙酯/石油醚體系柱分離得到中間體5；

(4)準(zhǔn)確稱取中間體3、中間體5和碳酸鉀溶于DMF，100℃反應(yīng)10h；反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾液蒸干，柱分離，乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶后得到目標(biāo)產(chǎn)物I；

(5)準(zhǔn)確稱取中間體6、中間體5和碳酸鉀溶于DMF，室溫反應(yīng)10h；反應(yīng)結(jié)束后，過濾，減壓蒸干，柱分離得到中間體7；

(6)向中間體7的N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入N-Boc-4-氨基哌啶、碳酸鉀，升溫至120℃反應(yīng)12h；反應(yīng)冷卻后，向反應(yīng)液滴加冰水，混懸液過濾得到中間體8的粗品；

(7)將上步得到的中間體8溶于二氯甲烷，緩慢滴加三氟乙酸，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)結(jié)束后用飽和碳酸氫鈉調(diào)pH至10，二氯甲烷萃取，干燥后柱分離得到中間體9；

(8)將關(guān)鍵中間體9和取代芳鹵溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入碳酸鉀，室溫?cái)嚢柽^夜；反應(yīng)結(jié)束，混合液減壓蒸干，用乙酸乙酯萃取三次，飽和食鹽水洗滌三次有機(jī)層，干燥，過濾蒸干，柱分離，乙酸乙酯/石油醚重結(jié)晶后得到目標(biāo)產(chǎn)物II。

本發(fā)明所述的室溫是指20-30℃。

3.取代二芳基嘧啶類衍生物的抗HIV-1野生株及突變株活性及應(yīng)用

對按照上述方法合成的部分取代二芳基嘧啶類衍生物進(jìn)行了細(xì)胞水平的抗HIV-1(IIIB)，單耐藥突變株L100I、K103N、Y181C、Y188L以及雙耐藥突變株RES056(K103N/Y181C)、F227L/V106A的活性篩選。此外，合成的化合物還進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄酶水平的測試；其中抗HIV活性結(jié)果如表1所示，取代二芳基嘧啶類衍生物具有顯著的抗HIV-1活性，且所有化合物的EC₅₀值皆達(dá)納摩爾或亞納摩爾水平，其中有8個化合物(IA-1-3、IA-1-4、IA-1-5、IA-1-6、IA-1-8)對野生株活性達(dá)個位數(shù)納摩爾級；而且化合物對耐藥株(E138K、K103N、L100I)具有顯著的抑制作用(表2)，部分化合物達(dá)到納摩爾水平。因此取代二芳基嘧啶類衍生物具有進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值，可作為抗HIV-1的先導(dǎo)化合物加以利用。

本發(fā)明的取代二芳基嘧啶類衍生物可作為非核苷類HIV-1抑制劑應(yīng)用。具體地說，作為HIV-1抑制劑用于制備抗艾滋病藥物。

一種抗HIV-1藥物組合物，包括本發(fā)明的取代二芳基嘧啶類衍生物和一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑。

本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)全新的取代二芳基嘧啶類衍生物、其制備方法、其抗HIV-1活性篩選結(jié)果及其在抗病毒領(lǐng)域中的首次應(yīng)用。經(jīng)過試驗(yàn)證明，本發(fā)明的取代二芳基嘧啶類衍生物可作為HIV-1抑制劑應(yīng)用并具有很高的應(yīng)用價(jià)值。具體地說，作為HIV-1抑制劑用于制備抗艾滋病藥物。

具體實(shí)施方式

通過下述實(shí)例有助于理解本發(fā)明，但是不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。

實(shí)施例中所涉及的合成路線如下：

合成路線一：

合成路線二：

實(shí)施例1：中間體4-((4-氯嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈的制備

4-((4-氧代-1,6-二氫嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈(2)的制備

稱取2-(甲硫基)嘧啶-4(3H)-酮(3g,21mmol)和4-氨基苯甲腈(2.99g,25mmol)于50mL圓底燒瓶，氮?dú)獗Ｗo(hù)，緩慢升溫到180℃，反應(yīng)8h。反應(yīng)冷卻后，加入20mL乙腈超聲處理，過濾，濾餅用乙腈洗滌，TLC檢測無4-氨基苯甲腈殘留，干燥濾餅得到淡黃色固體即為4-((4-氧代-1,6-二氫嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈，產(chǎn)率73.6％,ESI-MS:m/z 213.3[M+H]⁺,C₁₁H₈N₄O(212.12).

