本申請是2012年10月17日遞交的申請?zhí)枮?01280060689.6，發(fā)明名稱為“細胞內(nèi)傳遞”的分案申請。

相關申請

本申請要求2011年10月17日遞交的美國臨時申請第61/548,013號的優(yōu)先權(quán)和2012年8月17日遞交的美國臨時申請第61/684,301號的優(yōu)先權(quán)，其每一篇的內(nèi)容通過引證在此并入本文。

聯(lián)邦贊助研究聲明

根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院授權(quán)的grant5rc1eb011187-02，本發(fā)明至少部分的被政府支持。政府享有本發(fā)明的特定權(quán)利。

背景技術：

許多制藥公司主要致力于研發(fā)小分子藥物。

之所以被稱為小分子藥物是由于這些藥物相對小的分子尺寸，這使其能夠在體內(nèi)自由擴散達到其靶點。這些分子還可以滑過其他作為極大阻礙的不可滲透的細胞膜。然而新一代的基于蛋白、dna或者rna的治療劑不能容易的穿過細胞膜，因此需要進行細胞修飾來加速傳遞。

已經(jīng)建立起來的方法使用化學或者電脈沖破壞細胞膜并將材料傳遞進入細胞質(zhì)。合適的細胞內(nèi)是研究、發(fā)開和實施下一代治療劑中至關重要的步驟。

現(xiàn)有的方法常常難以開發(fā)并很難對其特定的應用產(chǎn)生高度專一性。因此，現(xiàn)有技術無法合適的解決許多臨床上重要的細胞型(例如干細胞和免疫細胞)所具有的問題。因此，對更穩(wěn)定并更精確地技術存在需要，以期解決現(xiàn)代生物/醫(yī)學研究的需要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于一種出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即，受控制的損傷，例如，使細胞經(jīng)歷收縮、快速拉伸、快速壓縮、或者高剪切速率的脈沖，會導致細胞將分子從周圍的培養(yǎng)基中吸收入細胞質(zhì)。因此，本發(fā)明的特征在于一種含載體的微流體平臺，用于直接將材料傳遞到真核細胞細胞質(zhì)，所述材料例如化合物或者組合物。該裝置可有效作為一種靈活的并且廣泛應用的實驗室工具，用于將理想的分子傳遞靶細胞。使用這里所描述的方法將分子傳遞入細胞是成比例的，例如，與細胞通過收縮和/或壓力的速度呈線性比例的或者單調(diào)比例的。例如，在幾秒內(nèi)將50微升的細胞懸浮液通過該裝置。通量范圍在1個細胞/每秒每通道(或更少)至超過1000個細胞/每秒每通道之間。盡管細胞速度可以高達10m/s(或更高)，但一般通過收縮的細胞速度包括10mm/秒到500mm/秒。其他的通道可以平行放置從而增加系統(tǒng)的總通量。

分子的吸收是基于擴散的，而不是基于胞吞作用，即，通過本裝置的途徑之后，有效載荷(被傳遞到細胞中的化合物)存在于細胞質(zhì)中而不在于核內(nèi)質(zhì)中。在細胞被處理之后，只有很少的或者沒有所述有效載荷存在于核內(nèi)質(zhì)中。例如，大分子比小分子吸收的慢。受控制的細胞拉伸和細胞在收縮過程中的運動速度導致靶分子優(yōu)先傳遞，同時保持細胞的存活能力和完整性。在處理之后，細胞存活率在70-100％，例如，通常在處理之后存活率為90％。與此相比，之前的只使用高剪切速率傳遞幾秒鐘或者幾毫秒的方法會使細胞在處理之后具有很差的存活能力。與之前的技術相比，本發(fā)明的方法當細胞經(jīng)歷收縮時，使細胞在非常短的時間內(nèi)(大約100微秒)經(jīng)受范圍在100-1000帕的剪切脈沖。但是本發(fā)明的技術與之前的技術是完全不同的。在本發(fā)明的技術中，優(yōu)選細胞在經(jīng)歷收縮時發(fā)生完整的機械變形，與現(xiàn)有技術相比，這可以強化不同的剪切力。在優(yōu)選的實施方案中，細胞不經(jīng)歷電流。在另一個實施方案中，使用結(jié)合的方式處理，例如，使用這里描述的裝置實現(xiàn)機械變形，并在之后或者之前進行電穿孔(一種滲透轉(zhuǎn)染，其中使用電流在細胞膜上產(chǎn)生臨時的孔，從而允許核酸或者大分子進入)。

有效載荷是需要傳遞入細胞中的化合物或者組合物。例如，有效載荷可以包括蛋白質(zhì)、熒光染料、量子點、碳納米管、rna分子、dna分子、抗原或者其他大分子，納米顆粒和物質(zhì)的組合物。

分子向細胞的傳遞受到裝置收縮幅度、收縮部分長度、進入?yún)^(qū)域的地理結(jié)構(gòu)和裝置通道寬度的影響。優(yōu)選的，導管收縮部分的寬度是直徑不超過4微米，導管收縮部分的長度優(yōu)選在40-50微米。收縮部分的長度通常不會超過90微米。收縮部分的直徑與被處理的細胞類型有關。如下所述，該直徑小于細胞直徑(例如，是細胞直徑的20-99％)。許多細胞直徑在5-15微米之間，例如，樹突細胞直徑是7-8微米。例如，當處理單個細胞時，收縮部分的直徑是4.5、5、5.5、6或者6.5微米。在其他實施例中，處理人類卵子的收縮部分尺寸/直徑在6.2微米和8.4微米范圍內(nèi)，雖然也可以使用更大或者更小的收縮部分(人類卵細胞的直徑大約是12微米)。在另一個實施例中，使用直徑在12微米到17微米之間的收縮部分處理胚胎(例如，2-3個細胞的簇)。

所述裝置和方法能夠有效的用于疫苗研發(fā)和使用專門的抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)生產(chǎn)。例如，通過以下來進行刺激抗原呈遞的方法：將樹突狀細胞經(jīng)歷受控制的損傷，例如短時間的收縮或者高剪切力的脈沖，并且將樹突狀細胞與包括靶向抗原的溶液相接觸。這種方法與之前的刺激方法相比能夠產(chǎn)生高度活化的抗原呈遞細胞。將樹突狀細胞或者其他抗原呈遞細胞驅(qū)動穿過包含收縮部分的裝置(因此細胞經(jīng)受快速拉伸)，然后在含有有效載荷(例如，抗原)的溶液中培養(yǎng)細胞進行疫苗生產(chǎn)。在細胞快速變形之后，將細胞浸入含有一種或者更多種抗原的細胞培養(yǎng)基中，但是細胞在快速變形事件/過程之前、之中，和/或之后也可以與抗原相接觸。

選擇性的，可在流動的緩沖液中使用表面活性劑(例如，0.1-10％重量/重量，例如，泊洛沙姆、來自動物的血清、白蛋白)。分子向細胞中的傳遞不受表面活性劑是否存在的影響，然而，選擇性的，表面活性劑選擇性的減少裝置在操作期間的堵塞。

所述裝置由硅、金屬(例如，不銹鋼)、塑料(例如，聚苯乙烯)、陶瓷或者任何其他適合蝕刻微米級結(jié)構(gòu)特征的材料組成，并且包括一個或者更多個供細胞流通的通道或者導管。硅尤其合適，這是由于使用這種材料很好的建立了微光柵方法，因此，它比較容易制備新的裝置、改變的設計等等。另外，與其他柔軟的底物(比如，聚二甲基硅氧烷(pdms))相比，硅的硬度更具有優(yōu)勢，例如，更高的傳遞速率。例如，所述裝置包括2個、10個、20個、25個、45個、50個、75個、100個或者更多的通道。通過蝕刻硅微制備該裝置。使用壓力移動，例如，推動細胞穿過通到或者導管。細胞驅(qū)動器可以提供這種壓力。細胞驅(qū)動器包括，例如，壓力泵、氣瓶、壓縮機、真空泵、注射器、注射泵、蠕動泵、手動注射器、移液管、活塞、毛細管驅(qū)動和重力。作為通道的替代，細胞可以以網(wǎng)或者緊密放置的盤子的方式穿過收縮部分。在任意情況下，細胞穿過的收縮部分的寬度是被處理細胞在其自然無壓力狀態(tài)下寬度或者直徑的20-99％。溫度會影響組合物的吸收并影響生存能力。所述方法在室溫下(例如，20℃)、生理溫度(例如，39℃)下，比生理溫度更高的溫度或者更低的溫度(例如，4℃)下，或者在這些示例性的溫度之間的范圍內(nèi)進行。

通過收縮、拉伸、和/或高剪切率脈沖對細胞進行受控制的傷害，隨后在傳遞溶液中培養(yǎng)細胞，所述傳遞溶液包括希望引入細胞中的化合物或者分子。受控制的傷害特點是在細胞膜上的小損傷，例如，直徑為200納米。在通過收縮部分造成的損傷結(jié)束后幾分鐘是細胞的恢復時間。傳遞時間是1-10分鐘或者更久，例如，15分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘或更久，在室溫下操作時，2-5分鐘是最佳時間。在傳遞溶液中培養(yǎng)的時間越長不一定會增加吸收。例如，數(shù)據(jù)顯示，五分鐘后，幾乎沒有材料被細胞吸收。

因此，本發(fā)明為向細胞傳遞藥物領域長時間存在的問題提供了一種解決辦法，并且為之前的方法中存在的缺陷提供了解決方法。

關于向真核細胞傳遞的材料，細胞可以被分為兩種主要類型：

1)易于傳遞(etd)的細胞：絕大多數(shù)的化學品和病毒方法屬于此類。易于傳遞的細胞通常沒有直接的臨床關聯(lián)性。

2)難于傳遞(dtd)的細胞：高度臨床相關性。傳遞技術的進步能夠極大的促進新型治療劑的發(fā)展。這類細胞包括干細胞、初級細胞和免疫細胞。由于在未來幾年新型的rna、干細胞和蛋白基治療劑得到了極大的動力，可以預計dtd傳遞市場會快速發(fā)展。

雖然也可以對易于傳遞的細胞使用相同的技術，但這里描述的技術被證實對dtd研究領域尤其有效。此外，此方法還促進了不能用其他方法傳遞入易于傳遞的細胞或者難于傳遞的細胞中的材料(例如，量子點、碳納米管和抗體)的傳遞。

總之，在一個方面，本發(fā)明的實施方式能夠提供一種可以造成細胞膜擾動的微流體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括定義腔室的微流體通道，該通道被設置使得懸浮在緩沖液中的細胞可從其中穿過，其中，所述微流體通道包括一種收縮部分，其中，該收縮部分的直徑是細胞直徑的函數(shù)

本發(fā)明的實施方式還可以提供一種或者一種以上的如下特征。所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99％。所述通道的橫切面選自如下所組成的組中：圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。所述收縮部分包括入口部分、中心點和出口部分。所述入口部分定義了收縮角度，其中所述收縮角度最好能減少通道堵塞。所述微流體系統(tǒng)進一步包括一系列平行安置的微流體通道，例如，2個、5個、10個、20個、40個、45個、50個、75個、100個、500個、1000個或者更多的通道

總之，在另一個方面，本發(fā)明的實施方式還可以提供一種將化合物傳遞入細胞的方法，該方法包括，提供處于懸浮液中的細胞或者將細胞或者有效載荷懸浮在溶液中，將溶液穿過包括收縮部分的微流體通道，所述收縮部分的尺寸是細胞直徑的函數(shù)，將細胞通過所述收縮部分從而對細胞實施壓力，造成細胞足夠的擾動，從而使有效載荷通過，并且在通過收縮部分后，在溶液中培養(yǎng)細胞一段被預設的時間。

本發(fā)明的實施方式還可以提供一種或者一種以上如下特征。所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99％。所述通道的橫切面選自如下所組成的組中：圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。通過溶液包括從收縮部分的入口部分、中心點和出口部分通過所述溶液。該方法進一步包括通過調(diào)整入口部分的收縮角度減少微流體通道的堵塞。該方法包括從平行安置微流體通道中通過所述溶液。

總之，在依舊另一個方面，本發(fā)明的實施方式還可以提供一種將化合物傳遞入細胞的方法，所述方法包括，提供處于溶液中的細胞或者將細胞懸浮在溶液中，將溶液穿過包括收縮部分的微流體通道，所述收縮部分的尺寸是細胞直徑的函數(shù)，將細胞通過所述收縮部分從而對細胞實施壓力，造成細胞擾動，并且在通過收縮部分后，在含有有效載荷的溶液中培養(yǎng)細胞一段被預設的時間，其中，所述擾動應足夠大從而使有效載荷穿過。

本發(fā)明的實施方式還可以提供一種或者一種以上如下特征。所述收縮部分的直徑是從其中通過的細胞直徑的20-99％。所述通道的橫切面選自如下所組成的組中：圓形、橢圓形、狹長的細縫、方形、六角形和三角形。“通過溶液”包括從收縮部分的入口部分、中心點和出口部分通過所述溶液。該方法進一步包括通過調(diào)整入口部分的收縮角度減少微流體通道的堵塞?！巴ㄟ^溶液”包括從一系列串聯(lián)或并聯(lián)排列的微流體通道中通過溶液?！芭囵B(yǎng)”包括培養(yǎng)細胞0.0001秒到20分鐘(或者更長時間)。壓力是剪切力和壓縮力中的一種。

總之，在依舊另一個方面，本發(fā)明的實施方式還可以提供一種將化合物傳遞入細胞的方法，所述方法包括，提供處于溶液中的細胞或者將細胞懸浮在溶液中，使細胞變性從而在細胞膜上造成擾動，并在細胞變形后在含有有效載荷的溶液中培養(yǎng)所述細胞。

本發(fā)明的實施方式還可以提供一種或者一種以上如下特征?！笆辜毎冃巍卑ㄊ辜毎冃?μs到10ms，例如，10μs、50μs、100μs、500μs和750μs。培養(yǎng)0.0001秒到20分鐘，例如，培養(yǎng)1秒、30秒、90秒、270秒和900秒。

本發(fā)明不同的實施方式可以提供一種或者一種以上的如下性能。與現(xiàn)有技術相比，能夠?qū)崿F(xiàn)更準確和成規(guī)?；膫鬟f。材料可以自動被傳遞入細胞中?？梢詫⒉牧?例如蛋白質(zhì)、rna、sirna、肽、dna和滲透性染料)植入細胞(例如胚胎干細胞)或者誘導多能干細胞(ipscs)、初級細胞或者永生細胞系?？梢愿鶕?jù)不同的細胞類型修改這里所述的裝置和方法，還可以根據(jù)被處理的細胞制定收縮部分的尺寸。這里的方法和裝置可以提供明顯的優(yōu)勢。例如，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明技術可以降低現(xiàn)有系統(tǒng)中的實驗噪音。材料通過一種細胞群落的傳遞量是持續(xù)的。細胞可以被單獨處理而不必成批處理。本發(fā)明還介紹了一種相當獨特的機會來將各種各樣的納米顆粒和蛋白質(zhì)傳遞進入細胞質(zhì)。而現(xiàn)有的方法在進行此功能時是非常不可靠或者是無效的。

關于傳遞敏感型有效載荷，例如，蛋白質(zhì)(尤其是大蛋白質(zhì)，例如，大于30kda、50kda、100kda、150kda、200kda、300kda、400kda、500kda或更大)、量子點、或其他對電敏感或者容易被電破壞的有效載荷可以被可靠地傳遞如細胞并且保持所述敏感型有效載荷的完整性和活性。因此，本發(fā)明的裝置和方法與現(xiàn)存技術(例如電穿孔)相比具有明顯的優(yōu)勢，電穿孔使有效載荷組合物受電擊(因此破壞有效載荷)并導致降低的細胞存活率(例如，在電穿孔后通常有505或者更多的細胞死亡)?？焖倮?變形方法的另一個優(yōu)勢在于干細胞或者前體細胞被隨機選擇吸收有效載荷，并不改變被處理細胞的分化狀態(tài)或者活性。除了向細胞的細胞質(zhì)中傳遞組合物用于治療(例如，疫苗生產(chǎn))之外，該方法還可以用于引入分子，例如，向被標記的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(例如細胞器)中引入包括可檢測標記物的大分子，或者向被標記的胞內(nèi)成分中引入包括可檢測標記物的大分子用于診斷或者成像。

本發(fā)明不同的實施方式可以提供一種或者一種以上的如下性能?？梢詫na遞送至用于遞送劑量的細胞中，例如，干細胞，初級細胞、免疫細胞等等。也可以實現(xiàn)非常大的質(zhì)粒(甚至整個染色體)的傳遞。本發(fā)明還可以很容易的實現(xiàn)向細胞定量傳遞已知量的基因構(gòu)建物，從而研究所關心基因的表達水平及其對濃度的敏感性。已知量的dna序列與已知量的能提高dna重組的酶一起傳遞，從而實現(xiàn)更簡單/更有效的穩(wěn)定傳遞，實現(xiàn)同源重組、點特異性突變。這里所描述的方法和裝置還可以有效用于定量傳遞rna進行更有效的/結(jié)論性研究。將小干擾性rna傳遞進入細胞的細胞質(zhì)中也可以很容易的實現(xiàn)。

本發(fā)明不同的實施方式可以提供一種或者一種以上的如下性能?？梢詫na傳遞入細胞中，從而使rna在不需要脂質(zhì)體的情況下靜止。已知量的rna分子和已知量的dicer分子一起傳遞，從而使rna能夠標準地、有效地在不同的情況下通過多重細胞系?？梢詫rna引入細胞來研究轉(zhuǎn)錄后水平上的基因表達規(guī)則。已知量的rna標記物可用于研究rna和細胞的半衰期。還可以實現(xiàn)通用的蛋白傳遞。已知量的標記蛋白質(zhì)可以被傳遞從而研究其在細胞中的半衰期。還可以完成標記蛋白質(zhì)向研究的蛋白位點的傳遞。已知量的標記蛋白可以被傳遞從而研究胞內(nèi)環(huán)境下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用。還可以實現(xiàn)標記的抗體向活細胞中的傳遞進行免疫染色和熒光基的蛋白質(zhì)印跡。

本發(fā)明不同的實施方式還可以提供一種或者一種以上的如下臨床和研究性能。可以實現(xiàn)將藥物定量傳遞入細胞模型中進行改善的篩選的劑量研究。本發(fā)明還可以發(fā)展成一種高通量篩選細胞質(zhì)中蛋白活性從而幫助識別蛋白治療劑或者了解疾病發(fā)病機理的方法。由于現(xiàn)有的蛋白傳遞方法沒有效果，已經(jīng)嚴重限制了這些應用。本發(fā)明的裝置和技術可以有效將藥物在細胞內(nèi)傳遞到特定的循環(huán)血液細胞(例如，淋巴細胞)亞組，糖向細胞中的高通量傳遞可以改善細胞的低溫儲藏，尤其是卵母細胞的低溫儲藏，可以通過引入蛋白質(zhì)、mrna、dna和/或生長因子來改善靶細胞分化作用，基因或者蛋白材料的傳遞可以引起細胞的再進化，從而產(chǎn)生ips細胞，將dna和/或重組酶傳遞到胚胎干細胞中可以改善轉(zhuǎn)基因干細胞系，將dna和/或重組酶傳遞到受精卵中可以發(fā)展成轉(zhuǎn)基因器官、dc細胞活化、誘導的多能干細胞產(chǎn)生和干細胞分化，還可以實現(xiàn)納米顆粒傳遞以進行診斷和/或機理研究，以及還可以實現(xiàn)引入量子點。還可以使用這里介紹的裝置和方法修飾在整形手術中使用的皮膚細胞。

使用傳遞抗原和/或免疫刺激分子的方法刺激抗原呈遞作用會產(chǎn)生抗原呈遞細胞，例如，樹突狀細胞，同時與常用的刺激方法相比，上述方法能夠改善活性水平，因此導致增加的t細胞和b細胞介導的針對靶抗原的免疫作用水平。因此，這種方法可以被用作活化免疫系統(tǒng)響應癌癥或者感染的方法。

為了實現(xiàn)篩選、成像和診斷目的，在標記細胞的方法中使用本發(fā)明的裝置。通過使細胞經(jīng)歷受控制的損傷或者將細胞與包括可檢測的標記物的溶液相接觸來進行標記細胞的方法，其中，所述損傷包括短時間收縮或者高剪切率的脈沖。所述可檢測的標記物包括熒光分子、放射性核素、量子點、金納米顆?；蛘叽胖?。

在本發(fā)明之前，對干細胞進行處理以引入外源組合物是非常困難的。這里描述的裝置和方法，例如，使干細胞或者前體細胞(例如，誘導的多能干細胞(ipscs))通過收縮的通道，不會誘導分化，但是會可靠地誘導組合物被吸收到細胞中。例如，分化因子被誘導進入這些細胞中。在引入的因子被吸收之后，所述細胞按照引入的因子控制的分化途徑進行分化，將所述因子引入所述細胞時所使用的方法不會造成任何困難。

除了單個細胞之外，非常大的細胞，例如卵細胞(直徑大約為200微米)、細胞簇，例如包括2-3個細胞的胚胎也可以被處理來吸收目標組合物。調(diào)整孔徑尺寸從而使收縮部分寬度正好小于簇的尺寸。例如，通道的寬度是細胞簇寬度的20-99％。