中間體4-((4-氯嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈的制備

準(zhǔn)確稱取4-((4-氧代-1,6-二氫嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈(0.80g,3.8mmol)，加入5mL三氯氧磷，100℃攪拌回流0.5h。反應(yīng)冷卻后，將混合物緩慢滴加到50mL冰水混合物中，猛烈攪拌，過濾，得到的濾餅再溶于水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7后再次過濾，干燥得到黃色固體即4-((4-氯嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈。產(chǎn)率：71.3％；1H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.58(s,1H),8.55(d,J＝5.2Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.87(dd,4H,Ph-H),7.13(d,J＝5.2Hz,1H,C6-pyrimidine-H)；EI-MS:231.2[M+H]⁺,C₁₁H₇ClN₄(230.04).

實(shí)施例2：目標(biāo)化合物的制備

4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯酚的制備

稱取3-氨基苯乙炔(0.1g，0.85mmol)，4-碘-2,6-二甲基苯酚(0.254g，1.0mmol)，雙三苯基磷二氯化鈀(0.0359g，0.51mmol)，碘化亞銅(0.0195g，1.0mmol)，三乙胺(0.06g，0.6mol)溶于無水四氫呋喃，氮?dú)獗Ｗo(hù)，60℃反應(yīng)10h，TLC檢測反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用硅藻土過濾，減壓蒸干，向殘留底物中加入30mL乙酸乙酯，飽和食鹽水溶液洗滌3次，每次10mL，分取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮?？焖僦鶎游龇蛛x得到中間體4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯酚。

4-((4-(4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯氧基)嘧啶-2-基)氨基)的制備

稱取4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯酚(0.05g，0.21mmol),4-((4-氯嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈(0.049g，0.21mmol)，碳酸鉀(0.035g，0.25mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺，100℃反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸干溶劑，然后向殘留底物中加入30mL乙酸乙酯，飽和食鹽水溶液洗滌3次，每次10mL，分取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮?？焖僦鶎游龇蛛x得到目標(biāo)化合物，進(jìn)而在乙酸乙酯-石油醚體系中重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物IA-1-1。

產(chǎn)物為黃色粉末，收率：70％，熔點(diǎn)：180-183℃。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.15(s,1H,NH),8.48(d,J＝5.7Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.63(d,J＝8.5Hz,2H,Ph-H),7.51(d,J＝8.8Hz,2H,Ph-H),7.42(s,2H,Ph-H),7.07(t,J＝7.8Hz,Ph-H),6.76(t,J＝1.9Hz,1H,Ph-H),6.70(dt,J＝7.5,1.2Hz,1H,Ph-H),6.60-6.67(m,2H,C5-pyrimidine-H,Ph-H),5.26(s,2H，NH₂),2.09(s,6H，2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.83,160.85,159.64,150.19,149.30,145.05,133.05,132.14,131.68,129.69,122.96,120.50,119.85,119.32,118.75,116.63,115.09,102.99,99.37,90.37,87.83,16.30；ESI-MS:432.5[M+H]⁺.C₂₇H₂₁N₅O(431.50).

操作同上，所不同的是使用4-((4-羥基-3,5-二甲基苯基)乙炔基)苯甲酸。

產(chǎn)物為淡黃色粉末，收率：67％，熔點(diǎn):273-281℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ13.10(s,1H,carbonyl-H),10.16(s,1H,NH),8.49(d,J＝5.7Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.99(d,2H,Ph-H),7.69(d,2H,Ph-H),7.62(d,J＝8.5Hz,2H,Ph-H),7.51(m,4H,Ph-H),6.66(d,J＝5.6Hz,1H,C5-pyrimidine-H),2.10(s,6H,2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.77,167.15,160.90,159.62,150.76,145.02,133.04,132.44,131.94,131.06,130.06,127.09,119.84,119.68,118.74,103.01,99.37,91.96,88.73,16.31；ESI-MS:459.4[M-H]^﹣.C₂₈H₂₀N₄O₃(460.49).