分離/純化細胞或者細胞簇，或者富集需要的細胞類型。在本發(fā)明方法中使用的樹突狀細胞或者其他細胞(例如免疫細胞，比方說巨噬細胞、b細胞、t細胞或者干細胞，比如胚胎干細胞或者ips)被純化或者富集。例如，通過再起細胞表面標記物上表達或者其他可識別的特征分離或者富集細胞。通過其表達β-整合素、cd11c或其他可識別的細胞表面標記物的方法來識別并分離樹突狀細胞。關于這些細胞，術語“分離的”是指細胞基本上不含有其他細胞類型或者其天然存在的細胞材料。

例如，當某一特定組織或者表型的細胞樣品占整個細胞群落的60％時，該細胞樣品室“基本上純”的。優(yōu)選的，所述比例是細胞群落的至少75％、更優(yōu)選是至少90％，最優(yōu)選是至少99％或者100％。通過合適的標準方法測定細胞純度，例如，通過熒光激活的細胞分類法(facs)。

有效載荷組合物，例如多核苷酸、多肽或者其他試劑是純化的和/或分離的。具體的，如這里所使用的，當使用重組技術生產(chǎn)、使用化學前體或其他化學品化學合成時，“分離的”或者“純化的”核酸分子、多核苷酸、或者蛋白質(zhì)是基本上不含有其他細胞材料或者培養(yǎng)基的。純化的化合物的重量占所關心的化合物總重量的至少60％(干重)，優(yōu)選的，所述比例是占所關心的化合物重量的至少75％、更優(yōu)選的是至少90％，并且最優(yōu)選的是至少99％。例如，純化的化合物占所關心化合物總重量的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或者100％(重量/重量)。通過合適的標準方法測量純度，例如，通過柱狀色譜法、薄層色譜法、或者高效液相色譜法(hplc)分析。純化的或者分離的多核苷酸(核糖核酸(rna)或者脫氧核糖核酸(dna))不含有其天然存在狀態(tài)側(cè)鏈上的基因或者序列。分離的或者純化的核酸分子的實施例包括：(a)一種dna，這種dna的一部分是天然存在的基因dna分子，但是在其側(cè)鏈上不含有天然存在的器官基因組分子兩端的側(cè)鏈核酸序列；(b)整合入質(zhì)粒的核酸或者整合入原核或者真核細胞基因組dna的核酸，所得的分子與所有天然存在的載體或者基因組dna完全不同；(c)單獨的分子，例如cdna，基因組片段、聚合酶鏈式反應(pcr)所得的片段、或者限制性片段；和(d)重組核苷序列，作為雜合基因(即，編碼融合蛋白的基因)的一部分。本發(fā)明分離的核酸分子進一步包括合成的分子以及任何具有改變的化學結(jié)構(gòu)和/或具有修飾的骨架結(jié)構(gòu)的核酸。

懸浮溶液是任意生理緩沖液或者溶液，或者細胞-相容性緩沖液或者溶液。例如，懸浮溶液是細胞培養(yǎng)基或者磷酸鹽緩沖鹽水。有效載荷是相同的或者不同的懸浮溶液，可以包括需要傳遞到細胞內(nèi)部的組合物。

該裝置的優(yōu)點包括不需要對理想的有效載荷進行修飾并且不需要將有效載荷暴露于電磁場或者其他形式的外力中。關于電穿孔，這種方法會損傷蛋白質(zhì)并不能有效傳遞。這里描述的方法不存在這個重要問題；本發(fā)明的方法尤其適合于傳遞敏感的有效載荷，例如，蛋白質(zhì)，尤其是大蛋白質(zhì)(例如，40kda-70kda，或者分子量達到120、130、150、200kda以上)，大的核酸構(gòu)建物(例如質(zhì)粒及其他構(gòu)建物，包括1kb、2kb、5kb或更多的核酸聚合物，甚至整個染色體)6、大化合物，以及量子點(例如，直徑在12納米)或其他已知對電敏感并在與電接觸時容易受到損傷的材料。例如，當與電場接觸時，納米顆粒上的表面配體或者量子點會被損傷或者被充電，從而導致顆粒聚集，限制/消除其功能。受控制的損傷方法的另一個優(yōu)點在于將細胞與傳遞組合物接觸一定的時間。尤其對于蛋白質(zhì)來講，由于蛋白質(zhì)對蛋白酶、溫度和電敏感，與之前的方法相比，本方法在處理后將細胞與有效載荷溶液相接觸相對短的時間。所述裝置的微流體性能還需要更小的工作體積從而保存寶貴的原材料和/或細胞。該裝置還可以與現(xiàn)有的傳遞方法，例如電穿孔結(jié)合使用，或者與脂質(zhì)體結(jié)合使用，與各個方法單獨使用相比，這種結(jié)合會產(chǎn)生顯著提高的傳遞效果。

被傳遞的有效載荷的功能活性與流體剪切力成反比，也就是說，對細胞膜實施的物理壓力(例如拉伸細胞膜)能夠比剪切更好的調(diào)節(jié)有效載荷的吸收。傳統(tǒng)的納米顆粒傳遞方法會使更多的材料進入細胞的胞內(nèi)環(huán)境；然而與這里所描述的方法相比，傳統(tǒng)方法會降低被傳遞的材料的活性，這是由于傳統(tǒng)方法會使被傳遞的材料在核內(nèi)體中產(chǎn)生多價螯合作用。這里描述的方法產(chǎn)生直接向細胞質(zhì)傳遞的化合物/組合物，從而較少量的有效載荷被傳遞入細胞，但由于他們?nèi)菀捉咏渌毎|(zhì)組分，被傳遞的分子保持了更大量的功能活性。例如，之前用于傳遞納米顆粒的方法會傳遞2-10被的材料進入細胞，但是，由于被傳遞的材料在核內(nèi)體中發(fā)生多價螯合作用，被傳遞的細胞只有很少的功能活性或者沒有功能活性。通過避免內(nèi)涵體，本發(fā)明的裝置和方法能夠克服現(xiàn)有細胞內(nèi)傳遞方法所存在的問題。

其他優(yōu)勢和特征包括處理的時間規(guī)格和細胞速度比之前的方法要快很多。此外，其他方法不象這里所述的方法一樣擠壓細胞，例如，收縮部分的尺寸(直徑)由細胞的尺寸(直徑)決定(是細胞直徑的％)。這種快速、有力但是半抽打式、擠壓或者形變會導致細胞更好的吸收“直接至細胞液”的有效載荷。細胞突然發(fā)生形變，也就是說，形變基本上在1微秒到1毫秒之間發(fā)生。通常，細胞過度形變產(chǎn)生的外力會致死細胞，而同時，如果外力不足，不會產(chǎn)生細胞擾動。因此，本發(fā)明的主題內(nèi)容提供了一種方法和系統(tǒng)，所述方法和系統(tǒng)能夠產(chǎn)生足夠的外力誘導短時間擾動，但不會產(chǎn)生造成永久擾動的外力也不會致死細胞。

上面所述的任意方法都可以在試管中、體外或者或體內(nèi)進行。對于體內(nèi)應用，所述裝置可以被植入血管腔，例如，在內(nèi)嵌的血管支架中。在閱讀了隨后的附圖、詳細說明和權(quán)利要求之后，會更容易理解本發(fā)明的這些性能以及其他性能，以及本發(fā)明本身。

附圖說明

圖1a是微流體系統(tǒng)的示意圖。在經(jīng)過收縮部分后將細胞暴露于傳遞材料(有效載荷)。

圖1b是微流體系統(tǒng)的示意圖。在整個過程中，通過將細胞懸浮在包括傳遞材料(有效載荷)的溶液中將細胞與傳遞材料(有效載荷)相接觸(例如，在穿過所述收縮部分之前或者之后將所述細胞與傳遞材料相接觸)。

圖2a是微流體系統(tǒng)的一個實施方案的示意圖。

圖2b是微流體系統(tǒng)的示意圖，描述了深度、寬度和長度。

圖3是微流體系統(tǒng)的示意圖。

圖4是一種示意圖，顯示細胞壁上的擾動。

圖5是微流體系統(tǒng)的照片。

圖6是微流體系統(tǒng)的照片。

圖7是微流體系統(tǒng)的照片。

圖8a-8b是圖，顯示了微流體系統(tǒng)所獲得的示例性結(jié)果。

圖9是圖，顯示了使用微流體系統(tǒng)處理過的細胞所獲得的示例性結(jié)果。

圖10是圖，顯示了使用微流體系統(tǒng)處理過的細胞所獲得的示例性結(jié)果。

圖11是圖，顯示了使用微流體系統(tǒng)處理過的細胞所獲得的示例性結(jié)果。

圖12是微流體系統(tǒng)的示意圖。

圖13是圖，顯示了使用微流體系統(tǒng)處理過的細胞所獲得的示例性結(jié)果。

圖14是圖，顯示了使用微流體系統(tǒng)處理過的細胞所獲得的示例性結(jié)果。

圖15是圖，顯示了使用微流體系統(tǒng)處理過的細胞所獲得的示例性結(jié)果。

圖16a-16f是微流體系統(tǒng)的示例性示意圖。

圖17是使用微流體系統(tǒng)的方法的流程圖。

圖18a-18b是圖，顯示了使用微流體系統(tǒng)處理過的細胞所獲得的示例性結(jié)果。

圖19是覆蓋傳輸和共聚熒光圖，顯示了使用本發(fā)明的主題內(nèi)容與量子點(qds)一起處理的細胞的z切面共聚熒光圖

圖20a顯示了使用本發(fā)明的主題內(nèi)容方法將聚咪唑基配體(pil)涂布的量子點傳遞進入hela細胞細胞質(zhì)的傳遞效率。通過流式細胞儀測定細胞存活率>80％。

圖20b顯示了使用本發(fā)明的主題內(nèi)容傳遞平qd535后hela細胞的存貨率，所述存活率是碘化丙啶染色之后使用流式細胞儀測定的。

圖21顯示了構(gòu)建物設計，吸收和在各種介質(zhì)中的穩(wěn)定性。

圖22a顯示了被處理的細胞和參照細胞的活細胞共焦顯微鏡照片。

圖22b顯示了在綠和紅通道中，被處理的細胞強度隨時間的變化。

圖23顯示了流式細胞儀測定的平均細胞熒光度和存活率。

圖24顯示了在使用本發(fā)明裝置處理10nm量子點溶液之后，細胞的細胞質(zhì)中未聚集的單個量子點的落射熒光圖，以及自體熒光性的三個量子點的閃爍軌跡。

圖25顯示了一種實驗結(jié)果，證明傳遞行為取決于細胞速度和收縮部分設計。

圖26顯示了當傳遞太平洋藍共軛的3kda右旋糖苷之后，使用共焦顯微鏡測量的不同水平線的hela細胞的掃描圖。

圖27顯示了簡化的2d擴散模型，該模型刺激材料被動擴散通過被打孔的細胞膜。

圖28顯示了材料的雙重傳遞結(jié)果。

圖29顯示了與sirna、蛋白質(zhì)和納米顆粒傳遞有關的數(shù)據(jù)。

圖30顯示了本發(fā)明主題內(nèi)容穿過細胞性的能力。

圖31顯示了納米材料和抗體傳遞的數(shù)據(jù)。

圖32顯示了蛋白質(zhì)傳遞應用。

圖33是示例性細胞類型的表，其中，有效載荷被成功傳遞。

圖34的圖描述了一種系統(tǒng)，在此系統(tǒng)中，使用微流體裝置處理父母血液，從而傳遞例如大分子的有效載荷。

圖35顯示了使用10μιη-6μιη裝置傳遞傳遞有效載荷的人胚胎干細胞的傳遞效率和存活率。

圖36顯示了使用本發(fā)明主題內(nèi)容直接傳遞融合再編碼蛋白質(zhì)之后鼠和人ipsc細胞系的產(chǎn)生和定性

圖37描述了初級蛋白再編碼結(jié)果，并描述了ipsc克隆株中人胚胎干細胞標記物oct4、ssea-4、tra-60、tra-80、堿性磷酸酶(ap)的表達。

圖38描述了一種裝置，通過光刻印刷技術在此裝置的收縮部分兩端整合入電極進行修飾，并且通過au沉積向通道內(nèi)引入局部電場，從而將細胞變形與電穿孔相結(jié)合。

圖39描述了微流體系統(tǒng)其他的實施方案，其中進入部分的收縮角度為90度。

圖40a和40b顯示了圖2a所描述的示例性實施方案中的裝置和圖39中所描述的示例性實施方案中的裝置的存活率和傳遞功效的比較。

圖41顯示了通過cd45的alexa488抗體測量的活化的t細胞的cd45表達。在cd45靜止rna存在的情況下使用裝置處理細胞，會顯示較低的熒光強度峰值，因此顯示極低的cd45基因表達。

圖42顯示了一些示例性的應用領域，例如再生性藥物、免疫；成像和傳感；和癌癥疫苗和癌癥研究。

圖43a和圖43b是一種參照群落和一種細胞群落的流式細胞儀的強度直方圖，所述參照群落接觸與級聯(lián)藍共軛的3kda的右旋糖苷，所述細胞群落受到30μιη-6μιη裝置的處理然后與3kda的右旋糖苷接觸。

圖44是棒狀圖顯示了在使用微流體系統(tǒng)和相關方法處理之后，人胚胎干細胞中gfp的降低。

具體實施方式

本發(fā)明的實施方案提供了對細胞實施預先確定時間的受控制的變形，在細胞膜上造成擾動，從而將材料傳遞到細胞中的技術。所述變形可以通過如下方式產(chǎn)生，例如，機械壓力或者剪切力造成的壓力。在一個實施例中，微流體系統(tǒng)包括一種結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠通過小規(guī)模(例如，體積在毫升以下，例如微升、納升或者皮升)的幾何限制流體來控制和/或操作流體。所述微流體系統(tǒng)能夠?qū)⑷我庥行лd荷傳遞入細胞中。該系統(tǒng)由一個或者更多個供細胞通過的微流體通道組成，所述通道包括一種收縮部分。優(yōu)選的，所述細胞通過懸浮在液態(tài)介質(zhì)中的微流體通道，被壓力驅(qū)使穿過系統(tǒng)。當細胞通過收縮部分時，細胞膜被擾動，造成細胞膜短時間的破壞并使周圍介質(zhì)中所含有的有效載荷被吸收。收縮部分是靶細胞尺寸的函數(shù)，但是優(yōu)選的與細胞直徑相同或者比細胞直徑小?？梢云叫蟹胖煤?或串聯(lián)放置多個收縮部分。擾動細胞指的是細胞的破壞，這種破壞允許細胞外的材料進入細胞(例如，洞、撕裂、空腔、細縫、孔、破裂、縫隙、穿孔)。通過這里所描述的方法產(chǎn)生的擾動(例如孔或者洞)不是由蛋白亞基組裝形成多聚體孔結(jié)構(gòu)(例如由補體或者細菌溶血素)而產(chǎn)生的。其他的實施方案也在本發(fā)明所描述的主題內(nèi)容范圍內(nèi)。

關于圖1-3，微流體系統(tǒng)5包括定義了管狀腔體的通道10。所述微流體管道10包括收縮部分15，該收縮部分被設置成每次只有單個靶細胞20可以通過。優(yōu)選的，細胞20懸浮在溶液緩沖液25中通過通道10，所述緩沖液25中還含有傳遞材料30，但是傳遞材料也可以在細胞20通過收縮部分15之后被加入到溶液緩沖液25中。當細胞20達到并通過收縮部分15時，收縮部分15對細胞20施加壓力(例如，機械壓力)，壓縮細胞20(例如，示作細胞201)。收縮部分15向細胞施加的壓力造成細胞膜(即，細胞202)擾動(例如，圖4顯示的洞)。一旦細胞通過收縮部分15，細胞20開始通過孔吸收溶液緩沖液25種的材料，包括傳遞材料30(即，細胞203)。細胞膜經(jīng)過一段時間后恢復，優(yōu)選的，至少一部分傳遞材料30被捕獲在細胞內(nèi)部。

收縮部分15的構(gòu)造可以定制從而控制細胞20的收縮，因此，控制向細胞20施加的力。

優(yōu)選的，收縮部分15包括入口部分35、中心點40和出口部分45。例如，收縮部分15的直徑可以是變化的，從而調(diào)節(jié)對細胞施加的力(和所述力被施加/釋放的速度)，并且，收縮部分15的長度也是變化的從而調(diào)節(jié)對細胞施加力的時間。在某些結(jié)構(gòu)中，不需要細胞的物理收縮，只是簡單的將細胞與非常高的剪切速率和/或壓縮速率相接觸，就可以產(chǎn)生理想的擾動。通常這與微流體系統(tǒng)的外部直徑無關，并且內(nèi)直徑和外直徑的比率可以是變化的(例如，大于5)。

中心點40的直徑可以是細胞20直徑的函數(shù)。優(yōu)選的，中心點40與細胞20直徑相同或者小于細胞20直徑(例如，是細胞直徑的20-99％)。優(yōu)選的，中心點40的直徑是細胞直徑的60％-70％，但是，最佳的中心點直徑可以根據(jù)應用和/或細胞類型變化。在之前的實驗中，中心點40示例性的直徑是5-6微米和7-8微米。中心點40的直徑可以大于細胞20的直徑，但是被設置成能夠?qū)毎?0產(chǎn)生壓力脈沖(例如，剪切力).這種壓力可以對細胞20實施并不使其接觸通道10的壁?？梢允褂靡阎姆椒y量剪切力(例如，journalofappliedphysics27,1097(1956)；murpheyetal.)。

入口部分35的收縮角度(例如，圖2a所示)可以是變化的(例如，直徑減少的速度)。優(yōu)選的，所述收縮角度能夠最小化細胞通過時系統(tǒng)5的阻塞。出口部分45的角度也可以是變化的。例如，出口部分45的角度被設計以減少非層流的湍流/渦流的可能性(例如，角度為1-80度)。入口部分35的壁和/或出口部分45的壁優(yōu)選是直的，但是也可以是其他形狀(例如所述墻壁是曲面的)。

通道10、入口部分35、中心點40和出口部分45的橫截面是可以變化的。例如，各種橫截面可以是圓形的、橢圓形的、狹長的裂縫、正方形、六角形、三角形等等。中心點40的長度也可以變化，并可以調(diào)節(jié)來改變當細胞20通過收縮部分15時所受到的壓力。在給定的流速下，較長的收縮部分15(例如，更長的中心點40)會對細胞20施加更長時間的壓力。通道10、入口部分35、中心點40和出口部分45的寬度是可以變化的。例如，可以調(diào)節(jié)寬度來提供更緊的收縮并因此以與收縮寬度方面的變化相同的方式提高傳遞。裝置設計時改變寬度和長度，并可以在制備裝置時決定設備的寬度和長度，例如，通過光刻法中使用的鉻掩模。在整個通道內(nèi)寬度可以是均勻的，并且可以在制備時通過深反應性離子蝕刻步驟確定通道的寬度。所述寬度可以是，例如，15微米-20微米。如這里所使用的，裝置尺寸由一系列表示長度、寬度的數(shù)字和收縮的數(shù)字(例如，30μm-60μm5表示裝置的長度為30微米，寬度為5微米和5個收縮部分)組成。

細胞20穿過通道10的速率也是可以變化的，從而控制傳遞材料30向細胞20的傳遞。例如，調(diào)節(jié)細胞20穿過通道10的速度可以改變對細胞施加壓力的時間，并且可以改變對細胞施加壓力的速度(例如，緩慢施加或者快速施加)。細胞20以至少0.1mm/s的速度穿過系統(tǒng)5，例如，以0.1mm/s-5m/s，優(yōu)選以10mm/s到500mm/s的速度通過系統(tǒng)，當然，也可以其他速度通過。在一些實施方案中，細胞20以大于5m/s的速度通過。

可以用不同的材料制備通道10，例如，硅、玻璃、陶瓷、晶體物質(zhì)、非晶體物質(zhì)和聚合物(例如，聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、pdms、環(huán)烯烴共聚物(coc)等等)。優(yōu)選的，制備過程是以干凈的空間為基礎的，并且可以使用，例如，干蝕刻、濕蝕刻、光刻印刷術、注塑成型、激光燒蝕、su-8掩膜等等方法。一個示例性的通道10的長度大約是40-50微米，沒有收縮的部分直徑大約為50微米，收縮部分直徑大約為4-8微米。優(yōu)選的，通道10的長度足夠短以避免堵塞。也可以使用其他尺寸。

圖39描述了本發(fā)明微流體的另一種實施方式。在次實施方案中，通道10包括預備入口部分50，該部分不收縮細胞20。延長的通道部分55為入口部分55提供了90度的收縮角度(即圖2a中的α)。

圖40a和40b是兩張圖，顯示了兩種示例性實施方案存活率和傳遞效率方面的比較。標記4000指的是使用圖2a所示的實施方案時的測量值，而4010指的是當使用圖39所示的實施方案時的測量值。在相同的速度和操作壓力下，圖39所示的實施方案已經(jīng)顯示具有較高的傳遞效率和存活率。盡管具有與圖2a條件相似的剪切速率、細胞速度和處于壓力下的時間。

一些參數(shù)會影響傳遞材料30傳遞到細胞20。例如，收縮部分15的尺寸、操作的流體速度(例如細胞通過收縮部分15的時間)、傳遞材料30在溶液緩沖液25中的濃度、和細胞20在收縮后進入溶液緩沖液25中恢復/培養(yǎng)的時間長度會影響傳遞材料30向細胞20中的傳遞。其他能夠影響傳遞材料30向細胞20中的傳遞的參數(shù)包括細胞20在收縮部分15中的速度、收縮部分20的剪切率、垂直于流體速度的速度分量、細胞壓縮速率和收縮時間。這些參數(shù)可以被設計從而控制傳遞材料30的傳遞。溶液緩沖液25的組合物(例如，鹽濃度、血清濃度等等)也可以影響傳遞材料30的傳遞。當細胞20穿過收縮部分15時，由收縮部分15產(chǎn)生的變形/壓力使細胞短時間內(nèi)損傷造成材料穿過所述擾動部分形成被動擴撒。在一些實施方案中，細胞20只在很小的一段時間內(nèi)發(fā)生形變，在100微秒級別，從而最小化激發(fā)細胞信號傳導機制細胞凋亡途徑的機會，當然其他時間也是可以的(例如，范圍在納秒至幾小時)。最初的觀察說明在細胞20通過收縮部分15之后幾分鐘的時間內(nèi)傳遞材料30被細胞20所吸收。

通過多種方法可以驅(qū)動細胞20穿過通道10。例如，在入口側(cè)用泵施壓(氣體鋼瓶或者壓縮器)、在出口部分用真空泵抽真空、通過小管的毛細作用、和/或者系統(tǒng)5可以通過重力。還可以使用基于流體系統(tǒng)的位移(例如，注射泵、蠕動泵、手動移液器或者移液管、活塞等等)。通過單一通道10的示例性流體速率在1微升每秒的級別。另外，溶液緩沖液25可以包括一個或者一個以上的潤滑劑(水或者其他表面活性劑)，從而減少或者消除通道10的堵塞并改善存活率。

對系統(tǒng)5進行控制以保證傳遞材料30傳遞進入細胞群落的傳遞量是持續(xù)的。例如，系統(tǒng)5可以使用收縮后的對流傳遞機制，該機制能夠使傳遞材料30撞擊細胞20的滲透性細胞膜。通過控制二級流的流動速率，可以優(yōu)選的控制向細胞中傳遞的傳遞材料30的量。另外，在細胞膜恢復期間控制傳遞材料30在溶液緩沖液25中的濃度也可以改善傳遞材料30向細胞群落中的傳遞。優(yōu)選的，系統(tǒng)5完全在機械系統(tǒng)中操作，不使用電場和/或化學試劑，當然，也可是使用其他結(jié)構(gòu)(例如，電傳感器和/或光學傳感器被用于測量細胞性質(zhì)，例如，熒光性)。

另外，優(yōu)選的，系統(tǒng)5的傳遞不依賴于被傳遞的材料類型。例如，使用相同的系統(tǒng)可以傳遞蛋白質(zhì)、rna和dna而不需要進行任何修飾。

在具有某些細胞20的結(jié)構(gòu)中，細胞20在一種或者一種以上溶液中培養(yǎng)，目的是使傳遞材料被細胞所吸收。例如，在傳遞之前，細胞20可以在去聚合作用的溶液(例如，lantrunculina0.1微克/毫升)中被培養(yǎng)1小時從而使肌動蛋白細胞骨架去聚合。作為一種額外的實施例，在傳遞前，細胞可以在10微摩的秋水仙堿(sigma公司)中培養(yǎng)2小時，從而使微管網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)去聚合化。傳遞dna時，這種方法會幫助獲得基因表達。

關于圖5，顯示了系統(tǒng)5的平行結(jié)構(gòu)的照片。系統(tǒng)5可以包括任意數(shù)量的平行通道。優(yōu)選的，由于在系統(tǒng)5中加入了其他的平行通道，系統(tǒng)5的整體產(chǎn)量增加。圖6顯示了系統(tǒng)5的平行結(jié)構(gòu)的照片，該系統(tǒng)在每個通道10的入口處包括過濾器。另外，圖6還顯示了收縮部分15的結(jié)構(gòu)，所述收縮部分15包括具有多個臺階的入口部分35。關于圖7，圖7顯示了另一種系統(tǒng)5的原型照片。如圖7的顯示，包括培養(yǎng)孔的原型尺寸大約為1英寸x1/4英寸x1/4英寸。系統(tǒng)5其他的結(jié)構(gòu)還可以包括分選器、預處理/后處理模塊，和/或傳感器模塊(例如，光學傳感器、電學傳感器和磁傳感器)。

如下面根據(jù)實施例中所更為詳細的介紹，微流體系統(tǒng)和相關的方法具有廣泛的應用。圖42是一種示意圖，描述了一些應用領域的實施例。例如，本發(fā)明的主題內(nèi)容可以用于再生醫(yī)學，從而使細胞能夠重組和干細胞分化。本發(fā)明的主題內(nèi)容可以用于免疫領域，例如通過向樹突狀細胞、單核細胞、t細胞、b細胞和其他淋巴細胞傳遞來實現(xiàn)抗原呈遞和免疫活性的強化/抑制。進一步的，改善量子點、碳納米管和抗體向靶細胞中的傳遞對成像和傳感是有益的。另外，本發(fā)明的主題內(nèi)容可以在癌癥疫苗和研究中應用，例如，用于循環(huán)腫瘤細胞(ctc)fenix和淋巴治療。本方法還提供了一種魯棒的平臺，用于篩選能夠治療疾病或者控制細胞行為的活性sirna和小分子化合物。

這一概念已經(jīng)被其原型成功的解釋了，在其原型中，引入細胞20來吸收溶液緩沖液25中存在的細胞膜可滲透性染料(例如，分子量在3kda到2mda之間的熒光染料)、dna、蛋白質(zhì)、rna、納米管或者納米顆粒。在處理后，細胞20能夠恢復并增值，同時保留被傳遞的材料72小時。在此系統(tǒng)中試驗了11種不同的細胞類型，包括圖33中所列出的，因此說明了本系統(tǒng)對于不同的細胞型都可以表現(xiàn)出強有力的效果。圖33是一種表，包括了本發(fā)明主題內(nèi)容可以成功應用的細胞類型。使用單通道10測量的平均細胞通量大約為5000-20000細胞/秒，測量的平均傳遞效率為96％，并且測量的細胞存活率為95％。所有的實驗都在室溫條件下進行。但是，在某些技術中，溫度可以是變化的。例如，所述方法可以在室溫條件下(例如，20℃)進行，生理條件下(例如，39℃)進行，高于生理溫度、或者降低的溫度下(例如，4℃)進行，或者在這些例舉的溫度之間進行。在降低的溫度下(即通過冷凍、冰浴或者其他已知的技術是溫度基本上接近4℃)進行本發(fā)明的方法能夠出乎意料的改善傳遞效率和細胞存活率。因此，可以調(diào)節(jié)溫度來影響組合物的傳遞和細胞存活率。

如圖8a-b所示，提高細胞穿過收縮部分15的速度能夠增加傳遞材料30的傳遞百分比和傳遞效率。據(jù)發(fā)現(xiàn)，傳遞效率隨著細胞速度線性變化，并且存在一種依賴于劑量的反應。

在圖9中，在通過收縮部分15之后將細胞置于溶液緩沖液25中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間會全面影響傳遞材料30向細胞20中傳遞的百分比。但是，據(jù)顯示在培養(yǎng)一段時間之后(大約2-3分鐘)，傳遞百分比基本上不再改變。根據(jù)這個數(shù)據(jù)可以相信細胞20通過收縮部分15之后造成的細胞20上的擾動在細胞20通過收縮部分15之后大約5分鐘的時間內(nèi)被修正。另外，作為參考，對照組的相應時間是1分鐘。

如圖10所示，據(jù)觀察，細胞20多次通過收縮部分15會影響整體傳遞百分比，但是會對細胞20的整體存活率產(chǎn)生負影響。為了產(chǎn)生這個數(shù)據(jù)，使細胞通過收縮部分15、收集、然后在大約1分鐘內(nèi)再次通過裝置一次。

據(jù)觀察，在細胞20被擾動的時間里(例如，在通過收縮部分15之后)，通過擾動可以提取細胞內(nèi)的材料。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當細胞20被擾動時，材料可以進出細胞20,。這個性質(zhì)證明系統(tǒng)5可以被用作對細胞內(nèi)材料取樣的方法同時不會使細胞裂解。優(yōu)選的，細胞膜的擾動會使大分子從細胞質(zhì)中流出，因此可以用作細胞質(zhì)組合物的探針。

如圖11所示，在綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)靜止sirna(ambion公司，美國)存在的情況下處理穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)的hela細胞，然后使用facs(facscantoii，bd生物技術公司，美國)在48小時進行熒光分析.圖11的結(jié)果顯示與市售試劑(例如lipofectamine2000(invitrogen公司，美國))的結(jié)果相比，基因表達降低了40％以上。圖11還顯示了陰性sirna(scrambledsirna)參照物，如圖所示，這個降低并不是由變形過程本身產(chǎn)生的。

如圖13-14所示，擠壓尺寸會影響傳遞材料30的整體傳遞效率。例如，圖13-14顯示了當操作壓力變化時(例如，通過改變收縮部分15的長度和/或?qū)挾?，整體傳遞效率在某些程度上也發(fā)生改變(圖14顯示了不同條件下量子點(納米顆粒)的傳遞)。而且，如圖18a-18b所示，估計的細胞速度會影響傳遞材料30的整體存活率和整體傳遞效率。例如，圖18a顯示了隨著操作速度的變化，整體傳遞速率在某些程度上發(fā)生變化。另外，圖18b顯示了隨著操作速度的變化，細胞的存活率在某些程度上也發(fā)生變化。這些圖顯示收縮部分長度的變化會提高傳遞并最小程度的影響存活率。另外，與小分子相比，大分子在收縮之后以較低的速度進行細胞。這里所描述的細胞內(nèi)傳遞方法是“通用的”，適用于多種不同類型的材料和細胞。進一步的，該裝置產(chǎn)生的細胞膜破壞的一般尺寸至少為-100納米，但是，其他尺寸的破壞也是可能的。

如圖12所示，在一個實施方案中，可以通過控制溶液緩沖液25和細胞質(zhì)的濃度梯度來預計性的控制傳遞材料的量?？梢允褂镁植總鬟f方法，在局部傳遞方法中，在細胞20通過收縮制孔之后，將細胞20暴露于濃縮的大分子云。但是，這些局部傳遞方法應該考慮估計的擾動回復時間，從而確保適當?shù)墓δ?。在實施過程中可以向?qū)⒏邼舛扔行лd荷傳遞到細胞膜附近的通道里垂直加入“微管”(如圖6a所示)。優(yōu)選的，所述微管可以位于收縮部分15中和/或位于收縮部分15附近。這種方法通過對流提供擴散性的傳遞機制，因此能夠獲得更準確的細胞裝載和更高的濃度。優(yōu)選的，當細胞20處于收縮部分15的高濃度區(qū)域時發(fā)生所述注射。由于不需要在緩沖液中維持高濃度，這種局部化的技術能夠更為有效的保存?zhèn)鬟f材料的有效性。

關于圖16a，可以使用一系列微型圓柱100對細胞20施加壓力造成擾動。在此實施過程中，細胞20被迫使通過收縮的管陣列從而將壓力實施到細胞20上。

關于圖16b，使用壓縮板105對細胞20施加壓力從而造成擾動。在此實施過程中，控制壓縮板105以向細胞20施加預先確定時間的壓力。設置壓縮板105從而使一個或者兩個板能夠運動，對細胞20施加壓力。還可以提供額外組的壓縮板105以基本上包圍細胞20.

關于圖16c，緩沖添加劑115(或者與細胞表面相連的大塊材料)可以被用于刺激擠壓細胞20穿過收縮部分15，收縮部分15的直徑大于細胞20的直徑。例如，可以通過緩沖添加劑的干擾作用刺激收縮。緩沖添加劑115的實施例包括微米顆?；蛘呒{米顆粒(例如，聚合物基的、脂質(zhì)基的、陶瓷基的、金屬基的)。用細胞結(jié)合配位體(例如抗體、dna序列、肽、或者小分子)標記這些顆粒，當然，這并不是必須的。

關于圖16d，使用磁珠120來壓縮細胞20。例如，可以使用磁力和/或靜電力向細胞20施加力，或者在圖16e的情況下，來推動細胞20。優(yōu)選的，對細胞20施加的力足夠造成擾動。

關于圖16f，以能夠?qū)毎?0造成壓力(或者快速短時間剪切力)的方式控制多個液體流125。例如，射出多個液體流從而使其相互接近或者相互撞擊。由于細胞20穿過多個液體流125，可以對細胞施加力從而造成細胞20的細胞膜上的擾動。作為選擇，細胞可以從狹窄的裂縫狀的管中射出來加速傳遞。

系統(tǒng)5可以是一種獨立的系統(tǒng)，例如圖7的顯示，當然，也可以是其他結(jié)構(gòu)。例如，系統(tǒng)5可以被植入病人體內(nèi)進行局部細胞內(nèi)傳遞，和/或在一種機器中被體外整合，用于在將細胞放回病人體內(nèi)之前對細胞進行處理。

為了實現(xiàn)這里描述的傳遞優(yōu)勢，所述系統(tǒng)的微流體性質(zhì)使本領域技術人員能夠通過練習精確控制不同的傳遞條件、預處理過程和隨后的細胞定性。例如，所述系統(tǒng)可以被熒光活化的細胞分選器(facs)串聯(lián)應用。這可以實現(xiàn)在一個相同的系統(tǒng)中對細胞進行實時傳遞和分選。還可以使用多種預處理和分選后試驗技術，從而開發(fā)持續(xù)的、高通量試驗用于藥物篩選和診斷。

通過將靶細胞參照群落與有效載荷以及被微流體系統(tǒng)處理的群落相接觸，從而確定有效載荷向靶細胞的傳遞效率。在相同的傳遞溶液中，在相同的濃度下處理參照樣品以及被裝置處理的細胞，并使其維持至少相同的時間。為了補償表面結(jié)合、內(nèi)吞作用以及其他作用例如自體熒光性，定義傳遞區(qū)域從而最多1-5％的活參照細胞落入此區(qū)域。因此，樣品的傳遞效率對應于位于此傳遞區(qū)域內(nèi)活細胞的百分比。例如，圖43a是一種參照群落的流式細胞儀的強度直方圖，所述參照群落接觸與級聯(lián)藍共軛的3kda的右旋糖苷，圖43b是細胞群落的流式細胞儀的強度直方圖，所述細胞群落受到30μιη-6μιη裝置的處理然后與3kda的右旋糖苷接觸。圖43a和43b中未涂陰影的區(qū)域是上述定義的傳遞區(qū)域。

在操作中，關于圖17，進一步的參考圖1-3，用于實施細胞內(nèi)傳遞系統(tǒng)5的工藝過程1000包括如圖所示的各個步驟。但是，工藝過程1000只是示例性的，不是限制性的?？梢酝ㄟ^例如添加、刪除、改變或者重排各個步驟的方法改變工藝過程1000。

在步驟1005，將細胞20單獨與傳遞材料懸浮在溶液緩沖液25中。通常，細胞濃度在10⁴到10⁹細胞/毫升的范圍內(nèi)。傳遞材料的濃度在10毫克/毫升至0.1微克/毫升的范圍內(nèi)。

在使用理想的設置進行傳遞之前或者傳遞完成后馬上將傳遞材料加入細胞緩沖液中，所述理想的設置使損傷/孔在1-5分鐘內(nèi)保持開放。溶液緩沖液由許多鹽類、糖類、生長因子、動物衍生物或者其他適合細胞增殖、維持細胞健康或者誘導細胞信號傳導途徑的成分所組成。其他的材料也可以加入溶液緩沖液25中。例如，可以向溶液緩沖液25中加入表面活性劑(即，共聚物)和/或大塊材料。

在步驟1010，包括細胞20和傳遞材料30的溶液緩沖液25通過系統(tǒng)5的通道10。所述溶液緩沖液25通過重力作用穿過通道10，或者可以被其他方法所輔助。例如，可以再通道10的入口側(cè)對溶液緩沖液25施加壓力(例如，使用氣瓶和/或壓縮器)，和/或在通道10的出口側(cè)使用真空泵施加真空。另外，還可以使用基于位移的流體系統(tǒng)。

隨著單個細胞通過收縮部分15，收縮部分15的固體結(jié)構(gòu)暫時性的對細胞20施加力，造成細胞20細胞膜的擾動，例如產(chǎn)生孔，從而將傳遞材料30傳遞到細胞20的內(nèi)部?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)收縮部分15的尺寸、細胞20穿過收縮部分15的速度、和/對通過調(diào)整收縮部分15的形狀來改變對細胞20實施壓力的量和時間。在一個結(jié)構(gòu)中，大約5,000-20,000個細胞/秒穿過收縮部分15，并且每個細胞被收縮大約100微秒。

系統(tǒng)5可以包括一個或者更多個通道10。例如，系統(tǒng)5包括50-100個通道10，這些通道10平行排列。使用平行排列的結(jié)構(gòu)可以減少一個或者更多個通道10中發(fā)生堵塞的情況，并且增加系統(tǒng)5的總通量。另外，系統(tǒng)5還包括一種或者一種以上的相互串聯(lián)的通道。

在步驟1015，當細胞20通過收縮部分15之后，通過將細胞靜置在溶液緩沖液25中培養(yǎng)/恢復細胞。在此過程中，細胞20會通過細胞膜上出現(xiàn)的擾動來吸收一些溶液緩沖液25中存在的傳遞材料30。這種吸收的一個機理是基于擴散的，由于大分子的吸收速率比小分子的吸收速率要慢。優(yōu)選的，細胞20在溶液緩沖液25中培養(yǎng)/恢復大約2-5分鐘，當然，也可以是其他時間。在此時間內(nèi)，細胞20在溶液緩沖液25中培養(yǎng)/恢復，細胞20內(nèi)的材料也可能從細胞內(nèi)釋放到溶液緩沖液25中。在培養(yǎng)/恢復期間，可以控制某些條件以確保傳遞材料30的傳遞量持續(xù)穿過細胞群落。例如，收縮后可以使用對流傳遞機制將傳遞材料撞擊進入正在培養(yǎng)中/恢復中的細胞。

選擇性的，在步驟1020中，細胞經(jīng)過培養(yǎng)/恢復之后，洗滌細胞從而除去溶液緩沖液。優(yōu)選的，在經(jīng)過一段時間使之前發(fā)生的擾亂恢復之后進行洗滌，當然，洗滌液可以在其他時間進行從而控制被細胞吸收的傳遞材料30的量。

實施例1-功能性工程納米顆粒的傳遞

工程納米顆粒具有很大的潛力能夠作為活細胞成像工具、治療劑分子傳遞試劑或者甚至作為通過使用外部手段(例如光場或者磁場)操控活細胞的方法(howarth,m.,etal.monovalent,reduced-sizequantumdotsforimagingreceptorsonlivingcells(用作活細胞成像受體的單價小尺寸量子點).naturemethods5,397-399(2008))。但是，許多這些潛在應用需要將納米材料傳遞到細胞的細胞質(zhì)中。大多數(shù)納米顆粒，例如qds，需要被聚合物鈍化使納米顆粒能夠溶解在水性媒介物中，這常常會妨礙納米顆粒被動擴散穿過細胞膜。

由于缺少專業(yè)儀器以及低通量，同時電穿孔使qd在細胞內(nèi)沉積，所以納米顆粒的微注射被認為是不可實現(xiàn)的。因此，目前大多數(shù)嘗試將量子點傳遞入細胞質(zhì)的方法都依賴于細胞對量子點的內(nèi)吞作用并且不被內(nèi)含體吞噬。在本發(fā)明主題之前，不可能以滿意的方式、成規(guī)模的方式將量子點傳遞到細胞質(zhì)中。本發(fā)明的系統(tǒng)為之前方法所存在的傳遞問題提供了解決方案。

所述微流體系統(tǒng)可以與新近報道的新一代生物相容性qds相結(jié)合((liu,w.,etal.compactbiocompatiblequantumdotsviaraft-mediatedsynthesisofimidazole-basedrandomcopolymerligand(通過raft-介導的咪唑基隨機共聚物配體壓縮生物相容性量子點).jacs132,472-483(2010))。在實施例1中使用的量子點涂布有聚咪唑配位體，該配位體由多重金屬螯合的咪唑基團和多重水溶解性鈍化的聚(乙烯基)乙二醇(peg)組成。

為了向細胞質(zhì)傳遞量子點，將細胞分裝在含有量子點的pbs緩沖液中。用移液管將細胞-量子點溶液移入微流體裝置，然后在持續(xù)的壓力下使溶液穿過通道，隨后進行5分鐘的培養(yǎng)時間。在培養(yǎng)時間結(jié)束后，離心分離過量的量子點。對于參照群落，將細胞-量子點溶液防止在微流體系統(tǒng)中，然后使細胞暴露于量子點溶液足夠長的時間從而允許細胞質(zhì)內(nèi)傳遞方法實施。

圖19是傳輸和共聚熒光圖像的疊加，隨后是使用本發(fā)明主題內(nèi)容完成的經(jīng)過傳遞量子點處理的細胞的z切面共聚熒光圖像。圖19顯示(上圖)剛剛處理(即，傳遞)完成之后和(下圖)在37℃和5％的二氧化碳中培養(yǎng)48小時后。擴散染色方式被限制在細胞質(zhì)中，并且納米顆粒顯示不會進入細胞核(細胞內(nèi)黑色區(qū)域)。標尺是10微米。圖19顯示了用量子點涂布的、特定的不含有聚咪唑基的配位體的照片，這種配位體除去通過聚乙二醇基團提供生物相容性之外沒有其他功能。共聚熒光照片顯示了在流過微流體裝置被分離的圓形hela細胞在細胞不同的z切面具有擴散性的細胞質(zhì)qd染色(圖19，上圖)。在37℃和5％的二氧化碳中培養(yǎng)細胞并吸附48小時之后所述擴散性染色依然存在(圖19，下圖)。在48小時，擴散性量子點熒光變暗淡，可能是由于細胞分解(圖19)。量子點(水力直徑-13納米)以-10,000細胞/秒的通量被傳遞到-40％活細胞群中。圖20a顯示了使用本發(fā)明主題內(nèi)容將涂布有pil的量子點傳遞到hela細胞的細胞質(zhì)中的傳遞效率。通過流式細胞劑測定的細胞存活率大于80％。圖20b顯示了使用本發(fā)明主題名稱將平qd535傳遞到hela細胞后的存活率，這是使用碘化丙啶染色并使用流式細胞儀測定的。使用流式細胞儀、對共聚圖片的擴散染色測定被處理的細胞的存活率，細胞吸附的能力與量子點向活細胞的細胞質(zhì)中的傳遞相一致。