操作同上，所不同的是使用2,6-二甲基-4-(吡啶-3-基乙炔基)苯酚。

產(chǎn)物為白色晶體，收率：89％，熔點(diǎn)：220-223℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.16(s,1H,NH),8.78(dd,J＝2.2,0.9Hz,1H,pyridine-H),8.61(dd,J＝4.9,1.7Hz,1H,pyridine-H),8.49(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),8.00(dt,J＝7.9,1.9Hz,1H,pyridine-H),7.61(d,J＝8.6Hz,2H,Ph-H),7.46-7.54(m,5H,Ph-H,pyridine-H),6.67(d,J＝5.6Hz,1H,C5-pyrimidine-H),2.10(s,6H，2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.76,160.92,159.62,152.04,150.76,149.48,145.01,138.96,133.05,132.40,131.91,124.13,119.90,119.84,119.59,118.75,103.01,99.37,92.28,86.25,16.31；ESI-MS:418.5[M+H]⁺.C₂₆H₁₉N₅O(417.47).

操作同上，所不同的是使用2,6-二甲基-4-(吡啶-2-基乙炔基)苯酚。

產(chǎn)物為白色晶體，收率：86％，熔點(diǎn)：213-216℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.15(s,1H，NH),8.63(dd,J＝4.9,1.8,1.0Hz,1H,pyridine-H),8.49(d,J＝5.7Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.87(td,J＝7.8,1.8Hz,1H,pyridine-H),7.66(dt,J＝7.8,1.1Hz,1H,pyridine-H),7.62(d,J＝8.6Hz,2H,Ph-H),7.51(m,4H,Ph-H),7.43(m,1H,pyridine-H),6.67(d,J＝5.6Hz,1H,C5-pyrimidine-H),2.11(s,6H,2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.76,160.91,159.62,150.91,150.66,145.02,142.80,137.28,133.05,132.58,131.96,127.75,123.98,119.83,119.30,118.73,103.01,99.40,89.13,88.34,16.32；ESI-MS:418.6[M+H]⁺.C₂₆H₁₉N₅O(417.47).

操作同上，所不同的是使用(環(huán)丙基乙炔基)-2,6-二甲基苯酚

產(chǎn)物為白色晶體，收率：79％，熔點(diǎn)：227-229℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.14(s,1H,NH),8.46(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.62(s,2H,Ph-H),7.53(m,4H,Ph-H),6.65(d,J＝5.6Hz,1H,C5-pyrimidine-H),2.03(s,6H,2CH₃)；0.92(m,1H,CH),0.85(m,2H,CH₂),0.75(m,2H,CH₂)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.63,160.89,159.56,150.09,145.03,137.63,133.79,133.02,119.85,118.73,102.97,99.38,91.06,16.00,13.41,0.52；ESI-MS:381.5[M+H]⁺.C₂₄H₂₀N₄O(380.45).

操作同上，所不同的是使用4-(4-羥基丁-1-炔-1-基)-2,6-二甲基苯酚

產(chǎn)物為黃色晶體，收率：49％，熔點(diǎn)：181-183℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.13(s,1H,NH),8.46(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.60(d,J＝8.6Hz,2H,Ph-H),7.49(d,J＝8.8Hz,2H,Ph-H),7.27(s,2H,Ph-H),6.62(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),4.91(t,J＝5.6Hz,1H,-OH),3.62(q,J＝6.7Hz,2H,CH₂),2.58(t,J＝6.9Hz,2H,CH₂),2.04(s,6H,2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.83,160.82,159.62,149.72,145.03,133.03,132.14,131.38,121.12,119.84,118.71,102.96,99.32,88.49,80.99,60.35,23.76,16.26；ESI-MS:385.5[M+1]⁺,402.5[M+NH3]⁺.C₂₃H₂₀N₄O₂(384.22).