為了確定這些熒光確實是由被傳遞到細胞質(zhì)中的量子點產(chǎn)生的而不是由被內(nèi)含體捕獲的量子點產(chǎn)生的，將納米顆粒設計為其發(fā)射曲線隨著其與細胞質(zhì)的還原環(huán)境之間的相互作用而變化。細胞質(zhì)中還原電勢為-260到-220mv，并且最初是通過維持三肽谷胱甘肽的高濃度(5-10mm)來產(chǎn)生的。

因此，通過測定qd-染料構(gòu)建物的熒光強度來確定被傳遞的納米顆粒的位置和化學可進入性，其中，當與細胞質(zhì)環(huán)境相接觸時，所述構(gòu)建物的發(fā)射曲線發(fā)生變化。qd-染料被構(gòu)建，從而包含發(fā)綠光的qd(透射率＝541納米)，該qd作為能量供體提供碳氧-x-若丹明(rox)染色(透射率＝610納米)，通過還原性二硫鍵共軛。

圖21顯示了在不同介質(zhì)中構(gòu)建物的設計、吸光度和穩(wěn)定性。2100是與染料共軛前和涂布qd前pil的示意圖(左圖)，以及所得的量子點-二硫鍵-碳氧-x-若丹明(rox)構(gòu)建物的示意圖(右圖)(圖片沒有成比例顯示)。2110是量子點-二硫鍵-碳氧-x-若丹明(rox)構(gòu)建物的吸收光譜。在實驗過程中，488納米和405納米下的激發(fā)會產(chǎn)生獨有的光吸收。2120是在37℃下和5％的二氧化碳條件下全培養(yǎng)基中qd向碳氧-x-若丹明(rox)傳遞的構(gòu)建物熒光能量的穩(wěn)定性，說明在胞外環(huán)境下二硫鍵沒有裂解。圖2130顯示了細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽造成的二硫鍵裂解，如qd熒光性的恢復所示。2140顯示了通過使用非硫醇基還原性三(2-羧乙基)膦處理后產(chǎn)生的量子點熒光性的恢復，進一步證實了二硫鍵的裂解。

整合入pil的硫醇基與硫醇化的碳氧-x-若丹明(rox)形成二硫鍵。當平均每量子點有13個碳氧-x-若丹明(rox)時，純化的構(gòu)建物的吸光廣譜具有量子點和碳氧-x-若丹明(rox)(2120)的吸光特征，有效的退火qd熒光性(2130)。在細胞質(zhì)中，該構(gòu)建物可以作為一種特定還原環(huán)境不可逆的傳感器。當在488納米(顯微鏡)或者405納米(流式細胞計)下用激光選擇性的刺激量子點同時維持二硫鍵的完整，所述構(gòu)建物經(jīng)歷熒光性共振能量傳遞(fret)，從而碳氧-x-若丹明(rox)發(fā)射紅色光。在溶液實驗中，細胞還原性谷胱甘肽裂解二硫鍵，釋放碳氧-x-若丹明(rox)染料并且恢復量子點的熒光性(2140)。非硫醇基還原性三(2-羧乙基)膦還可以恢復量子點的熒光性，這說明碳氧-x-若丹明(rox)從量子點表面的釋放不是由谷胱甘肽產(chǎn)生的pil位移造成的。由于pil上長聚乙二醇產(chǎn)生的空間位阻，一些二硫鍵被阻礙，并且由于染料和量子點表面之間會產(chǎn)生非常少量的非特異性相互作用，因此碳氧-x-若丹明(rox)熒光性可能不會完全消失。

通過流式細胞計和共焦顯微鏡測定的構(gòu)建物熒光曲線的變化證實量子點-二硫化物-碳氧-x-若丹明(rox)構(gòu)建物傳遞到細胞質(zhì)中。當暴露于還原性細胞質(zhì)環(huán)境中時，二硫鍵的裂解破壞量子點向染料的熒光性共振能量傳遞(fret)過程。因此，隨著獨有的量子點激發(fā)，量子點通道的熒光性隨著時間增加而碳氧-x-若丹明(rox)通道的熒光性隨著時間減少。在含有高濃度的量子點-二硫化物-碳氧-x-若丹明(rox)的溶液中用微流體裝置處理活hela細胞，培養(yǎng)5分鐘，然后在加入細胞培養(yǎng)基(即被處理的細胞)之前洗滌除去過量的量子點。不用微流體裝置處理參照細胞，而是與量子點-二硫化物-碳氧-x-若丹明(rox)一起培養(yǎng)參照細胞5分鐘，然后在加入細胞培養(yǎng)基之前進行洗滌。使用共焦顯微鏡和流式細胞計觀察被處理的細胞和參照細胞的碳氧-x-若丹明(rox)和量子點通道熒光性。

圖22a和圖22b顯示了活細胞共焦顯微照片和顯示細胞質(zhì)染色的熒光強度分析和量子點表面的化學可進入性。圖22a顯示了被處理的細胞(上圖)和參照細胞(下圖)的圖像。只有被處理的細胞顯示出擴散性綠熒光表象。標尺為10微米。圖22b顯示了綠通道和紅通道中強度作為時間函數(shù)的變化。由于在每個時間點n<20，通過校準0小時時間點來糾正總平均熒光性的波動。

在共焦顯微鏡下，擴散的熒光性穿過被處理細胞的細胞質(zhì)從強烈的紅色轉(zhuǎn)變?yōu)閺娏业木G色(如圖22a所示)。參照細胞圖像顯示細胞膜外有一些非特異性結(jié)合，如環(huán)裝熒光所示，并且綠色通道的信號沒有增加。該作用與細胞質(zhì)二硫鍵可預期的降解相一致，所述降解會減少熒光性共振能量傳遞(fret)作用。在圖22b中，所述線狀圖顯示了，在被傳遞的熒光物質(zhì)中，通過校準總熒光性修正細胞與細胞之間的差異后，被處理的細胞和參照細胞和自體熒光性細胞的每個細胞中平均量子點和碳氧-x-若丹明(rox)通道強度。對于被處理的細胞，圖像顯示了培養(yǎng)2-4小時內(nèi)的圖像，其中量子點的熒光性上升超過碳氧-x-若丹明(rox)的熒光性。有趣的是，9小時后被處理的細胞碳氧-x-若丹明(rox)信號穩(wěn)定維持于自體熒光水平之上。這與溶液實驗結(jié)果相一致，其中，一些熒光性共振能量傳遞(fret)在減少后殘留。所觀察到的對比著色和量子點信號的增加以及碳氧-x-若丹明(rox)信號的減少有力的證實了細胞質(zhì)傳遞和隨后的二硫鍵裂解。通過對碳氧-x-若丹明(rox)進行熒光性共振能量傳遞(fret)淬火參照細胞中的量子點熒光性，其表象無法與自身熒光相區(qū)分。在較早的時間點所述參照細胞顯示一些碳氧-x-若丹明(rox)熒光性超過其自身熒光性，然后穩(wěn)定的下降。這回在量子點-s-s-碳氧-x-若丹明(rox)和細胞表面產(chǎn)生非特異性的相互作用，隨后將所述構(gòu)建物再溶解于所述培養(yǎng)基中。

圖23顯示了流式細胞儀測定的平均細胞熒光強度和存活率。2300是每個細胞的qd平均熒光強度(左圖)和碳氧-x-若丹明(rox)的平均熒光強度(右圖)，說明只有在被處理的細胞中qd熒光強度增加。在24小時時間點，被處理細胞核參照細胞的碳氧-x-若丹明(rox)熒光強度處于自體熒光水平。2310是一種直方圖，在qd通道(左圖)和碳氧-x-若丹明(rox)通道(右圖)顯示了被處理的細胞和參照細胞在選定的時間點熒光強度的分布。據(jù)估計，細胞群的至少35％發(fā)生量子點傳遞?；疑珔^(qū)域用于指導眼睛在熒光強度直方圖峰上運動。2320顯示了使用碘化丙啶測量的參照細胞和被處理細胞的存活率。

如圖23所示的流式細胞儀測定方法證實量子點-二硫化物-碳氧-x-若丹明(rox)構(gòu)建物可以與細胞質(zhì)環(huán)境發(fā)生相互作用。記錄所有活細胞的流式細胞儀測量結(jié)果，包括被傳遞的細胞(-35％的被處理細胞群)和未被傳遞的細胞。2100顯示了被處理細胞和參照細胞的平均熒光強度。最開始，被處理細胞的qd熒光性上升，在大約9小時時出現(xiàn)峰值，然后逐步下降，這與參照細胞的qd熒光相反，參照細胞的qd熒光維持在自體熒光水平。這與被處理的細胞內(nèi)部qd和染料之間二硫鍵橋聯(lián)的細胞質(zhì)內(nèi)還原相一致，隨后通過細胞分裂稀釋熒光構(gòu)建物。被處理細胞和參照細胞的碳氧-x-若丹明(rox)熒光強度剛開始比較高，然后在最初的2小時內(nèi)開始下降。這種下降造成顆粒(該顆粒在培養(yǎng)過程中結(jié)合在細胞表面)再溶解于培養(yǎng)基中。由于被處理的細胞群中也存在未傳遞細胞，因此被處理細胞群的平均碳氧-x-若丹明(rox)熒光強度與參照細胞群的熒光強度相似。在被處理的細胞群中存在的被傳遞細胞和未被傳遞的細胞可以被2310中顯示的量子點和碳氧-x-若丹明(rox)強度的直方圖區(qū)分。隨著時間的增加，被處理細胞的熒光直方圖變成雙峰，但是參照細胞的直方圖還是單峰。被處理細胞群亞組的qd熒光強度隨著時間上升，這進一步說明被處理和被傳遞的細胞中fret過程的破壞。由于結(jié)合細胞膜構(gòu)建物被重新溶解在培養(yǎng)基中，碳氧-x-若丹明(rox)熒光全面下降，但是被處理細胞群亞組還維持碳氧-x-若丹明(rox)熒光性。這與共聚顯微照片中觀察到的qd-s-s-rox鍵的不完全還原相一致。在所有時間點，使用碘化丙啶染色進行測定，被處理的細胞群的存活率在參照細胞存活率的10％之間(2130)。相對于參照組，細胞存活率>90％，這與作為替換的方法，例如電穿孔和基于聚合物的方法相比更受歡迎，作為替換的方法在處理后的存活率低至40-60％。

圖24顯示了在使用本發(fā)明裝置處理10nm量子點溶液之后，細胞的細胞質(zhì)中未聚集的單個量子點的落射熒光圖(上圖)，以及自體熒光性的三個量子點(被標記為2400、2410和2420)的閃爍軌跡。由于長時間的采集(500ms)，qd閃爍軌跡是非二元的。標尺為10微米。

量子點傳遞平臺通過傳遞未聚集的量子點-二硫化物-碳氧-x-若丹明(rox)構(gòu)建物實現(xiàn)單個細胞成像，所觀察到的發(fā)射間歇性與單個量子點一致。在此實驗中，量子點-二硫化物-碳氧-x-若丹明(rox)構(gòu)建物被傳遞到細胞質(zhì)中，隨后進行10小時的培養(yǎng)并在落射熒光顯微鏡中成像。10小時的培養(yǎng)時間確保來自細胞質(zhì)內(nèi)部的量子點的熒光通過二硫鍵的還原被恢復；落射熒光顯微鏡用于確保足夠的光子被收集。當細胞在低量子點濃度下(圖24)被這里所描述的主題內(nèi)容處理時可以觀察到一些閃爍的量子點。2400、2410和2420顯示了閃爍量子點在細胞質(zhì)中的強度軌跡，由于長時間的采集(500ms)，量子點閃爍軌跡是非二元的。在采集時間內(nèi)(大約1分鐘)，轉(zhuǎn)化細胞的運動微乎其微。這些數(shù)據(jù)說明使用本發(fā)明主題內(nèi)容將量子點作為熒光標記傳遞后可以觀察到細胞質(zhì)內(nèi)的單個細胞的情況。

實施例1顯示了使用本發(fā)明主題內(nèi)容的實施方案將納米顆粒傳遞到細胞質(zhì)中。通過觀察量子點-二硫化物-碳氧-x-若丹明(rox)被細胞內(nèi)還原劑裂解，顯示納米顆粒表面與細胞質(zhì)成分相互作用。

本發(fā)明主題內(nèi)容的實施方案確保量子點高通量傳遞到細胞質(zhì)中同時不產(chǎn)生細胞穿透或者內(nèi)體逃逸的配位體，并維持細胞存活率和量子點完整性。傳遞效率為35％，這一效率可以進一步通過增加微流體收縮部分的數(shù)量、改變收縮部分尺寸、或者增加處理循環(huán)數(shù)而增加。與大多數(shù)現(xiàn)有的細胞穿透肽或者正電荷輔助傳遞方法不同，本發(fā)明主題內(nèi)容不需要將細胞內(nèi)傳遞處理方法和細胞質(zhì)蛋白靶向處理方法相結(jié)合對相同的納米顆粒實施。

通過分配前述需要，可以實現(xiàn)交叉反應性關系的緩解、結(jié)合方案不平等的反應效率和共軛化學計量學。因此，量子點構(gòu)建物的設計具有重要的靈活性，為細胞內(nèi)蛋白標記和跟蹤鋪平道路。該方法可以有效用于傳遞許多復雜設計的熒光納米材料，所述熒光納米材料通過已被證實的蛋白質(zhì)靶向方案(例如，但是不局限于鏈霉親和素-生物素、鹵代標記-氯代烷和分選酶標記)靶向細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器。

在實施例1中，所有化學品都來自于sigmaaldrich公司并且除非另有說明，已收到時的形式被使用。在干燥的氮氣條件下，在氧水平少于0.2ppm時用omni-labvac手套箱處理空氣敏感材料。所有的溶劑都是光譜性的或者是試劑。使用手持紫外線燈和kmn04在tcl中成像含有芳香族環(huán)的化合物。使用茚三酮染色在tcl中成像含有氨基的化合物。在teledyneiscocombiflashcompanion進行快速柱狀色譜。從atcc購買hela細胞，然后除非另有明確說明，從mediatech購買所有細胞培養(yǎng)基材料。

在實施例1中，¹hnmr譜圖被記錄在brukerdrx401nmr譜儀上。在brukerdaltonicsapexiv4.7ft-icr-ms上進行ms-esi。使用hp8453二極管陣列分光光度計記錄紫外-可見光吸收光譜。使用bioteksynergy4微板閱讀器記錄光致發(fā)光光譜和吸收光譜。使用agilent1100系列hplc/gpc系統(tǒng)在dmf溶液中確定聚合物分子量，使用三個串聯(lián)的pl膠柱(103、104、105a)和窄聚乙烯標準品。在varianprostarprephplc系統(tǒng)中純化染料衍生物。用gehealthcare公司的裝載有sephadextmg-25m的pd-10柱純化修飾的聚合物。離心純化配位體交換的量子點然后用milliporeamiconultra30k切斷離心過濾膜透析，然后在裝配有自組裝superdex20010/100玻璃柱的aktaprimeplus色譜系統(tǒng)(amershambiosciences公司)上進行gfc。在lsrfortessa(bdbiosciences公司)上進行流式細胞儀測定。

在實施例1中，cdse核具有478納米的第一吸收峰，使用之前報道的方法(1)合成這種cdse核?？偟膩碚f，將0.4微摩(54.1毫克)的cdo、0.8毫摩(0.2232克)tdpa、9.6毫摩(3,72)topo放置在25毫升圓底燒瓶中。在160℃下對溶液脫氣1小時，然后在氬氣下加熱到300℃直到cdo溶解，并且形成干凈的均相溶液。隨后，在160℃下將上述溶液放置到真空中，除去演化產(chǎn)生的水。在氬氣條件下將溶液重新加熱到360℃然后快速加入top-se溶液(在1.5毫升的top中含有1.5毫升的1.5mtop-se)直到產(chǎn)生第一吸收峰為478納米的cdse核。

通過之前報道的方法(2)的修飾方法將cds殼沉積在cdse核上。通過反復用丙酮從己烷中沉淀來分離核，然后在油胺(3毫升)和十八碳烯(6毫升)混合物溶劑中升溫至180℃。然后以4毫升/小時的速度持續(xù)的引入cd和s前體溶液。cd前體由在十八碳烯(1.5毫升)和top(3毫升)的溶劑混合物中0.33毫摩油酸cd和0.66毫摩油胺組成。s前體由在6毫升top中的0.3毫摩爾的六甲基二矽硫醚[(tms)2s]組成?？偣布尤?個單層，每個cd和s產(chǎn)生一種量子點，所述量子點在541納米有發(fā)射，并且當在辛烷中稀釋的時候量子點產(chǎn)量為60％。使用文獻(3)中記載的cdse核的消光系數(shù)計算cdse(cds)的消光系數(shù)并假定在涂布步驟有95％的cdse核被保留。

在實施例1中，使用光刻印刷術和深度反應性離子蝕刻技術制備硅芯片。清潔(用h2o2和h2so4)所得蝕刻的硅晶片除去殘渣，氧化產(chǎn)生玻璃表面并在切成單獨包裝的裝置之前結(jié)合高硼硅晶片。然后在使用前分別檢查每個裝置的缺陷。

實施例2–大分子的傳遞

大分子的細胞內(nèi)傳遞是治療應用和研究應用的關鍵步驟。納米顆粒調(diào)節(jié)的dna和rna傳遞可以有效用于例如基因治療，而蛋白傳遞可用于在臨床和實驗室中影響細胞功能。其他材料，例如小分子、量子點或者金納米顆粒可以被傳遞到細胞液中，其用途可包括癌癥治療、細胞內(nèi)標記和單細胞追蹤。

為了說明該技術的多功能性，模型右旋糖酐分子被傳遞到一些細胞型中：dc2.4樹突狀細胞，新生人包皮成纖維細胞(nuff)和小鼠胚胎干細胞(mesc)，獲得的傳遞效率分別高達55％、65％和30％。最初的實現(xiàn)還顯示在初級淋巴細胞、巨噬細胞和來自小鼠的樹突狀細胞中實現(xiàn)了成功的傳遞。此外，本技術不會產(chǎn)生過度的細胞毒性或者也不會誘導干細胞分化作用。的確，甚至在最高的實驗速度下所有的細胞型具有超過60％的存活率。對于上述細胞型應預先設計最優(yōu)裝置和操作條件。

圖25顯示了實驗結(jié)果，證實傳遞情況取決于細胞速度和收縮部分涉及。收縮部分尺寸由數(shù)字表示(例如，10微米-6微米*5)，其中第一個數(shù)字表示收縮部分長度，第二個數(shù)字表示收縮部分寬度，第三個數(shù)字(如果存在的話)表示每個通路中串聯(lián)的收縮部分數(shù)目。在2500顯示了傳遞效率，在2510顯示了處理后18小時的細胞存活率(使用流式細胞儀測定)，該存活率被表示為細胞速度(40微米-6微米(o)、20微米-6微米(□)和10微米-6微米(δ)裝置設計)的函數(shù)。在用30微米-6微米裝置中，初始人成纖維細胞(□)、dc2.4樹突狀細胞(o)和小鼠胚胎干細胞(mesc)(δ)的2520傳遞效率和2530細胞存活率(通過流式細胞儀測定)被證明是速度的函數(shù)。在傳遞后18小時分析人成纖維細胞和樹突狀細胞。在傳遞完成后1小時分析小鼠胚胎干細胞(mesc)。所有的數(shù)據(jù)點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。

圖26顯示了在共焦顯微鏡下測定的，在傳遞由太平洋藍共軛的3kda右旋糖酐之后，helas細胞不同水平面的掃描2600。掃描從上向下進行，然后從左到右進行，其中，左上方ζ＝6.98微米，右下方的ζ＝-6.7微米。標尺為6微米。在2610顯示了10微米-6微米(□)、20微米-6微米(o)、30微米-6微米(δ)和40微米-6微米(0)裝置的活細胞傳遞效率。時間軸表示從在于目標傳遞溶液相接觸之前，開始對細胞進行處理時經(jīng)過的時間。所有的結(jié)果都是在處理后18小時通過流式細胞儀來測定的。在2620，使用未處理的細胞相對于參照細胞的自體熒光性校準被傳遞的細胞群體的平均強度。在連續(xù)的處理循環(huán)中，向細胞中傳遞熒光素共軛的70kda右旋糖酐(水平線)和太平洋藍共軛3kda右旋糖酐(對角線)(循環(huán)1和循環(huán)3)并從細胞中除去(循環(huán)2)。參照表示只與傳遞溶液相接觸但是沒有被本裝置處理的細胞。所有的數(shù)據(jù)點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。

之前描述的基于納米顆粒和細胞穿透肽(cpp)的傳遞技術揭示了細胞內(nèi)途徑，所顯示的證據(jù)排除了內(nèi)吞作用對本發(fā)明主題內(nèi)容傳遞機制的影響。在2600，圖26顯示了使用太平洋藍共軛的3kda右旋糖苷處理的細胞的共聚顯微照片，其擴散性的細胞質(zhì)染色與內(nèi)吞作用方法所預計的點狀特點相反。另外，當傳遞實驗在4℃下進行時，該溫度會使內(nèi)吞作用最小化，而對于所實驗的兩個有效載荷(3kda和70kda的右旋糖苷)來講，傳遞效率受溫度影響很小。這些數(shù)據(jù)顯示，內(nèi)吞作用不可能對本系統(tǒng)的傳遞承擔責任。

確定傳遞動力學隨時間變化的特征。在不存在傳遞材料的情況下使用本發(fā)明主題內(nèi)容傳遞材料，隨后在處理后預定的時間間隔將細胞暴露于太平洋藍標記的3kda右旋糖苷中。在此方法中，由于細胞通過收縮部分造成其細胞膜的破壞，但是在我們將其暴露于被標記的右旋糖苷之前，沒有發(fā)生可檢測到的傳遞。因此，在每個時間點的傳遞效率會影響處理后細胞維持多孔性時間長度的百分比。本發(fā)明捕獲孔形成/關閉動力學。所述結(jié)果顯示，無論裝置是如何設計的，幾乎90％的傳遞發(fā)生在處理后第1分鐘(2610)。所觀察到的時間尺度證實孔形成假設，隨著對細胞膜作用的修復，動力學報道了在造成損傷后大約30秒發(fā)生細胞膜修復。相反，內(nèi)吞作用推薦的時間尺度，例如納米顆粒和cpp介導的傳遞機制大約是以小時為單位的。

由于材料通過細胞膜上孔的傳遞時擴散性的，在整個孔存在的時間內(nèi)，材料可以被傳遞進入細胞或者傳遞出來。

另一方面，內(nèi)吞作用或者收縮機制必須是單向的，即，僅促使材料被傳遞進入細胞中。為了說明材料向細胞膜中的雙向傳遞，進行包括3個傳遞循環(huán)的實驗。在第一個循環(huán)中，在3kda右旋糖酐和70kda右旋糖苷存在的情況下處理細胞，在右旋糖苷溶液中培養(yǎng)5分鐘，然后用磷酸緩沖液洗滌2次。留下三分之一的樣品，隨后待用。在第二循環(huán)中，用裝置再次處理留下的洗滌細胞，但是這次不含有任何傳遞材料，并繼續(xù)培養(yǎng)5分鐘。將該樣品的一半留出待用。在第三循環(huán)中，用裝置處理第二循環(huán)留出的細胞，處理條件與第一循環(huán)的處理條件相同(即，在右旋糖苷存在的情況下)，培養(yǎng)5分鐘然后用磷酸緩沖液洗滌2次。在試驗完成后，用流式細胞儀對細胞進行18小時的分析。校準的熒光強度的變化說明右旋糖酐在第一循環(huán)網(wǎng)狀擴散入細胞，在第二循環(huán)從細胞中出來，在第三循環(huán)中再次進入細胞(2620)。這些結(jié)果與擴散傳遞機制相一致。

圖27顯示了一種簡單的，2d擴散模型，該模型是comsolmultiphysics軟件包開發(fā)的，顯示了材料通過被動擴散進入成孔的細胞膜中。comsolmultiphysics是comsol公司開發(fā)的一種有限元分析求解器和仿真軟件/fea軟件包，適用于多種物理和設計應用，尤其是耦合現(xiàn)象或者多物理場。在2700，材料的傳遞/損失被表示為細胞膜擴散性的函數(shù)。當成孔時，所感興趣的材料處于緩沖液中(□)或者處于細胞中(o)時，模擬結(jié)果說明材料向細胞中的傳遞/損失百分比是細胞膜擴散性的函數(shù)。在2710代表了模擬系統(tǒng)的圖像和當材料從緩沖液傳遞到細胞中去時，通過細胞膜的濃度梯度圖像

利用顆粒擴散進入細胞質(zhì)和從細胞質(zhì)中出來的文學價值，圖26的實驗數(shù)據(jù)/結(jié)果定性地再現(xiàn)作為物質(zhì)傳遞唯一方式的擴散作用。而且，通過將實驗數(shù)據(jù)與此模型相擬合，該技術將緩沖液中10-40％的傳遞材料傳遞到細胞質(zhì)中。通過比較，用于傳遞蛋白質(zhì)的cpp方法據(jù)估計只能向細胞中傳遞0.1％的緩沖液材料。

顆粒尺寸(或者流體力學半徑)影響其擴散性及其進入細胞膜上具有特定孔徑的孔的能力。因此，這一參數(shù)會影響孔形成/擴散機制中的傳遞效率。在一系列實驗中，實驗有效載荷是3kda、10kda、70kda、500kda和2mda的右旋糖苷與熒光素或者太平洋藍共軛，傳遞這些有效載荷，另外，據(jù)估計其分子量為3.1mda的熒光素標記的質(zhì)粒也被傳遞。根據(jù)其分子量相似性選擇模型分子作為所關心的傳遞材料。例如，3kda-10kda的右旋糖苷與一些短肽或者sirna具有相似的尺寸，而70kda-2mda范圍內(nèi)的模擬大多數(shù)蛋白質(zhì)和一些小納米顆粒的尺寸。

圖28顯示了材料雙重傳遞的結(jié)果。在2800顯示了，對于使用太平洋藍共軛的3kda右旋糖苷(□)處理的、使用熒光素共軛的70kda右旋糖苷(o)處理的和2mda右旋糖苷處理的hela細胞來講，活細胞傳遞效率是速度的函數(shù)。使用10微米-6微米×5芯片來進行本實驗。所有的數(shù)據(jù)點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。2810和2820顯示了未處理的(紅色)、以700mm/s的速度處理的(綠色)和以500mm/s的速度處理的(橙色)以及以300mm/s的速度處理的(亮藍色)、或者僅僅暴露于傳遞材料(參照，深藍色)的hela細胞的流式細胞儀數(shù)據(jù)重疊的直方圖。所述傳遞材料由太平洋藍共軛的3kda右旋糖苷(2810)和熒光素共軛的70kda右旋糖苷(2820)組成。

實驗顯示，大于70kda的分子與30kda右旋糖苷具有具有不同的傳遞曲線(2800)。所述裝置產(chǎn)生雙向傳遞，其中10微米-6微米×5的裝置在500mm/s下運行，例如，能夠確保90％的活細胞收到3kda的分子，而大約50％的細胞收到大于70kda和2mda的分子。

對應這些流式細胞儀數(shù)據(jù)的直方圖顯示3kda的右旋糖苷傳遞產(chǎn)生2個不同的峰(2810)。在第一亞群中，通過相對于參照物(對于參照物，考慮0mm/s數(shù)據(jù)點時之前描述的內(nèi)吞作用和表面結(jié)合性)產(chǎn)生的峰位移造成平均熒光強度增加2-6倍，顯示出細胞溫和的傳遞水平。在第二群眾，與參照相比，細胞的平均熒光強度增加20-100倍，顯示了增加的傳遞水平。該作用顯示后一亞群比前一亞群的成孔情況更嚴重，因此能夠使材料的流通增加大約10倍。事實上，由300mm/s、500mm/s和700mm/s的曲線所示，通過增加操作速率增加處理的嚴重性，貌似能夠增加具有提高的傳遞能力的細胞百分比。對于較大的70kda的右旋糖苷分子可以觀察到相似的特點(2820)。但是由于較低的顆粒擴散性和可能的尺寸排除作用會降低整體傳遞量，這一作用不是那么明顯。與3kda情況所觀察到的2-6倍增加相比，溫和傳遞的細胞群(第一峰)的平均熒光強度只增加1.5-2倍。這一作用應被認為是2800傳遞數(shù)據(jù)中的差異，這是由于在大分子情況下，根據(jù)這里的傳遞定義，溫和傳遞細胞群難以與參照群相區(qū)別。因此，對于較大的分子，例如70kda和2mda右旋糖苷，技術人員主要測定第二個傳遞明顯被提高的細胞群。

為了確定被快速機械變形作用傳遞到細胞質(zhì)中的材料是有活性的并且在細胞的細胞質(zhì)中具有生物可利用性，進行了一系列實驗向能夠表達去穩(wěn)定性的gfp中傳遞待檢測的有效載荷gfp靜止sirna(ambion，美國)。在處理后18小時觀察到劑量依賴型和序列特異性gfp抑制(高達80％)。作為細胞速度和裝置設計的反應，基因抑制與右旋糖苷傳遞實驗相一致，因此較高的速度和多個收縮部分設計會產(chǎn)生更大的基因抑制。在這些實驗中，使用lipofectamine2000作為陽性參照。在進行這些實驗之前，未對裝置設計和操作參數(shù)進行sirna傳遞最優(yōu)化。

圖29顯示了sirna、蛋白質(zhì)和納米顆粒傳遞的數(shù)據(jù)。在2900中，在5微摩的傳遞濃度下用10微米-6微米×5芯片傳遞抗-egfpsirna之后18小時，在表達趨穩(wěn)定的gfp的hela細胞中，基因抑制被解釋為裝置類型和細胞速度的函數(shù)。使用lipofectamine2000作為陽性參照。在2910中，顯示了熒光素標記的70kda右旋糖苷和太平洋藍標記的3kda右旋糖苷進行快速機械變形傳遞和電穿孔傳遞的傳遞效率。在傳遞溶液中每種右旋糖苷類型的濃度是0.1毫克/毫升。在2920中，使用30微米-6微米裝置，熒光素標記的胎牛血清白蛋白(o)的傳遞效率、太平洋藍共軛的3kda右旋糖苷傳遞效率(□)和細胞存活率(δ)被顯示為速度的函數(shù)。在2930中顯示了hela細胞的熒光顯微圖，所述hela細胞中傳遞了含有alexafluor488標記物的微管蛋白抗體。比例尺為5微米。2940和2950顯示了被10微米-6微米×5裝置處理并靜止1小時后細胞中金納米顆粒(一些由箭頭表示)的投射電子顯微鏡(tem)照片。比例尺為500納米。所有的數(shù)據(jù)點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。

在進一步的實施例中，為之前挑戰(zhàn)的應用開發(fā)細胞質(zhì)傳遞潛在方法，例如，蛋白傳遞和納米顆粒傳遞。為了比較本發(fā)明主題內(nèi)容與商業(yè)上可購得的方法的表現(xiàn)，使用3kda和70kda的右旋糖酐作為蛋白質(zhì)模型，使用本發(fā)明主題內(nèi)容和neon電穿孔系統(tǒng)(invitrogen)將這些模型傳遞到人類成纖維細胞中。結(jié)果顯示，快速機械變形為這些大分子提供7倍增加的或者更多的傳遞效率(2910)。為了使這些方法適用于蛋白傳遞，使用通道直徑為30微米-6微米的裝置向hela細胞傳遞熒光素標記的胎牛血清白蛋白(bsa)，傳遞效率高達44％而且活性超過90％(2920)。在使用30微米-6微米的裝置處理之后，以0.25毫克/毫升的抗體濃度將alexafluor488標記的微管蛋白抗體(biolegend公司)傳遞到hela細胞中(2930)。擴散染色顯示材料沒有被包裹在內(nèi)含體中，因此適用于在細胞質(zhì)中對細胞結(jié)構(gòu)進行活細胞抗體染色。使用該技術還成功傳遞了載脂蛋白e。

為了傳遞納米顆粒，變形后靜置1小時的細胞的tem圖像(2940和2950)顯示了涂布有peg1000的15納米的金納米顆粒的傳遞。金納米顆?；旧蠜]有凝集并且沒有被內(nèi)含體可視的捕獲。在這些圖像中可以觀察到一些細胞質(zhì)造成的傳遞缺陷。已經(jīng)證實能夠?qū)崿F(xiàn)高通量傳遞，量子點向細胞的細胞質(zhì)中無細胞毒性的傳遞是之前的技術中無法實現(xiàn)的目標。在這些實驗中，具有rox染色的量子點結(jié)合其表面并通過快速機械變形傳遞，在一定時間內(nèi)進行觀察。數(shù)據(jù)產(chǎn)生最小的傳遞效果估計為35％，并且經(jīng)證實，傳遞的量子點位于細胞質(zhì)中并且對于細胞內(nèi)環(huán)境是化學可接近的。

當細胞通過微流體系統(tǒng)時，快速使細胞機械變形形成暫時孔。據(jù)顯示，擴散細胞質(zhì)染色(圖26的2600)數(shù)據(jù)、sirna功能性數(shù)據(jù)(圖29的2900)和材料通過成孔細胞膜的雙向運動數(shù)據(jù)(圖26的2620)支持該機制。確定許多參數(shù)，例如收縮尺寸、串聯(lián)的收縮部分數(shù)目和影響傳遞效果及存活率的細胞速度(圖25)。因此，這些參數(shù)可以用于針對不同的應用，根據(jù)細胞類型和傳遞材料的尺寸優(yōu)化裝置設計。

在實施例2中，這些技術基于微流體系統(tǒng)，所述微流體系統(tǒng)可以被整合入一種大的綜合系統(tǒng)中，這種綜合系統(tǒng)由多個傳遞之前的預處理步驟和處理后的分析或者分類步驟組成。在平均通過速率為10,000細胞/秒時，所述傳遞裝置可以，例如，沿著流式細胞儀放置，從而對細胞進行分類或者在傳遞后立即進行其他分析。

與之前存在的方法相比，這里描述的裝置、系統(tǒng)和方法提供了很多潛在的優(yōu)點。與電穿孔方法和微注射方法相似，本發(fā)明是一種基于成孔的方法，因此不依賴于外來的材料、不依賴于有效載荷的化學改變或者細胞內(nèi)途徑。然而，與電穿孔相反，本發(fā)明不需要依賴于電場，電場在蛋白質(zhì)傳遞方面的作用非常有限并會損失一些有效載荷或者產(chǎn)生細胞毒性。事實上，目前的結(jié)果顯示在絕大多數(shù)應用中具有相對高的存活率，并且敏感的有效載荷，例如量子點，未受損傷。本發(fā)明的主題內(nèi)容在許多領域提供了非常重要的優(yōu)勢，例如，在標記和追蹤細胞內(nèi)材料時，被電穿孔作用損傷的量子點是一個重要問題，并且如果使用化學品的話，傳遞方法將被限制在有效的表面化學范圍內(nèi)。

實施例2還顯示了本發(fā)明的裝置能向細胞質(zhì)中傳遞蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)和模型估計表明與之前的方法(例如使用細胞穿透肽或者電穿孔方法)相比，本發(fā)明的主題內(nèi)容可以向每個細胞中多傳遞10-100倍的材料。這種改善的傳遞率能提供一種更好的方法用于基于蛋白質(zhì)的細胞重排，例如，在所述細胞重排中，轉(zhuǎn)錄因子向細胞液中的傳遞是研發(fā)可靠的ipsc生產(chǎn)方法主要障礙。通過傳遞各種關心的蛋白質(zhì)/肽，技術人員還可以使用本發(fā)明主題內(nèi)容研究疾病機制。事實上，本發(fā)明主題內(nèi)容可以被用于高通量篩選肽文庫，這是由于，與大多數(shù)cpp或者基于納米顆粒的技術所不同，本發(fā)明主題內(nèi)容對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學不敏感，不依賴胞吞作用途徑，并且不影響蛋白質(zhì)功能。

由于本發(fā)明主題內(nèi)容具有傳遞初級細胞的能力，因此通過快速機械變形完成的細胞質(zhì)傳遞可以用作一種活體外治療機制。在本方法中，在病人體外使用本發(fā)明裝置處理來自病人血液或者其他組織的靶細胞，然后再重新放置于人體內(nèi)。此方法具有增加的蛋白質(zhì)或者納米顆粒治療劑傳遞效率并且比現(xiàn)有的技術更安全，這是由于，本發(fā)明不需要潛在的毒性載體粒子并且能夠減緩任何與網(wǎng)狀內(nèi)皮組織清除率和去靶點傳遞有關的副作用。

在實施例2中，使用光刻印刷法和深活性離子蝕刻技術在微組裝設備中制備基于硅的裝置。在此過程中，用六甲基二硅氮烷(hmds)處理厚度為450微米的6"硅片，以3000rpm的速度旋轉(zhuǎn)涂敷光致抗蝕劑(ocg934，fujifilm公司)60秒，通過鉻掩模暴露于紫外燈(ev1-evg)中，并具有收縮部分管道設計，并在az405(az電子材料)溶液中延長100秒。在90℃下烘焙20分鐘，使用深活性離子蝕刻(spts技術公司)蝕刻晶片到預定的深度(例如，在本實施例中，15微米)。在完成蝕刻過程之后，使用piranha方法(過氧化氫和硫酸)除去殘余的光致抗蝕劑。為了蝕刻進入孔(即，入口和出口)，用不同的掩膜在晶片對邊(即，不包括蝕刻通道的一邊)重復進行上述過程，所述掩膜上包括進入孔圖案和較厚的光致抗蝕劑az9260(az電子材料公司)。

使用含氧血漿和rca凈化作用除去任何殘留的雜質(zhì)。在晶片與pyrex晶片亞電化學鍵合之前使用濕氧化作為產(chǎn)生100-200納米二氧化硅，然后切成單獨的裝置。在使用前分別檢查每個裝置的缺陷。

在進行實驗之前，將裝置固定在支持物上，該支持物含有入口存儲器和出口的存儲器(firstcut公司設計生產(chǎn))。使用丁-腈橡膠-o-環(huán)(mcmaster-carr公司)將這些存儲器與裝置相連，提供合適的密封。使用特氟隆槽將進口存儲器與壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)相連，從而提供必需的驅(qū)動力，推動材料通過裝置。實施例2可以調(diào)節(jié)壓力使之高達70psi。

在含有10％胎兒牛血清(fbs)(亞特蘭大生物科學公司)和1％青霉素鏈霉素(mediatech公司)的高葡萄糖dubelco修飾的基礎培養(yǎng)基(dmem，mediatech公司)中培養(yǎng)實施例2中包括hela(atcc)、表達綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)的hela、和dc2.4(atcc)細胞的細胞培養(yǎng)物。在含有15％fbs的高葡萄糖dmem中培養(yǎng)初級人成纖維細胞(nuff)(globalstem公司)。在培養(yǎng)器中，37℃下、5％的二氧化碳中保存細胞。當使用的時候，用0.05％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(mediatech公司)處理粘附細胞5-10分鐘，使粘附細胞懸浮。

在由85％敲除的dmem、15％胎牛血清、1mm的谷氨酰胺、0.1mm的β巰基乙醇和1％非必需氨基酸代替的1000單位/毫升白血病抑制因子(lif)(millipore公司，美國)組成的培養(yǎng)基中，小鼠胚胎干細胞(mesc)在小鼠胚胎成纖維細胞(chemicon)上生長。使用0.25％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸使細胞每2-3天傳代一次。當用裝置進行處理時，小鼠胚胎干細胞(mesc)能夠重新形成菌落并在處理2周之后仍然維持正常的形態(tài)。

為了進行實施例2中的實驗，首先要將細胞懸浮在理想的傳遞緩沖液(生長培養(yǎng)基、磷酸質(zhì)緩沖鹽水(pbs)中，或者補充有3％fbs和1％f-68普盧蘭尼克(sigma公司)的pbs中，然后與所需傳遞材料相混合，放入裝置入口存儲器中。該存儲器與壓縮空氣管道相連，壓縮空氣管道被一種調(diào)節(jié)器控制并且使用選擇的壓力(0-70psi)驅(qū)使流體通過裝置。然后從出口存儲器收集被處理的細胞。處理后在進行下一步處理之前，在室溫下、傳遞緩沖液中培養(yǎng)細胞5-20分鐘確?？组]合。

在實施例2中，在比較不同大小的右旋糖苷傳遞效果的實驗或者比較蛋白質(zhì)與右旋糖苷傳遞效果的實驗中，可以將所關心的分子共同傳遞，即，使用相同的實驗、使用相同的細胞群體，在相同的裝置上傳遞，根據(jù)其熒光標記相區(qū)分。所有的數(shù)據(jù)點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。

為了傳遞熒光標記的右旋糖苷分子(invitrogen公司)或者載脂蛋白e(invitrogen公司)，按照上面的描述進行實施例2的實驗，從而傳遞緩沖液中分別包括0.1-0.3毫克/毫升的右旋糖苷或者1毫克/毫升的載脂蛋白e。

為了傳遞熒光素共軛的bsa(invitrogen公司)，首先將細胞在含有5毫克/毫升未標記的bsa(sigma公司)的培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)2小時，然后用實施例2的裝置處理，其中所使用的傳遞緩沖液包括1毫克/毫升的熒光素共軛的bsa。所述預培養(yǎng)步驟用于最小化熒光標記的bsa和細胞表面的非特異性結(jié)合。

測定實施例2中的綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)抑制，測量結(jié)果為相對于未處理參照物，細胞群落平均熒光強度減少的百分比。通過將1微克sirna與1微升lipofectamine2000試劑在100微升的磷酸緩沖液中結(jié)合，制備lipofectamine2000+sirna粒子。在室溫下培養(yǎng)20分鐘后，向每個試驗孔中加入20微升的混合物，所述試驗孔中包括20000個細胞和100微升的培養(yǎng)基。在分析之前，與所述顆粒一起培養(yǎng)細胞18小時。