操作同上，所不同的是使用2,6-二甲基-4-(苯基乙炔基)苯酚。

產(chǎn)物為淡黃色粉末，收率：53％熔點(diǎn)：198-201℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.16(s,1H,NH),8.48(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.55-7.66(m,4H,Ph-H),7.51(d,J＝8.7Hz,2H,Ph-H),7.45(d,J＝5.9Hz,5H,Ph-H),6.66(d,J＝5.6Hz,1H,C5-pyrimidine-H),2.09(s,6H,2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.80,160.89,159.63,150.42,145.03,137.64,133.79,133.04,132.25,131.78,129.26,122.74,120.17,119.84,118.75,103.00,99.36,89.41,89.26,16.30；ESI-MS:417.5[M+1]⁺.C₂₇H₂₀N₄O(416.48).

操作同上，所不同的是使用N-(3-((4-羥基-3,5-二甲基苯基)乙炔基)苯基)乙酰胺。

產(chǎn)物為淡黃色粉末，收率：41％，熔點(diǎn)：251-252℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.14(s,1H,NH),10.06(s,1H,NH),8.48(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.91(t,J＝1.8Hz,1H,Ph-H),7.63(d,J＝8.6Hz,2H,Ph-H),7.47-7.57(m,5H,Ph-H),7.36(t,J＝7.9Hz,1H,Ph-H),7.23(dt,J＝7.6,1.3Hz,1H,Ph-H),6.65(d,J＝5.6Hz,1H,C5-pyrimidine-H),2.09(s,6H,2CH₃),2.07(s,3H,CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ169.03,168.81,160.86,159.64,150.42,145.03,140.07,133.06,132.28,131.77,129.69,126.45,123.00,121.84,120.09,119.84,118.75,103.00,99.38,89.40,88.99,24.52,16.30；ESI-MS:474.4[M+H]⁺,496.5[M+Na]⁺.C₂₉H₂₃N₅O₂(473.54).

操作同上，所不同的是使用4-((4-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯酚。

產(chǎn)物為棕色粉末，收率：63％熔點(diǎn)：195-198℃。

H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.15(s,1H,NH),8.47(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.62(d,J＝8.6Hz,2H,Ph-H),7.51(d,J＝8.9Hz,2H,Ph-H),7.35(s,2H,Ph-H),7.22(d,J＝8.5Hz,2H,Ph-H),6.58(d,J＝8.5Hz,2H,Ph-H),6.63(d,J＝5.7Hz,1H,C5-pyrimidine-H),5.59(s,2H,NH₂),2.07(s,6H,2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.89,160.82,159.64,149.92,149.63,145.05,133.04,133.00,131.71,131.49,121.37,119.85,118.74,114.16,108.67,102.97,99.33,91.34,86.35,16.30；ESI-MS:432.6[M+H]⁺.C₂₇H₂₁N₅O(431.50).

實(shí)施例3：目標(biāo)化合物的制備

2,6-二甲基-4-苯乙烯基苯酚的制備

稱取苯乙烯(0.177g，1.5mmol)，4-碘-2,6-二甲基苯酚(0.248g，1.0mmol)，醋酸鈀(0.0224g，0.1mmol)，Tol₃P(0.091g，0.3mmol)，乙醇鈉(0.184g，2.3mmol)于雙頸瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)狀態(tài)下用恒壓滴液漏斗滴加N,N-二甲基乙酰胺，升溫至60℃，反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，快速柱分離得到中間體5的粗品。

(E)-4-((4-(2,6-二甲基-4-苯乙烯基苯氧基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲腈

操作同IB-1-1的制備，所不同的是使用2,6-二甲基-4-苯乙烯基苯酚。

產(chǎn)物為白色晶體，產(chǎn)率：38％，熔點(diǎn)；222-224℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.15(s,1H,NH),8.47(d,J＝5.6Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.69-7.59(m,4H,Ph-H),7.47(d,J＝8.4Hz,4H,Ph-H),7.40(m,2H,J＝16Hz,tran-CH₂＝CH₂-),7.32-7.25(m,3H,Ph-H),6.63(d,J＝5.6Hz,1H，C5-pyrimidine-H),2.10(s,6H，2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ169.08,160.71,159.69,149.45,149.33,145.09,138.24,137.47,135.32,135.22,134.81,133.03,131.06,131.02,129.79,129.08,128.96,128.81,127.99,127.40,127.30,127.20,127.16,126.84,124.21,119.83,118.73,102.90,99.34,21.50,21.31,16.60,15.99；ESI-MS:419.3[M+H]⁺.C₂₇H₂₂N₄O(418.50).

操作同上，所不同的是使用2,6-二甲基-4-(4-甲基苯乙烯基)苯酚。

產(chǎn)物為淡黃色晶體，產(chǎn)率：43％熔點(diǎn)：212-214℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.15(s,1H,NH),8.46(d,J＝5.6Hz,1H，C6-pyrimidine-H),7.71-7.58(m,5H,Ph-H),7.47(d,J＝7.7Hz,5H),7.40(m,2H,J＝16Hz,tran-CH₂＝CH₂-),7.33-7.23(m,3H),6.63(d,J＝5.7Hz,1H,C5-pyrimidine-H),2.11(s,6H,2CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ169.07,160.73,159.69,149.49,145.09,137.58,135.16,133.79,133.04,131.07,129.20,128.88,128.18,128.07,127.35,126.90,119.82,118.74,102.90,99.36,16.60,15.99；ESI-MS:433.5[M+H]⁺.C₂₈H₂₄N₄O(432.53).

實(shí)施例4：目標(biāo)化合物的制備

(4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯氧基)-N-(哌啶-4-基)嘧啶-2-胺的制備

稱取化合物2,4-二氯嘧啶(50.0mmol)，4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯酚(50.0mmol)于10mL DMF中，無水碳酸鉀(60.0mmol)，室溫條件下攪拌10h(TLC檢測反應(yīng)完畢)?？焖僦鶎游龇蛛x得到目標(biāo)化合物，進(jìn)而在乙酸乙酯-石油醚體系中重結(jié)晶得粗品。得到的粗品(0.3g,0.86mmol)，N-Boc-4-氨基哌啶(0.21g,1.0mmol)與碳酸鉀(0.15g,1.7mmol)于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，然后加熱回流12小時(shí)。待反應(yīng)冷卻到室溫以后，慢慢地將反應(yīng)液滴加到20mL水溶液中，攪拌，有大量固體生成。過濾，干燥得粗品4-((4-(4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯氧基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯。稱取該粗品(0.60g,1.5mmol)溶于5mL二氯甲烷中，然后慢慢地向其中加入三氟乙酸(0.74mL,10mmol)，室溫條件下攪拌5小時(shí)(TLC檢測反應(yīng)完畢)。向反應(yīng)液中加入10mL水，用飽和的碳酸氫鈉水溶液調(diào)PH為10，二氯甲烷萃取(3×5mL)，飽和食鹽水水洗，分取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥。然后進(jìn)行快速柱層析分離得到白色固體即為化合物(4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯氧基)-N-(哌啶-4-基)嘧啶-2-胺。

3-(4-((4-(4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯氧基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)的制備

稱取化合物4-((3-氨基苯基)乙炔基)-2,6-二甲基苯氧基)-N-(哌啶-4-基)嘧啶-2-胺(0.48mmol)于10mL DMF中，室溫條件下攪拌溶解后加入無水碳酸鉀(0.13g,0.96mmol)與取代的氯芐或溴芐(0.58mmol)，室溫條件下攪拌12h(TLC檢測反應(yīng)完畢)。減壓蒸干溶劑后向殘留底物中加入30mL乙酸乙酯，飽和食鹽水溶液洗滌3次，每次10mL，分取有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。快速柱層析分離得到目標(biāo)化合物，進(jìn)而在乙酸乙酯-石油醚體系中重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物IA-1-1。

產(chǎn)物為淡黃色晶體，收率：43％熔點(diǎn)：113-115℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.18(s,1H,-NH₂),7.89(s,1H,-NH₂),7.48-6.94(m,8H,C6-pyrimidine-H,Ph-H),6.79-6.51(m,3H,Ph-H,C5-pyrimidine-H),6.15(s,1H,NH),5.24(s,2H,NH₂),3.53-3.92(m,4H,piperidine-H),2.86-2.63(m,1H,piperidine-H),2.07(s,6H,2CH₃),1.23(s,4H,piperidine-H),0.93-0.74(m,1H,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ168.71,151.23,149.27,135.39,131.62,129.66,129.22,122.98,120.07,119.25,117.98,116.56,60.22,48.22,29.48,22.56,21.23,16.37,14.56；ESI-MS:533.5[M+H]⁺.C₃₂H₃₂N₆O₂(532.65).

操作同上，所不同的是使用4-甲砜基溴芐。

產(chǎn)物為淡黃色晶體，收率：43％熔點(diǎn)：159-161℃。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15(d,J＝5.5Hz,1H,C6-pyrimidine-H),7.75(s,2H,Ph-H),7.43(s,2H,Ph-H),7.30(s,2H,Ph-H),7.29(s,2H,-SO₂NH₂),7.06(t,J＝7.8Hz,1H,Ph-H),6.72(s,1H,NH),6.70-6.56(m,2H,Ph-H),6.13(d,J＝5.5Hz,1H,C5-pyrimidine-H),5.25(s,2H,NH₂),3.69(s,1H,piperidine-H),3.37-3.59(m,2H,piperidine-H),2.55-2.87(m,2H,piperidine-H),2.04(s,6H,2CH₃),1.2-1.8(m,6H,piperidine-H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.78,149.30,131.61,129.69,129.40,126.04,123.04,120.06,119.24,116.57,115.01,95.61,94.00,90.11,61.98,52.66,31.50,22.57,16.34；ESI-MS:583.4[M+H]⁺.C₃₂H₃₄N₆O₃S(582.72).

實(shí)施例5：目標(biāo)化合物的體外抗HIV活性測試實(shí)驗(yàn)

測試原理：

化合物體外抗HIV活性篩選采用MTT法。MTT全稱為溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮(商品名：噻唑藍(lán)),可用于檢測細(xì)胞的存活和生長。檢測原理為：MTT可以與活的細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶結(jié)合還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞并無此功能。二甲基亞砜可以溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀檢測其在590nm下的吸光度(A)值可以間接的反映活細(xì)胞的數(shù)量。在一定的細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

由于HIV感染的MT-4細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)(5-7天)會發(fā)生病變，因此向HIV感染的MT-4細(xì)胞懸濁液中加入適當(dāng)濃度的待檢測化合物溶液，經(jīng)過一段時(shí)間(5-7天)的培養(yǎng)后，用MTT分析法測定MT-4細(xì)胞活力，得到保護(hù)50％細(xì)胞免于細(xì)胞病變的藥物濃度(EC₅₀)即可得出目標(biāo)化合物的抗HIV的活性。同時(shí)得到目標(biāo)化合物使50％未感染HIV的細(xì)胞發(fā)生病變的濃度(CC₅₀)，計(jì)算出選擇系數(shù)(selectivity index，SI＝CC₅₀/EC₅₀)。

測試材料和方法：

(1)HIV-1(III_B)、HIV-2(ROD)毒株、各種HIV-1耐藥株：由比利時(shí)魯汶大學(xué)醫(yī)學(xué)院Rega研究所提供。

(2)MT-4細(xì)胞：由比利時(shí)魯汶大學(xué)醫(yī)學(xué)院Rega研究院提供。

(3)MTT：購自美國Sigma公司。

(4)樣品處理：樣品臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度，并用雙蒸水作5倍稀釋，各5個稀釋度。