在實施例2中，通過將硫醇末端，1000分子量的聚乙二醇(peg)共軛到納米顆粒表面制備金顆粒，然后通過離心作用(10,000rcf進行30分鐘)洗滌4此去掉過度的peg，將所得材料懸浮在磷酸緩沖液中，最后濃度為100納摩。為了反映gnp向hela細胞中的傳遞，將細胞懸浮在含有3％fbs、1％f-68普盧蘭尼克和47nmgnp的磷酸緩沖液中；用10微米-6微米χ5的裝置處理并固定在含有2.5％(重量/體積)戊二醛、3％(重量/體積)多聚甲醛、和5.0％(重量/體積)蔗糖的二甲次胂酸鈉緩沖液(ph7.4).在固定一整夜之后，將細胞再次固定在包括1％(重量/體積)os04的巴比妥-醋酸緩沖液中1小時。然后用含有0.5％醋酸雙氧鈾的巴比妥-醋酸緩沖液(ph6.0)對全體細胞染色整夜，脫水并嵌入spurr樹脂中。使用鉆石刀在reichertultracute(leica)上切成厚度為70納米厚的薄片。用em410電子顯微鏡(phillips)檢查薄片。

在實施例2中，在neon電穿孔系統(tǒng)(invitrogen公司)中，使用熒光素標記的70kda右旋糖苷和太平洋藍標記的3kda右旋糖苷轉(zhuǎn)染新生人成纖維細胞(nuff)。按照使用說明，隨后洗滌細胞然后將其懸浮在適當?shù)木彌_液中。使用10微升tip處理細胞，濃度為10細胞/毫升，右旋糖苷濃度為0.1毫克/毫升。使用如下三個狀態(tài)：1)一個20毫秒的1700v的脈沖；2)三個10毫秒的1600v的脈沖；3)兩個20毫秒的1400v的脈沖。使用說明書推薦狀態(tài)1和狀態(tài)3作為egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人成纖維細胞的最優(yōu)條件，傳遞效率分別為84％和82％。

在實施例2的共焦圖像中，在800轉(zhuǎn)每分的條件下離心樣品4分鐘然后在成像前使用磷酸緩沖液洗滌2-3次。在裝備有ci共焦附加單位和60倍水浸沒透鏡的nikonte2000-u倒置顯微鏡中獲取活細胞的共焦圖像。使用405納米的激光激發(fā)熒光樣品然后用標準dapi過濾器(尼康)檢測。

在實施例2的熒光顯微術中，在800轉(zhuǎn)每分的條件下離心樣品4分鐘然后在成像前使用磷酸緩沖液洗滌2-3次。用裝備有neofluar透鏡(zeiss)的axiovert200(zeiss)倒置顯微鏡成像。通過x-cite120q汞燈(lumendynamics公司)激發(fā)熒光。所述顯微鏡裝備有hamamatsuc4742-95照相機(hamamatsu公司)并用imagej(nih)分析圖像。

在實施例2的流式細胞儀中，在傳遞試驗后，為了分析細胞，使用磷酸緩沖液洗滌細胞2-3次(在96孔板中，每孔>100微升)。然后重新懸浮在含有3％fbs、1％f-68普盧蘭尼克和10微克/毫升碘化丙啶的磷酸緩沖液(sigma公司)中。在裝配有高通量取樣機器人的lsrfortessa(bd生物科學公司)或者facscanto(bd生物科學公司)上分析細胞。用405納米和488納米激光激發(fā)所需的熒光團。使用695納米長的通道并分別使用530/30和450/50過濾器檢測碘化丙啶(活/死染色)、熒光素和太平洋藍染色信號。使用facsdiva(bd生物科學公司)和flowjo(flowjo)軟件分析數(shù)據(jù)。

實施例3–干細胞和免疫細胞

蛋白質(zhì)、納米顆粒、sirna、dna和碳納米管被成功的傳遞到11種不同的細胞類型，包括胚胎干細胞和免疫細胞。實際上，本發(fā)明的裝置和方法能夠?qū)⒔Y(jié)構(gòu)多樣性材料及其可用性傳遞到難以轉(zhuǎn)染的初級細胞中，這表明本發(fā)明的方法在研究和臨床上有廣泛的應用。

在實施例3中，每個裝置由45個相同的平行排列的微流體通道組成，該通道包括一個或者一個以上收縮部分，蝕刻在硅芯片上并用硼硅酸玻璃層密封。每個收縮部分的寬度和長度(下面會進行更詳細的描述)分別在4-8微米和10-40微米。實施例3的裝置通常以20,000個細胞/秒的通過速率操作，每個裝置能產(chǎn)生將近一百萬個被處理的細胞，然后由于堵塞，所述裝置發(fā)生故障。選擇平行通道的設計來增加處理量，同時確保對細胞進行均勻的處理，這是由于一個通道的堵塞或者缺陷不會影響相鄰通道的流動速度(所述裝置可以在恒定的壓力下操作)。在使用前，可以首先將該裝置連接到鋼接觸面，所述鋼接觸面與硅裝置的進口和出口存儲器相連接。然后將細胞和需要傳遞的材料的混合物放入進口存儲器并在進口處。然后用壓力調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)進口存儲器的壓力并驅(qū)使細胞通過所述裝置。然后從出口存儲器收集被處理的細胞。

已經(jīng)識別出能夠影響傳遞效率的參數(shù)(參見，例如上述實施例2)，這些參數(shù)包括細胞速度、收縮部分尺寸和收縮部分數(shù)目(從而改變細胞所受到的剪切力和壓縮率)。例如，具有膜不可滲透性太平洋藍標記的3kda的右旋糖苷分子向活hela細胞的傳遞效率隨著穿過不同收縮部分設計的細胞速度單調(diào)增加(例如，圖25的2500)。收縮部分尺寸還影響傳遞；在所有操作速度下，將收縮部分長度從20微米增加到40微米幾乎使傳遞效率增加兩倍(例如，圖25的2500)，并且對存活率由最小的影響(例如，圖25的2510)。減少收縮部分寬度會獲得類似的作用。增加串聯(lián)的收縮部分數(shù)目也可以增加傳遞效率，因此，在所有的細胞速度下，串聯(lián)有5個10微米長度收縮部分的裝置的工作性能比只有單個10微米、20微米或者40微米長度設計的裝置的工作性能要好(例如，圖25的2500和2510).在這些數(shù)據(jù)中，0mm/s數(shù)據(jù)點相當于參照情況，因此細胞與其他樣品經(jīng)歷相同的處理但是不通過裝置，因此反應了胞吞作用或者表面結(jié)合效應。

為了研究本發(fā)明技術的多用性，評價本發(fā)明技術向一些細胞型傳遞模型右旋糖苷分子的能力，所述細胞型傳統(tǒng)上是難以轉(zhuǎn)染的，尤其是免疫細胞和干細胞。由于熒光標記的70kda和3kda右旋糖苷分別與許多蛋白質(zhì)和sirna分子具有相似的尺寸，便于用流式細胞儀檢驗并且由于他們是帶負電的，可以最小化表面結(jié)合效應，因此，在這些實驗中使用熒光標記的70kda和3kda右旋糖苷。

圖30顯示了在不同的細胞型中使用本發(fā)明的主題內(nèi)容。3000顯示了傳遞效率，以及用30微米-6微米裝置向新生人成纖維細胞(nuff)傳遞3kda和70kda右旋糖苷后新生人成纖維細胞(nuff)的存活率。3010顯示了用10微米-4微米裝置處理脾中分離的鼠樹突狀細胞，向其中傳遞3kda和70kda的右旋糖苷。3020顯示了鼠胚胎干細胞的傳遞效率和存活率，所述細胞被10微米-6微米裝置處理從而傳遞3kda和70kda的右旋糖苷。3030顯示了3kda右旋糖苷向b細胞(cd19+)、t細胞(tcr-b+)和巨噬細胞(cdllb)中的傳遞效率，3040顯示了70kda右旋糖苷向b細胞(cd19+)、t細胞(tcr-b+)和巨噬細胞(cdllb)中的傳遞效率，所述細胞通過離心作用從全小鼠血液中分離，并被30微米-5微米和30微米-5微米x5裝置以1000mm/s的速率處理。分別用太平洋藍和熒光素分離3kda和70kda的右旋糖苷。所有的數(shù)據(jù)點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。

使用各種裝置設計將右旋糖苷傳遞到新生人包皮成纖維細胞(nuff)(3000)、初級鼠樹突狀細胞(3010)和胚胎干細胞(3020)中。這些實驗最小程度的損傷細胞存活率(<25％)(3000、3010和3020)并且，鼠胚胎干細胞的結(jié)果表明該方法不會誘導分化作用。在進一步的研究中，通過離心作用從血液中分離白血球(血塊黃層)并用本發(fā)明裝置處理。通過抗體染色區(qū)分b細胞、t細胞和巨噬細胞，結(jié)果顯示3kda和70kda右旋糖苷都被成功的傳遞了(3030和3040).

為了顯示本發(fā)明主題內(nèi)容在解決目前傳遞方法存在的挑戰(zhàn)的能力，在可能的應用上進行一系列實驗，所述應用包括細胞再生和碳微管基傳感。除了使用下面描述的特殊材料之外，本發(fā)明主題內(nèi)容顯示能夠成功傳遞許多被實驗的有效載荷，例如，載脂蛋白e、牛血清白蛋白和綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)-質(zhì)粒。

圖31顯示了納米顆粒和抗體傳遞數(shù)據(jù)。3100顯示了使用10微米-6微米χ5裝置傳遞太平洋藍標記的3kda右旋糖苷和cy5標記的包覆dna的碳納米管的傳遞效率和細胞存活率。3110顯示了用拉曼散射覆蓋的亮場細胞圖像，在g帶(紅色)中，顯示了碳納米管向被處理的細胞中的傳遞(左側(cè))和胞吞作用(右側(cè))。刻度尺為2微米。3120顯示了在傳遞了太平洋藍標記的3kda右旋糖苷(中間組)和alexafluor488標記的抗微觀蛋白抗體(右組)18小時之后，hela細胞的熒光顯微照片?？潭瘸邽?微米。3130顯示了用10微米-6微米χ5裝置，以500mm/s的速率處理傳遞alexafluor488標記的抗微管蛋白抗體后，hela細胞的傳遞效率和存活率。將不同抗體濃度下的傳遞效率和100微克/毫升胞吞作用和未處理細胞相比較。

通過流式細胞儀(3100)和拉曼光譜測定法(3110)證實碳納米管(dna低聚核苷酸包覆)被成功傳遞了。還可以使用本技術傳遞微管蛋白抗體(3120和3130)，產(chǎn)生細胞的擴散分布，這與細胞質(zhì)傳遞相一致。上述材料使用目前方法難以傳遞到細胞的細胞質(zhì)中，并且每個材料通常要求一種專門的修飾來促進傳遞。在實施例3中，使用相同的條件設置，在10微米-6微米χ5的裝置中將所有四種材料傳遞到hela細胞中。

蛋白質(zhì)向初級細胞中的有效傳遞能夠用于一些治療應用。細胞再編碼問題是之前cpp-基蛋白質(zhì)傳遞方法所無法解決的。圖32顯示了蛋白質(zhì)傳遞應用。在3200顯示了使用細胞滲透性肽與10微米-6微米裝置將c-myc,klf-4,oct-4和sox-2傳遞到新生人包皮成纖維細胞(nuff)的蛋白質(zhì)印記。

四個蛋白質(zhì)的每個都具有9個精氨酸(9r)基團，從而促進吸收。裂解柱對應細胞蛋白質(zhì)的內(nèi)含物，將內(nèi)含物洗滌并裂解，同時，soup柱對應介質(zhì)環(huán)境中的蛋白質(zhì)。3210顯示了使用10微米-4微米裝置向脾分離的樹突狀細胞傳遞太平洋藍標記的3kda右旋糖苷和alexafluor488標記的卵清蛋白的傳遞效率和存活率。所有的數(shù)據(jù)點進行三次，誤差線代表兩個標準偏差。

檢測向人成纖維細胞中傳遞四種示例性轉(zhuǎn)錄因子(oct4、sox2、c-myc和klf-4)的能力并將此能力與cpp方法的能力相比較(3200)。結(jié)果顯示，除了不依賴于胞吞作用(胞吞作用會使大多數(shù)材料被內(nèi)含體捕獲)之外，由快速機械變形產(chǎn)生的傳遞對4種蛋白都產(chǎn)生明顯更高的傳遞效率。這一結(jié)果與前述此景作用相一致，結(jié)果顯示，與cpp相關的蛋白傳遞相比，本發(fā)明主題內(nèi)容的傳遞效果好10-100倍。

樹突狀細胞(dc)的抗原呈遞是可以顯示本發(fā)明主題內(nèi)容優(yōu)勢的另一個領域。研究員已經(jīng)開發(fā)了用于在樹突狀細胞mhc類i受體上表達抗原的方法，從而引入潛在的細胞毒性t細胞反應。本發(fā)明的主題內(nèi)容具有直接的臨床應用，例如，依靠抗原蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)傳遞制備癌癥疫苗，這是由于mhc類i呈遞在細胞質(zhì)蛋白中幾乎是不存在的。通過加速材料向細胞質(zhì)中的直接傳遞，本發(fā)明主題內(nèi)容可以用作一種平臺，產(chǎn)生對某一抗原的體內(nèi)細胞毒性t細胞反應。為了說明這一能力，alexa488標記的卵清蛋白作為模型抗原蛋白質(zhì)被成功傳遞到來自于脾的鼠樹突狀細胞中(3210)。盡管在該細胞型中有較高的胞吞作用，但是與胞吞作用參照(0mm/s)相比，該裝置顯著的增加了傳遞效率。而且，根據(jù)細胞傳遞機制將傳遞材料傳遞到細胞質(zhì)中，該特點對于抗原傳遞尤其重要，這是由于細胞質(zhì)壓力對于呈遞mhc類i抗原是至關重要的。

實施例3的系統(tǒng)是一種可以實施的研究工具，該工具能夠傳遞碳納米管、金納米顆粒和抗原(圖31)-三種難以使用現(xiàn)有技術傳遞的材料。本發(fā)明主題內(nèi)容通過促進活細胞結(jié)構(gòu)/蛋白質(zhì)的抗體和量子點染色，以及使碳納米管作為細胞質(zhì)分子探針或者化學傳感器，顯著地擴大了探針進入細胞內(nèi)方法的能力。作為一種魯棒的蛋白質(zhì)傳遞方法，本發(fā)明的方法可以用作肽/蛋白質(zhì)文庫的高通量篩選，這是由于，與大多數(shù)cpp或者納米顆?；夹g不同，本發(fā)明對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學不敏感，不依賴與胞吞途徑，不影響蛋白質(zhì)的功能性。

另外，本發(fā)明主題內(nèi)容可以有效用于治療(圖32)。例如，從血液或其他組織中分離病人的靶細胞，用本發(fā)明裝置處理傳遞理想的治療劑，然后重新引入人體。這種方法利用治療劑大分子增加的傳遞效率，并且由于不需要使用細胞毒性載體顆粒并且消除了潛在的與網(wǎng)狀內(nèi)皮組織清除和脫靶點有關的副作用，本發(fā)明主題內(nèi)容比現(xiàn)有的技術更加安全。

實施例4–個性化的癌癥疫苗

目前大分子細胞內(nèi)傳遞的挑戰(zhàn)在于不能更好的理解疾病機理和實施新型治療方式。盡管近期在傳遞技術上已經(jīng)取得一些進展，但是對病人衍生的細胞處理還是存在挑戰(zhàn)，并且目前的方法通常依賴于有毒的電場或者外源物質(zhì)。本發(fā)明的微流體平臺和有關的系統(tǒng)和方法依賴于細胞的機械變形來加速傳遞。這種受控制的物理方法為之前描述的挑戰(zhàn)領域提供答案，例如蛋白質(zhì)基細胞再編碼和量子點傳遞。

影響細胞行為的最有效和最直接的方法是向細胞的細胞質(zhì)中傳遞活性試劑。因此，大分子的細胞內(nèi)傳遞在研究和發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用，可以在從藥物傳遞到生物化學過程治療應用研究的范圍內(nèi)使用。但是現(xiàn)有的方法具有局限性。他們通常在病人衍生(初級)細胞中具有較低的效率，依靠有毒的電場或者外源材料，并且不適用于傳遞結(jié)構(gòu)多樣性材料，例如蛋白質(zhì)。

魯棒的傳遞平臺能夠解決這些問題，并能夠在生物研究中帶來顯著地進步，可用作新一代治療劑(例如個性化癌癥疫苗)的基礎。例如，向免疫細胞中有效傳遞蛋白質(zhì)的方法可用作癌癥疫苗平臺。

如上所述，這里描述的微流體裝置、相關的系統(tǒng)和方法能夠通過快速使細胞通過收縮部分發(fā)生變形來加速材料向細胞內(nèi)的傳遞。所述變形過程造成細胞膜的短時間破壞，因此使材料從周圍緩沖液中被動擴散到細胞質(zhì)中。由于不需要現(xiàn)有技術方法所依賴的外源材料和電場，本發(fā)明方法提供了一種更簡單的魯棒的方法傳遞，產(chǎn)生更少的毒性。因此，該方法能夠用作一種廣泛的平臺進行大分子的細胞內(nèi)傳遞，并在許多研究和臨床應用(例如，癌癥疫苗)中帶來優(yōu)勢。

圖34是一種系統(tǒng)示意圖，在此系統(tǒng)中，使用微流體裝置處理病人血液進行大分子傳遞。本發(fā)明主題內(nèi)容的一個實施方案包括一種系統(tǒng)，其中從病人血液中分離的樹突狀細胞(dc)被該裝置處理，體外活化這些樹突狀細胞抵抗特定的癌癥抗原并隨后，重新引入病人血液流中。例如，被傳遞的抗原是一種常見的表達抗原，已知與某一特定的基本有關或者與活組織檢查發(fā)現(xiàn)的病人獨有的疾病有關。通過將癌癥抗原直接傳遞到樹突狀細胞的細胞質(zhì)中，本領域普通技術人員可以開發(fā)一種mhc-i類抗原呈遞途徑并向病人體內(nèi)引入有力的細胞毒性t淋巴細胞反應。然后找出被活化的t細胞并破壞所有表達目標抗原的癌癥細胞。該平臺可以靈活使用已有的、疾病特異性抗原或者直接從病人腫瘤中衍生出的抗原，這種靈活性使其能夠治療對其他治療劑有抵抗力的病人。事實上，這種方法提供了一種個性化的靶向疾病的反應并具有最小的副作用。這種實施方案可以在典型的醫(yī)院實驗室中由訓練有素的技師進行(治療前<l小時)。由于其較小的尺寸和相應的簡單性，還可以使用病人操縱的治療系統(tǒng)。

已經(jīng)在鼠模型中顯示了癌癥疫苗方法。這種系統(tǒng)被用于成功將卵清蛋白(模型蛋白)傳遞到鼠樹突狀細胞中并進行處理，并且被mhc類i受體上增加的抗原呈遞、siinfekl肽所證實。這些被治療的樹突狀細胞促進體外增殖性細胞毒性t淋巴細胞(ctl)反應。將處理后的樹突狀細胞重新引入動物體內(nèi)產(chǎn)生體內(nèi)ctl反應。該裝置可有效向來自人類血液的樹突狀細胞中傳遞抗原。

這些數(shù)據(jù)顯示，所述裝置能夠向敏感的初級細胞(包括樹突狀細胞)中傳遞材料，而不引起過多的細胞死亡。因此細胞破壞不是一個重要的問題。通過增加被處理的細胞數(shù)目，增加被傳遞的抗原數(shù)量he多樣性，和/或共傳遞活化因子(例如脂質(zhì)聚糖)可以改善免疫反應。在使用本發(fā)明裝置處理的細胞中沒有觀察到細胞毒性或者只觀察到很少的細胞毒性，因此本發(fā)明不只可行還能夠有效用于治療人類和動物應用。

實施例5–血液癌癥治療

如實施例4所述，細胞的快速機械變形能夠提高一種魯棒的向樹突狀細胞(dc)傳遞抗原的方法，并且因此可以作為細胞治療平臺。本系統(tǒng)基于一種發(fā)現(xiàn)，即細胞的快速機械形變會產(chǎn)生短時間的細胞膜小孔，使周圍培養(yǎng)基中的材料擴散性的傳遞到細胞中。與之前描述過的現(xiàn)有治療所不同，本發(fā)明方法不依賴于常規(guī)融合蛋白質(zhì)、抗原交叉呈遞、病毒載體、納米顆?；蛘甙套饔?；因此本發(fā)明能夠很大的改變體內(nèi)效率同時減少治療劑消耗。這種基本上不同的方法的靈活性和簡單性為樹突狀細胞的活化提供了寬闊的平臺，所述樹突狀細胞的活化能誘導cd8對多種癌癥抗原發(fā)生反應。該系統(tǒng)可以靶向血液癌癥、例如b細胞淋巴瘤，這對免疫治療更加溫和，而且本系統(tǒng)還能夠靶向一些其他的癌癥類型(例如黑素瘤、胰腺癌，等等)并提供一種重要的、個性化的新方法與這些疾病作斗爭。

由于抗癌細胞治療法能夠活化病人的免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生針對該疾病更為長久的抗原特異性cd8t-細胞反應，因此是一種有吸引力的選擇。相對于化學療法和輻射治療來講這些治療，例如最近獲準的用于治療前列腺癌的provenge，具有最小的副作用。但是，通過將抗原傳遞到細胞質(zhì)，發(fā)展細胞治療法的一個最大的障礙已經(jīng)實現(xiàn)合適的抗原呈遞作用。

傳統(tǒng)上，cd8效應子反應活化作用與cd4反應的區(qū)別在于通過外源蛋白進入抗原遞呈細胞(例如樹突狀細胞)的位置不同。細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)誘導cd8反應而胞吞作用捕獲的細胞外蛋白質(zhì)誘導cd4反應。由于抗原呈遞細胞的交叉呈遞機制是難以捉摸的，本領域技術人員必須研發(fā)一種可靠的方法將所需抗原直接傳遞到細胞質(zhì)中從而利用有效的細胞毒素效應因子cd8反應促進治療。向樹突狀細胞的細胞質(zhì)中傳遞的魯棒、有效的方法可以被用作一種平臺，誘導對各種癌癥類型的免疫反應。

圖8a和圖11顯示了在hela細胞上的實驗，這些實驗顯示了細胞快速的機械變形會在細胞膜上產(chǎn)生短時間損傷/小孔，這能使周圍緩沖液中的材料被動擴散到細胞的細胞質(zhì)中。這些之前未報到過的現(xiàn)象產(chǎn)生的細胞在處理后是存活的并且可以正常增殖。實現(xiàn)表明與較小的分子相比，較大的分子顯示較低的傳遞速率，因此顯示了擴散機制。使用共焦顯微鏡測定，成功的sirna傳遞和擴散細胞質(zhì)染色還表明被傳遞的材料處于細胞質(zhì)中，并處于一種活性/可接近態(tài)。傳統(tǒng)上，傳遞抗原的方法通常在細胞系中可以實施但是不能被翻譯為初級免疫細胞。然而這里描述的傳遞方法不依賴于胞吞作用途徑或者細胞對外源材料的反應(在不同的細胞型中有很大的差異)，而主要依賴于膜的雙層性質(zhì)。因此，由于其簡單性和新型途徑，本發(fā)明的技術能夠更為平和的用于向各個細胞系和初級免疫細胞中傳遞，并且主要改善抗原呈遞作用。

根據(jù)卵清蛋白傳遞，通過抗體染色分析抗原的mhci類呈遞和樹突狀細胞成熟。從ot-1和ot-iitcr轉(zhuǎn)基因小鼠中收獲的t細胞還可以用于測定響應于卵清蛋白和/或siinfekl抗原裝載的cd8和cd4增殖作用。與只使用胞吞作用產(chǎn)生的樹突狀細胞注入相比，可以對系統(tǒng)進行優(yōu)化從而增加cd8的增殖作用。

用macscdllc+分離器(miltenyibiotec，德國)純化來自b6小鼠脾的初級鼠樹突狀細胞。一種裝置包括6微米通道寬度的收縮部分，該裝置能夠用于使13umhela細胞的細胞膜成孔。由于這些樹突狀細胞的尺寸較小，還可以利用通道寬度為3-5微米的微組裝和測試裝置。對現(xiàn)有的光刻印刷法和深活性離子蝕刻技術進行修飾使其能夠有效的生產(chǎn)這些裝置?？梢允褂脽晒鈽擞浀挠倚擒辗肿幼鳛槟Ｐ头肿樱ㄟ^facs評價傳遞效率。隨后，使用卵清蛋白傳遞細胞并用蛋白質(zhì)印跡實驗證實蛋白質(zhì)被觸及細胞吸收。

使用cd80和cd86抗體染色檢驗樹突狀細胞成熟過程顯示本發(fā)明快速變形方法誘導細胞成熟。如果認為需要在傳遞后誘導樹突狀細胞成熟過程，可考慮利用細胞外tlr激動劑，例如脂多糖(lps)?？梢詫⒙亚宓鞍讉鬟f給樹突狀細胞，然后用mhc-tsiinfekl抗體定量抗原呈遞。另外，根據(jù)tcr特異性肽的傳遞評價抗原呈遞效率，顯示系統(tǒng)傳遞/呈遞蛋白質(zhì)或肽的能力。隨后，分別從tcr轉(zhuǎn)基因ot-i和ot-ii小鼠中收獲cd8和cd4t細胞，用cfse染色并且與卵清蛋白處理的樹突狀細胞共培養(yǎng)5天。兩個子集的t細胞增殖都可以被facs調(diào)節(jié)。對裝置設計進行優(yōu)化從而與傳統(tǒng)的體外方法(例如胞吞作用)相比產(chǎn)生增加的功能性cd8細胞群體水平。

癌癥細胞治療劑的一個目標是實現(xiàn)多方面誘導抗原特異性cd8反應的能力，迄今為止，由于現(xiàn)有傳遞方法在呈遞抗原方面的低效性或者傳遞方法靈活性不足，所述癌癥細胞治療劑被證明是難捉摸的?，F(xiàn)有方法存在很多缺點，包括這些方法依賴于有損傷的電場、利用外源材料、蛋白序列修飾和/或胞吞作用途徑來促進抗原傳遞。然而本發(fā)明的主題內(nèi)容提供了一種基本上不同的途徑進行細胞質(zhì)傳遞，細胞質(zhì)傳遞不需要受到上述任意一個問題。此外，由于成孔-擴散機理的性質(zhì)，本發(fā)明的方法可以廣泛的用于多種抗原類型并且因此可以解決很多目標癌癥。甚至可以使用相同的基質(zhì)引入其他的信號分子，從而改善樹突狀細胞成熟/活化過程，產(chǎn)生更為有效的t細胞反應。這種廣泛應用的平臺是多用的，并且在作為癌癥疫苗的調(diào)查中，比任何現(xiàn)有的抗原傳遞/呈遞機制更為魯棒。

實施例5影響廣泛?？紤]到癌癥在全國范圍內(nèi)引起的巨大社會重擔(據(jù)估計，2011年美國有570,000死亡)；癌癥可能折磨很大比例的人群。被折磨的人群受益于新型細胞治療劑的發(fā)展，新型細胞治療劑能夠開發(fā)病人免疫系統(tǒng)的效力使之與疾病作斗爭。本發(fā)明主題內(nèi)容是一種更為有效的、個性化的治療平臺，可以治療多種癌癥類型，例如，血液癌癥，比方說，白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤以及骨髓及外骨髓增殖的贅生物和脊髓發(fā)育不良綜合癥。舉例來說，由于他們能夠通過血液循環(huán)，本方法尤其適用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥。例如，可以通過消化腫瘤活組織切片檢查樣品、將溶解產(chǎn)物傳遞到病人的樹突狀細胞中，然后在將此樹突狀細胞引入人體來治療具有未知抗原決定簇的癌癥。這可以活化宿主體內(nèi)針對多種癌癥抗原的t細胞從而實現(xiàn)有效的多靶點治療。這些個性化的方面對患有罕見形式的癌癥的人具有尤其重要的意義，由于曝光在惡劣的環(huán)境中，現(xiàn)有的治療方法難以治療這些人。通過對個體疾病定制治療方法，本發(fā)明方法可以提供及時地、有效的照顧，即使在最具侵略性的病例中，例如多重耐藥性癌癥病例。這種基于免疫的治療還可以非常有效的預防轉(zhuǎn)移(癌癥轉(zhuǎn)移造成90％的癌癥相關死亡)，這是由于cd8t細胞可以容易的固定并且毀壞轉(zhuǎn)移性細胞，而本發(fā)明治療方法提供的免疫記憶可以用于預防未來的復發(fā)。另外，作為一種研究工具，本發(fā)明的方法開啟了抗原過程過程前所未有的機械研究，能夠更好的理解抗原交叉呈遞的過程并因此改善現(xiàn)有/作為替換的免疫活化方法的效率。

實施例6–細胞再編碼

干細胞在目前的再生醫(yī)學研究中起到至關重要的作用，尤其在快速發(fā)展的組織工程設計領域。ipscs具有自更新能力、可以分化成任意細胞類型并且具有自體同源性(病人特異性)，因此是更為感興趣的細胞。ipscs有機會從多功能源中產(chǎn)生多系譜祖細胞，這可以結(jié)合成清晰但是相互作用的組織代謝區(qū)。此外，這些細胞最終會使人類胚胎干細胞(hescs)在臨床應用中不在被需要，從而避免了許多困擾這些細胞類型的道德和倫理上的爭論。而且，病人衍生的ipsc不會產(chǎn)生hesc衍生的免疫排異問題或者最小化hesc衍生的免疫排異問題。因此，目前的研究主要集中在設計有效的、無病毒的、產(chǎn)生大量ipscs的方法。

最初，根據(jù)4種轉(zhuǎn)錄因子oct3/4、sox2、c-myc和klf4的逆病毒過表達，通過再編碼成年鼠和人成纖維細胞(hfs)到一種可塑性狀態(tài)產(chǎn)生ipscs。這種ipsc不僅在整體基因表達、dna甲基化和組蛋白修飾方面與es細胞非常一致，而且還能夠分化成所有三個胚層。雖然ipsc技術在生物醫(yī)學研究和細胞基治療中具有巨大的潛力，但為了實現(xiàn)其全部能力必須克服一些主要障礙。例如，大多數(shù)ipsc細胞系來自于各種體細胞，通過逆病毒或者慢病毒引入編碼再編碼因子的基因，病毒載體集合產(chǎn)生成倍的染色體分離，這些中的任意一個都會產(chǎn)生遺傳性功能障礙和/或腫瘤。另外，再編碼的轉(zhuǎn)基因(尤其是c-myc和klf4)與腫瘤發(fā)生密切相關，提高了其殘基表達和/或復活作用產(chǎn)生腫瘤的可能性。因此，最近許多實驗室開發(fā)了不同的基因組非整合方法，例如腺病毒、附著體載體、mrnas和微rna。值得注意地是，已經(jīng)顯示通過直接將與細胞穿透肽(cpp)融合的四種再編碼因子(oct3/4、sox2、c-myc和klf4)直接傳遞產(chǎn)生ipsc。雖然已經(jīng)報道了通過傳遞大腸桿菌表達的四種cpp融合因子可以產(chǎn)生鼠ipsc，但是據(jù)顯示，使用哺乳動物細胞表達的四種cpp融合因子可以產(chǎn)生人ipsc。然而，這些研究顯示蛋白質(zhì)基再編碼的再編碼效率是非常低的(<0.01％)。由于蛋白質(zhì)基的再編碼不包括任何類型的遺傳物質(zhì)(dna或者rna)和載體媒介物(病毒或者質(zhì)粒)，蛋白質(zhì)的直接傳遞提供了一個最安全的再編碼過程。已經(jīng)顯示，蛋白質(zhì)基人ipscs能夠有效的產(chǎn)生功能性多巴胺神經(jīng)元，并且不會產(chǎn)生與病毒基因組集合有關的異常性質(zhì)。使用本發(fā)明的傳遞平臺技術，本發(fā)明主題內(nèi)容可以改善蛋白質(zhì)基再編碼的效率，因此在很大程度上打開了產(chǎn)生臨床上可使用的ips細胞的可能性。

而且，本方法能夠通過阻止控制mrna、質(zhì)粒和病毒重新編碼中的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄的隨機過程更精確的控制細胞功能。因此，與其他作為替換的方法相比，直接蛋白質(zhì)傳遞具有兩個基本優(yōu)點，能夠去除誘變性插入的風險，并能夠更準確的控制高敏感度的再編碼過程。這里描述的傳遞技術顯示了其以高效率向hf和干細胞傳遞蛋白質(zhì)的能力。進行實驗比較本發(fā)明技術與現(xiàn)有的細胞穿透肽方法的傳遞能力，實驗結(jié)果顯示使用本發(fā)明方法的傳遞能力顯著增加(根據(jù)模擬結(jié)果，傳遞能力可能增加100倍以上)。而且，其物理成孔機制不再需要進行化學修飾或者利用外源化合物，進行化學修飾或者利用外源化合物是其他作為替換的蛋白質(zhì)傳遞方法所需要的。由于本方法對于被傳遞的材料是不可知論的，小分子、sirna及其他因子還可以在重新編碼期間共同傳遞。因此，本系統(tǒng)提供了一種獨特的工具，通過直接蛋白質(zhì)傳遞來誘導細胞重新編碼。這種簡單的作用機制(即，通過小孔擴散)還能使本領域技術人員可以較高準確度預計并控制傳遞量，從而促進最優(yōu)化研究，改善對重新編碼動力學的理解，并因此極大的提高效率。最后，本領域技術人員可以將這種微流體技術用作醫(yī)療器械來產(chǎn)生ipsc，用于臨床組織設計和細胞治療應用。而且，該系統(tǒng)的應用不限于蛋白質(zhì)傳遞。

這些技術可以被包括在一種通用的傳遞方法中，用于將大范圍的大分子(dna、rna、蛋白質(zhì)、糖和肽)傳遞到幾乎所有細胞類型中。這能夠適用于所有現(xiàn)有技術使用的應用中?，F(xiàn)有的脂質(zhì)體、納米顆粒和電穿孔-基方法，例如，通常不能轉(zhuǎn)染某些初級細胞(例如，免疫細胞或者干細胞)并且不能有效的傳遞蛋白質(zhì)和納米顆粒(例如量子點)。本發(fā)明的新方法還可以傳遞肽，用于治療劑篩選和疾病機理應用，而目前的方法通常需要化學修飾或者密封。本領域技術人員還可以使用本發(fā)明的方法進行納米顆粒-基的傳感應用，從而傳遞修飾的量子點進行細胞器標記和機理性疾病研究。

細胞內(nèi)傳遞是許多生物研究應用的基礎，包括基因表達原理研究、疾病機制研究，以及在本應用中解決的，ipsc的產(chǎn)生。已經(jīng)建立的傳遞方法，例如脂質(zhì)體、聚合納米顆粒和電穿孔方法常常涉及外源化合物用作傳遞工具(或者，對于電穿孔的情況來說是電場)，并且是材料和/或細胞特異性的。例如，lipofectamine(invitrogen)可以傳遞dna和rna分子(到細胞系子集或者初級細胞)，但是不能形成合適的復合物傳遞蛋白質(zhì)或者其他大分子。另一方面，雖然電穿孔能夠靶向一系列細胞類型，但是由于電穿孔的高電場會破壞細胞，因此在蛋白質(zhì)傳遞上的成就非常有限。例如，這使電穿孔非常不適合于ipsc產(chǎn)生過程中要求的多次轉(zhuǎn)染。膜穿透肽是另一個主要針對蛋白質(zhì)的傳遞技術。然而這些基于肽的方法對肽的功能具有不可預知的作用，并且在內(nèi)涵體中經(jīng)歷重要的蛋白質(zhì)降解作用。因此，本發(fā)明主題內(nèi)容描述了一種通用的方法，該方法能夠傳遞大范圍的大分子(dna、rna、蛋白質(zhì)、肽、小分子)，并造成最小的細胞死亡，能夠史無前例的在一個技術平臺上控制細胞功能，從而研究疾病機理，識別大分子治療劑候選物、指導干細胞的分化作用或者重新編碼，并且使用報道細胞系發(fā)展診斷技術。

這里描述的微流體裝置可以作為一種廣泛應用的傳遞平臺。作為一種微流體裝置，本發(fā)明的裝置能夠精確的控制單個細胞水平的處理條件。既能夠進行單細胞水平的控制也能夠進行大規(guī)模處理量，這種特有的結(jié)合使本發(fā)明的裝置相對于現(xiàn)有傳遞方法處于一種獨有的位置。迄今為止，數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明系統(tǒng)能夠向超過11種不同的細胞型中傳遞材料，包括癌細胞系、胚胎干細胞、初級成纖維細胞和初級淋巴細胞。其機械成孔機制還能夠傳遞預先激發(fā)的材料，例如碳納米管和量子點。

之前的工作使用重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生ipsc，并顯示具有極低的效率(<0.01％)因此不適用于廣泛的臨床應用。然而這里提到的裝置、系統(tǒng)和方法顯示他們能夠直接傳遞蛋白質(zhì)進入細胞質(zhì)，并且具有較高的效率和最小的細胞死亡，因此通過更有效的傳遞提供了強制機會使重新編碼效率實質(zhì)上提高。本領域技術人員可以通過直接確定有效蛋白的數(shù)量來準確的控制細胞內(nèi)動力學。另一方面，其他的重新編碼方法(例如，病毒、質(zhì)粒和mrna表達)根據(jù)隨機效應確定蛋白有效性水平并因此不適于動力學研究?，F(xiàn)有重新編碼方法的低效率表明這些過程對隨機變化具有較高的靈敏度并且只有很小范圍的轉(zhuǎn)錄因子表達水平進行重新編碼。通過直接將蛋白質(zhì)傳遞到細胞質(zhì)中，本領域技術人員可以準確的控制蛋白質(zhì)的有效性并因此更均勻的使用重新編碼所需的具體條件。一旦識別并優(yōu)化了這些條件，這些條件可以對每個經(jīng)歷處理的細胞精確復制并因此顯著地改善重新編碼效率。

該技術能夠改善多種細胞內(nèi)傳遞應用。另外，本技術完全使用機械作用的性質(zhì)因此消除了使用化學試劑或者電場所產(chǎn)生的潛在的復雜因素。數(shù)據(jù)沒有顯示處理后細胞行為發(fā)生任何實質(zhì)上的變化。因此，本系統(tǒng)是一種魯棒的、高通量、高效率、通用的細胞內(nèi)傳遞機制，并可以特定的用于重新編碼。

證據(jù)表明，細胞通過收縮部分時發(fā)生的快速變形能夠誘導細胞膜上短時間內(nèi)產(chǎn)生小孔，允許大分子從周圍緩沖液中擴散進入細胞液。本技術已經(jīng)在11中不同的細胞類型中使用過，包括癌細胞系、初級成纖維細胞、初級淋巴細胞和胚胎干細胞(不產(chǎn)生分化作用)。一個原型能夠處理大約20,000細胞/秒并且可以處理一定范圍的細胞濃度(10⁴-10⁸個細胞/毫升)。通過改善實驗方案和芯片設計可以極大的緩解堵塞問題，因此每個裝置在堵塞之前能夠處理大約1百萬個細胞，并可以被清潔循環(huán)使用。另外，多通道設計提供了顯著的重復性因此一個通道的堵塞不會影響其他通道的性能。壓力驅(qū)動流動(在控制的恒壓下)并且通道的平行設計確保無論芯片中被堵塞的通路的百分比是多少，每個通道都具有均勻的流動曲線。

所述裝置已經(jīng)顯示了一種能力，能夠?qū)⒂倚擒辗肿觽鬟f到人成纖維細胞和胚胎干細胞中。圖35顯示了細胞重新編碼的潛在優(yōu)勢。在3500中顯示了被10微米-6微米裝置處理并傳遞3kda右旋糖苷后的人胚胎干細胞的傳遞效率和存活率。在3510，對使用細胞穿透肽向新生人成纖維細胞(nuff)中傳遞的c-myc,klf-4,oct-4和sox-2和使用10微米-6微米裝置向新生人成纖維細胞(nuff)中傳遞的c-myc,klf-4,oct-4和sox-2進行蛋白質(zhì)印跡實驗。溶解產(chǎn)物(ly)柱對應于細胞的蛋白質(zhì)含量，所述細胞被洗滌并裂解，而顯影劑柱對應于培養(yǎng)基環(huán)境中的蛋白質(zhì)含量。在3520中顯示了在傳遞了重新編碼因子后固定的新生人成纖維細胞(nuff)的共焦顯微鏡圖像。使用alexa488共軛的抗flag抗體標記所述蛋白質(zhì)并用dapi進行核染色。

而且，將本發(fā)明裝置的傳遞效率與目前用來進行蛋白質(zhì)-基重新編碼的9個精氨酸(cpp)方法相比較。蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果(3510)顯示被傳遞的c-myc,klf4,oct4和sox2數(shù)量顯著增加。然后共焦顯微鏡檢查法證實這些轉(zhuǎn)錄因子被成功的固定在細胞核(3520)中。在comsol中開發(fā)一種簡單的2-d擴散模型，根據(jù)離子從細胞質(zhì)內(nèi)外擴散的記載值來模擬傳遞機制。將此模型與實驗數(shù)據(jù)相擬合，據(jù)估計該技術能夠?qū)⒕彌_液中存在的10-40％的傳遞材料傳遞到細胞質(zhì)中。相比較而言，用于傳遞蛋白質(zhì)的cpp方法只能將0.1％的緩沖液材料傳遞到細胞質(zhì)中，因此，本方法有效的增加的被傳遞的重新編碼材料的量(10-100倍)。而且，確保被傳遞的轉(zhuǎn)錄因子具有更大的生物利用率。

圖36通過直接傳遞融合的重新編碼蛋白質(zhì)顯示了小鼠和人ipsc細胞系的產(chǎn)生的定性。在3600，開始小鼠干細胞培養(yǎng)(第一圖像)；在進行6個蛋白質(zhì)治療處理之后的形態(tài)(第二圖像)；建立的ips菌落(第三圖像)和對建立的ips菌落進行ap染色(第四圖像)。3610顯示了p-mipsc的esc標記物免疫染色。用dapi(藍色)對核染色。在3620中，對oct4啟動子進行重亞硫酸鹽序列分析顯示p-mipsc-1和p-mipsc-2系中幾乎完成了所有次生的重新編碼。開環(huán)和閉環(huán)分別表示未甲醇化的和甲醇化的cpg。在3630，通過對免疫缺陷型小鼠注射p-mipscs并對畸胎瘤進行h&e染色分析體內(nèi)分化能力。所得的包括畸胎瘤的組織顯示所有三個胚層；外胚層(神經(jīng)管或者表皮)、中胚層(軟骨或者肌肉)和內(nèi)胚層(呼吸上皮或者腸狀上皮)系譜細胞。在3640，p-mipsc-1(左圖)衍生的嵌合體以及e13.5胎兒的p-mipsc-2(右圖)顯示注射的p-mipscs中具有高水平的綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)。在3650到3670，通過直接將cpp融合的四種重新編碼因子從人活組織切片成人的成纖維細胞(3650)中直接傳遞來產(chǎn)生人ipsc細胞系、p-hipsc-01(3660)和p-hipsc-02(3670)。