(5)陽性對照藥：奈韋拉平(NVP)、依法韋侖(EFV)、依曲韋林(TMC125)、齊多夫定(AZT)、地拉韋啶(DLV)、利匹韋林(TMC278)。

(6)測試方法：樣品稀釋后加入到HIV感染MT-4細(xì)胞懸濁液中，經(jīng)過一段時(shí)間后用MTT比色法測定細(xì)胞活力，用酶標(biāo)儀中記錄在590nm下的吸光度(A)值,計(jì)算出EC₅₀、CC₅₀以及SI。

(7)MTT比色法：加入樣品溶液培養(yǎng)一段時(shí)間后，向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)后，棄染色液，并向每孔加入150μL DMSO，充分混合，用酶標(biāo)儀中測定590nm下的吸光度(A)值。

實(shí)驗(yàn)方法：

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加入50μL含1×10⁴MT-4細(xì)胞培養(yǎng)液，再分別加入20μL感染HIV-1(III_B或者RES056)或HIV-2(ROD)的MT-4細(xì)胞混懸液(每毫升含100倍CCID₅₀)或者空白培養(yǎng)基(毒性測定)，然后加入不同濃度的待測化合物溶液或者陽性對照藥物，每個濃度設(shè)計(jì)3個復(fù)孔。接著細(xì)胞在5％CO₂氛圍，37℃下培養(yǎng)5天，向每個孔中加入20μL(5mg/mL)MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后加入DMSO，使用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)溶液在540nm處的吸收度，計(jì)算化合物不同濃度下的細(xì)胞增值率P％。同時(shí)設(shè)空白和藥物對照組和陽性藥物對照組，由此計(jì)算化合物保護(hù)50％的細(xì)胞免于HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變所需濃度(EC₅₀)。選擇指數(shù)的計(jì)算：SI＝CC₅₀/EC₅₀。

按照上述實(shí)驗(yàn)方法對合成的部分取代二芳基嘧啶類衍生物進(jìn)行了細(xì)胞水平的抗HIV-1(III_B)，單突變株K103N、Y181C、Y188L以及雙突變株RES056(K103N/Y181C)的活性篩選，活性結(jié)果如表1和表2所示。

表1部分取代二芳基嘧啶類衍生物的抗HIV-1(IIIB)的抑制活性和細(xì)胞毒性(MT-4細(xì)胞)

注：^aEC₅₀:保護(hù)50％感染HIV-1的MT-4細(xì)胞免于細(xì)胞病變的化合物濃度；^bCC₅₀:使50％未感染HIV-1的細(xì)胞發(fā)生病變的化合物濃度；^c選擇性系數(shù):CC₅₀/EC₅₀的比值；TMC278、NVP、EFV、ETV、DLV分別代表上市藥物利匹韋林、奈韋拉平、依法韋倫、依曲韋林和地拉韋啶。

表2部分化合物對HIV耐藥毒株的抑制活性(MT-4細(xì)胞)

注：^aEC₅₀:保護(hù)50％感染HIV-1的MT-4細(xì)胞免于細(xì)胞病變的化合物濃度；TMC278、NVP、EFV、ETV、DLV分別代表上市藥物利匹韋林、奈韋拉平、依法韋倫、依曲韋林和地拉韋啶。

結(jié)論：

由表1和表2可以看出，本發(fā)明的取代二芳基嘧啶衍生物是一系列左翼含炔基且骨架新穎的非核苷類HIV-1抑制劑，其表現(xiàn)出了較好的抗HIV-1野生株和突變株活性。絕大部分化合物抑制野生株和突變株的EC₅₀值在達(dá)到納摩爾級別，其中，化合物IA-1-3的活性尤為突出，其對HIV-1野生株的EC₅₀值為0.003μM與最新一代藥物依曲韋林(ETV)相當(dāng)，其細(xì)胞毒性(CC₅₀＝3.476μM)較低，是依曲韋林的1.58倍，對HIV-1野生株的選擇性指數(shù)為1010，高于依曲韋林。此外，化合物IIA-1-3對突變株也表現(xiàn)出了較好的抑制活性，因此，取代二芳基嘧啶衍生物具有進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值，可作為抗HIV-1的先導(dǎo)化合物加以利用。