圖37描述了初級蛋白質(zhì)重新編碼結(jié)果。在3700中顯示了成纖維細胞向菌落的形態(tài)變化進展。白色箭頭表明潛在的重新編程細胞。紅色箭頭指向聯(lián)合ipscs形成菌落。在3710到3760顯示了在ipsc菌落中表達人胚胎干細胞標記物oct4、ssea-4、tra-60、tra-80、堿性磷酸酶(ap)。在適當?shù)臅r候，小方塊表示dapi復染。標尺為100微米。

由于產(chǎn)生了蛋白質(zhì)-基人ipsc并對其進行了定性，使用之前的cpp-融合的重新編碼因子生產(chǎn)進一步完全重新編碼的小鼠和人ipsc，然后用所有標準方法進行檢驗，包括次生分析、體內(nèi)多能性和嵌合體形成(圖36)。然而，就算是使用部分純化的蛋白質(zhì)，這種重新編碼的效率還是很低的(<0.1％)并且比病毒重新編碼方法花費的時間更長。因此，嘗試使用本發(fā)明裝置向人成纖維細胞中傳遞4種重新編碼蛋白質(zhì)oct4、sox2、klf4、和c-myc，緩沖液濃度為80微克/毫升。將細胞處理4次，每次傳遞之間間隔48小時。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-20小時之后，出現(xiàn)第一個重新編碼的hipsc-樣菌落。在這段時間內(nèi)，由于形成了ipsc菌落并表達了一些hesc標記物，因此可以觀察到成纖維細胞形態(tài)上的變化。

內(nèi)涵蛋白、細胞膜穴樣內(nèi)陷和巨胞飲是三種最常見的胞吞內(nèi)化作用機制。為了檢驗在快速細胞變形之后進行的大分子傳遞中是否涉及胞吞作用，可以使用已知的化學品阻擋這種機制。具體地說，可以使用氯丙嗪抑制內(nèi)涵蛋白介導的胞吞作用；使用金雀異黃素(genisten)抑制細胞膜穴樣內(nèi)陷介導的胞吞作用；以及使用5-(n-乙基-n-異丙基)阿米洛利(amirolide)(eipa)抑制巨胞飲(所有都購自sigmaaldrich公司)。在處理前，將hela細胞與氯丙嗪(10微克/毫升)、金雀異黃素(genisten)(200微摩)和eipa(25微摩)一起培養(yǎng)2小時。然后對細胞進行快速變形處理，傳遞右旋糖苷、dsred和dsred-9r蛋白質(zhì)。使用熒光激活細胞分類術測定各自的傳遞效率，這些傳遞效率解釋了胞吞抑制作用對cpp和基于裝置的傳遞機制的影響。用共焦顯微鏡檢查法，使用內(nèi)含體標記物(invitrogen)進行共定位實驗，還可以幫助確定螯合進入內(nèi)涵體中的材料百分比。

也可以將快速細胞變形系統(tǒng)與其他已經(jīng)確定的傳遞方法(例如電穿孔)耦合，從而緩和胞吞作用機制。

收縮部分附近的結(jié)合電極可以與變形和電穿孔相耦合，使傳遞作用效率足夠產(chǎn)生與各個方法單獨使用時相比更高的系統(tǒng)性能。另外，可以與一些化學試劑(例如氯化喹啉(sigma公司))、各種聚合物或者內(nèi)涵體逃逸肽共傳遞，這種共傳遞可以用于幫助被傳遞的材料在快速細胞變形系統(tǒng)中進行內(nèi)涵體逃逸。

隨著細胞穿過收縮部分，細胞經(jīng)歷短暫的(大約10-100微秒)但是快速的剪切作用和壓縮作用。之前顯示弦向剪切力能夠誘導小孔形成。然而，該系統(tǒng)還誘導機械壓縮。為了評價這些參數(shù)，傳遞前，在0.1微克/毫升lantrunculina(invitrogen公司)中培養(yǎng)hela細胞和hf細胞1小時使肌動蛋白細胞骨架解聚。

使用本發(fā)明快速變形裝置可以向被處理的細胞群中傳遞熒光標記的右旋糖苷(invitrogen公司)。在處理前，在10微摩秋水仙堿(sigma)中培養(yǎng)細胞2小時解聚微管網(wǎng)絡，在此細胞中重復這些實驗。用熒光激活細胞分類術測定毒素處理的細胞相對于未處理的參照的傳遞效率。小孔形成被認為與細胞相應于給定的幾何形態(tài)的變形速率有關。預先用一種裝置研究細胞骨架在抵抗變形中的作用，所述裝置探試細胞變形性從而提供變形率的定量測量值。在此方法中，將電極放置在收縮部分的兩端，隨著細胞通過測定兩個電極之間的電容變化。然后該收縮部分之間的電容變化與細胞轉(zhuǎn)播時間(即，其形變形率)有關。在上述實驗中，這種裝置的傳遞情況與這些之前的變形研究有關，從而在變形率和成孔效率之間產(chǎn)生一種定量關系。

與已經(jīng)公開的定性聲孔作用的研究類似，在處理后，在確定的時間間隔取樣，對固定的樣品進行掃描電子顯微鏡法(sem)和透射電子顯微法(tem)直接測量此時間內(nèi)預計的小孔尺寸和分布?？梢栽谑覝貤l件下，使用25％的戊二醛溶液(sigma公司)固定細胞。然后在成像前對細胞樣品進行連續(xù)的乙醇洗滌使其脫水。使用環(huán)境sem(esem)技術對固定的樣品直接成像。然而，由于這種技術的分辨率相對較低(大約200納米)，因此適合于檢測1-0.5微米規(guī)格的形態(tài)變化或者損傷。如果esem不能檢測出任何形態(tài)變化，可以用真空蒸發(fā)器將該細胞涂布一層1-10納米后的金，從而將分辨度提高到納米規(guī)格，這是使用sem直接觀察更精細的孔結(jié)構(gòu)所需要的。如果sem不能產(chǎn)生理想結(jié)果的話，還可以使用tem作為替換性的成像技術。這些技術可以使本領域技術人員將局部損傷與傳遞的均勻成孔機制相區(qū)別，并測定平均孔徑和分布。將經(jīng)歷快速細胞變形的細胞中的孔徑和分布與未被處理的細胞的相比較。細胞膜表面上局部的孔分布顯示了損傷模型，而更均勻的分布證實均勻的成孔模型。

使用comsolmultiphysics軟件構(gòu)造成孔細胞的三維模型。使用細胞質(zhì)和緩沖液擴散率已經(jīng)發(fā)表的數(shù)據(jù)，結(jié)合理論研究中得到的合適的孔徑模型，可以產(chǎn)生預計性的傳遞模型。該模型模擬多孔膜，將低擴散率細胞質(zhì)與高擴散率緩沖區(qū)域分離開。在此模型的假設下，在再次密封之前，這些小孔在固定的時間內(nèi)具有固定的尺寸。通過與matlab或者其他軟件結(jié)合使用可以將動態(tài)小孔行為，例如形狀和直徑方面的變化，整合入復雜模型。使用熒光激活細胞分類術和凝膠電泳(例如蛋白質(zhì)印跡實驗)獲得的實驗數(shù)據(jù)確定傳遞量的模擬預測?？梢允褂眠@些比較調(diào)整模型從而使其能夠預計被傳遞的材料的量。這種模型的預計能力可以模擬改變孔徑的作用、孔徑開啟時間的作用和緩沖濃度的作用，因此可以被用作未來科學的指導。

多物理場模擬(例如，comsol或者cfd-ace)還可以被用于模擬液體通過該裝置的流動?？梢允褂眠@些模型更精確的預計流動速度和進口部分、出口部分以及收縮部分的剪切力。這些數(shù)據(jù)可以用于解釋剪切力和流動速度之間的聯(lián)系，從而更有效的通過收縮部分傳遞。而且，通過構(gòu)建該裝置更多的模型，可以研究不同通道之間的壓力分布并調(diào)整入口部分和出口部分的涉及，從而確保所有的通道在幾乎相同的條件下操作，以改善細胞群體受到的處理的均勻性。

首先，優(yōu)化傳遞現(xiàn)象從而增加傳遞效率和細胞存活率。群體均勻性(即向每個細胞傳遞類似量的材料)可以被用作次級優(yōu)化參數(shù)。最初的結(jié)果識別出細胞速度、收縮部分長度、收縮部分寬度以及入口部分形狀是敏感的參數(shù)。另一方面，培養(yǎng)基組成仿佛不是一個主要因素?？梢詷?gòu)建一系列裝置從而系統(tǒng)性改變收縮部分長度和寬度分別至5-50微米和4-8微米?？梢允褂貌煌男苯切纬瑟M窄的收縮部分。熒光激活細胞分類術測定的這些裝置的實驗效率和存活率與上述模型數(shù)據(jù)有關，從而更好的理解剪切力和收縮部分尺寸的作用。對不同的細胞系重復此過程，不同的細胞系可能對處理的反應不同。該數(shù)據(jù)可被用于研發(fā)具有最有幾何結(jié)構(gòu)和操作參數(shù)的裝置，進行特定的細胞(或者特定的細胞子集)傳遞。

圖38的顯微照片說明了作為選擇的裝置結(jié)構(gòu)。明場顯微照片顯示了將收縮部分和電極結(jié)合的準備工作(刻度尺是30微米)。如圖38所述，通過將快速變形現(xiàn)象與電穿孔相耦合來修飾裝置。通過光刻法印刷法和金沉淀法將金電極整合在收縮部分的兩邊，從而向通路中引入局部電場。后續(xù)實驗可以確定操作參數(shù)值(電場強度、頻率和操作速度)，從而使本發(fā)明方法具有改善的性能。本領域技術人員將兩個獨立的成孔機制耦合可以更精確的控制系統(tǒng)并變換多個參數(shù)對每種細胞類型都實現(xiàn)最佳的系統(tǒng)性能。

另外，電場可以被用作驅(qū)動力來傳遞較大的帶電分子(例如dna)，所述較大的帶電分子具有較低的擴散速率?？梢詾闈撛诘暮献髡咛峁┻m于使用的可流水線生產(chǎn)的并易于處理的系統(tǒng)版本。使用聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯的注入制?；蛘邿釅河》ㄌ峁┗诰酆衔锏难b置。隨后，降低的成本能夠使這些裝置用作可隨意處置的工具，從而改善無菌效果并易于使用。另外，通過簡化管道連接、系統(tǒng)安裝和設置壓力調(diào)節(jié)器可以提供易于使用的系統(tǒng)。

將成纖維細胞基于蛋白質(zhì)的重新編碼入ips細胞中，并研究重新編碼的參數(shù)空間的最佳值。上述研究表示通過將cpp融合的重新編碼因子從人和小鼠組織(圖36)中直接傳遞，可以產(chǎn)生ipsc，并且表明這些蛋白質(zhì)-ipsc可以分化成功能性細胞(例如，多巴胺神經(jīng)元)，并且不會產(chǎn)生與病毒ipsc有關的異常表型。然而，由于培養(yǎng)基中許多因子(包括蛋白質(zhì))會發(fā)生降解作用，不能傳遞，并且由于細胞內(nèi)含體中的降解，直接蛋白質(zhì)傳遞的重新編碼效率也非常低(<0.01％)不適于任何實際應用。通過有效的直接將蛋白質(zhì)傳遞到細胞質(zhì)中，這里描述的微流體裝置可以顯著的增加基于蛋白質(zhì)的重新編碼效率，從而避免游離蛋白質(zhì)或者裝入膠囊中的蛋白質(zhì)傳遞方法常常會遇到的惡劣的體內(nèi)環(huán)境和繁重的內(nèi)逃逸過程。

使用微流體基傳遞方法可以加速人ipsc的產(chǎn)生。所述裝置可用于向胚胎人成纖維細胞(hf)中傳遞4個重新編碼蛋白質(zhì)中的一種或者一種以上(c-myc(蛋白質(zhì)，genbank登記號：np_002458.2；dna,genbank登記號：nm_002467.4)、klf4(蛋白質(zhì)，genbank登記號：aah30811.1；dna,genbank登記號：nm_004235.4),oct4(蛋白質(zhì)，genbank登記號：adw77326.1；dna,genbank登記號：hq122675.1),和sox2(蛋白質(zhì)，genbank登記號：np_003097.1；dna,genbank登記號：nm_003106.3)。除了yamanaka四種因子之外(mkos是c-myc-klf4-oct4-sox2)，一些其他的因子(例如，lin28(蛋白質(zhì)，genbank登記號：aah28566.1；dna,genbank登記號：nm_024674.4)和nanog(蛋白質(zhì)，genbank登記號：aap49529.1；dna,genbank登記號：nm_024865.2),esrrb(蛋白質(zhì)，genbank登記號：aai31518.1；dna,genbank登記號：nm_004452.3),glisl(蛋白質(zhì)，genbank登記號：np_671726.2；dna,genbank登記號：nm_147193.2),和prdm14(蛋白質(zhì)，genbank登記號：np_078780.1；dna,genbank登記號：nm_024504.3)以及被識別出能夠提高重新編碼效率。已經(jīng)充分證明6種因子(mkos+lin28和nanog；mkosln)的哺乳動物表達和提純，并使用報道實驗證實各個因子的生物活性。這些因子可以在大腸桿菌或者哺乳動物細胞中表達。由于大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)缺少后翻譯修飾(例如，磷酸化作用、乙?；饔煤头核鼗?ubiquitination))，在哺乳動物細胞(hek293和cho)中表達后，可以使用純化的蛋白質(zhì)。大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)(可以從stemgent(劍橋，麻省)公司商業(yè)上購得)可以用作對比。首先，通過轉(zhuǎn)染在hek293細胞中表達的flag標記的重新編碼因子可以被重新懸浮在np40細胞溶解緩沖液中，所述緩沖液包括50mmtris-hcl，ph值為7.4，250mmnacl，5mm乙二胺四乙酸，1％np-40和蛋白酶抑制劑。離心之后，用平衡的抗flagm2瓊脂糖親合凝膠加入收集的可溶部分。用磷酸緩沖液洗滌兩次，加入0.1毫克/毫升flag肽(sigma)洗提所得的flag標記蛋白質(zhì)。

人成纖維細胞和4或者6個純化的蛋白質(zhì)的懸浮溶液可以被用于該裝置，并且將被處理的細胞放置于涂布0.1％明膠并含有調(diào)節(jié)的hesc培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)1、2或3天，隨后進行下一次傳遞循環(huán)。在使用本發(fā)明微流體裝置重復進行蛋白質(zhì)傳遞循環(huán)(6-16次)后，將被處理的細胞放置在使用絲裂霉素c處理的小鼠胚胎成纖維細胞(mef)中，并在常規(guī)hesc培養(yǎng)基中生長3-4周。在mef上接種3周后可以觀察到ipsc菌落。產(chǎn)生ipsc的效率可以與使用最初的cpp-融合重組蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)傳遞的效率相比較。如之前所述，按照所有可靠ipsc標準徹底檢查這些ipsc候選物，所述標準包括分子和細胞性質(zhì)，以及體外和體內(nèi)多能性。使用4或6種因子會產(chǎn)生具有改善效率的ipsc系。還可以進一步的表達其他因子，例如esrrb、glisl和prdm14，并且在重新編碼實驗中使用這些因子。

重新編碼的蛋白質(zhì)和mrna和/或微rna可以結(jié)合傳遞。所述微流體裝置不僅可以被用于傳遞蛋白質(zhì)，還可以用于傳遞其他大分子。為了利用這種獨特的性質(zhì)進行最優(yōu)的非基因組統(tǒng)一重新編碼，可以結(jié)合使用重新編碼因子和信使rna和/或微rna。尤其是，只使用微rna就可以成功的產(chǎn)生ipsc系，這一點非常有意義。實際上，基于lipofectamine的微rna轉(zhuǎn)染可以產(chǎn)生ipsc-樣菌落。由于與重新編碼因子相比，微rna可能在不同的機制中誘導重新編碼，因此通過本發(fā)明微流體裝置將重新編碼蛋白質(zhì)和微rna適當?shù)慕Y(jié)合在一起，可以進一步提高重新編碼效率。蛋白質(zhì)和mrna的結(jié)合傳遞能夠顯著的促進重新編碼效率。因此，使用本發(fā)明的微流體裝置能夠傳遞最佳結(jié)合的蛋白質(zhì)、mrna、和/或微rna。雖然微rna/mrna不能提供與蛋白質(zhì)相等水平的參照，但是本發(fā)明裝置的高通量最優(yōu)化研究能力相對于之前的方法效率具有顯著的增加。

本發(fā)明微流體裝置的獨特性質(zhì)能夠傳遞各種量的因子，以一種受控制的并可重復的方式。本發(fā)明主題內(nèi)容的優(yōu)化可以促進一種可靠的、高效的工具的發(fā)展，用于將蛋白質(zhì)傳遞入hf。這可以解釋每種重新編碼因子的最佳傳遞量和頻率。與mrna、質(zhì)粒或者病毒方法所不同，本發(fā)明系統(tǒng)不依賴于基因表達和/或翻譯的隨機性質(zhì)來確定轉(zhuǎn)錄因子的有效細胞內(nèi)濃度。因此，該裝置能直接將蛋白質(zhì)傳遞到細胞質(zhì)中，并將其放置在獨特的位置來精確控制細胞內(nèi)環(huán)境?？梢赃M行一系列傳遞計劃來改變處理頻率(每天一次、每兩天1次或者每3天一次)以及分別改變四個因子每個的蛋白質(zhì)濃度。尤其是，一些報告顯示高水平的oct4對于有效的重新編碼非常重要，可以使用不同濃度的oct4檢測該作用同時保持其他因子的濃度相同。對給定的細胞型評價不同濃度的c-myc，這是因為在某些情況下已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高濃度的c-myc會產(chǎn)生大多數(shù)轉(zhuǎn)化菌落而不是ipsc。而且，可以檢測更頻繁的處理c-myc的作用，這是由于在適當?shù)臐舛认耤-myc具有非常短的半衰期(大約30分)。

使用這里描述的方法促進重新編碼因子短暫處理的優(yōu)化。每個因子都具有功能作用并且參與重新編碼過程。在至少一個和有些情況下，需要結(jié)合這些因子實現(xiàn)理想的重新編碼結(jié)果。例如，c-myc已知能夠抑制分化基因的表達。另外，klf4已知抑制微rnalet-7，微rnalet-7與分化作用途徑和多能性抑制作用有關。因此，在初始時，根據(jù)次最佳條件處理c-myc和/或klf4可以暫時調(diào)節(jié)重新編碼作用。另外，雖然ipsc的產(chǎn)生不需要nanog，但是本領域已知nanog對于多能性的最終確定和保持是十分重要的。因此，可以檢測在重新編碼過程末期增加nanog的作用。而且，檢測連續(xù)處理的微rna和蛋白質(zhì)并比較各個處理方法之間和同時使用這些處理方法之后的重新編碼效率。由于本發(fā)明微流體裝置獨特的性質(zhì)，所述暫時調(diào)節(jié)的重新編碼作用是可以實現(xiàn)的，并且對于進一步優(yōu)化蛋白質(zhì)的重新編碼是十分重要的。通過將第28天的菌落數(shù)除以被處理的hf細胞數(shù)來計算重新編碼效率。一旦完成，使用回歸分析推導每個重新編碼因子、其最佳濃度、最佳傳遞頻率/時間的相對重要性，和因此而得到的產(chǎn)生ipsc的最佳方案。每個因子控制傳遞到每個細胞中的蛋白質(zhì)數(shù)量和時間的能力闡明了每個因子在重新編碼過程中的功能顯著性，因此進一步提高了對細胞重新編碼過程和多能性建立的了解。另外，該工作的結(jié)果可用于進一步改善裝置設計從而滿足重新編碼的具體需要并最終發(fā)展成臨床使用的版本。

如上所述，使用優(yōu)化的蛋白質(zhì)重新編碼方法，本發(fā)明方案通?？梢员挥糜诓∪颂禺愋猿扇顺衫w維細胞。由于esc和ipsc可以有效分化成功能性多巴胺神經(jīng)元并且以及研究了其移植作用，因此可以從來源于帕金森病人的人成纖維細胞中產(chǎn)生ipsc或ipsc細胞系。一旦產(chǎn)生了ipsc細胞系并對其定性，這種細胞可以被誘導分化成多巴胺神經(jīng)元并表征其細胞、分子、生理學和電生理學性質(zhì)。在移植入帕金森氏病動物模型(例如遺傳性pd模型或者aphakia小鼠)之后，在體內(nèi)檢測多巴胺神經(jīng)元的功能性。

基于微流體的蛋白質(zhì)傳遞可以被用于直接細胞轉(zhuǎn)化，例如，直接將成纖維細胞轉(zhuǎn)化成其他細胞類型，例如功能性神經(jīng)元、肝細胞和血細胞。過去，使用關鍵轉(zhuǎn)錄因子的病毒表達的操作方法造成重要的染色體分裂和基因突變，從而使開發(fā)非病毒、基因組非整合轉(zhuǎn)化方法的需要更加顯著，例如在這里描述的直接蛋白質(zhì)傳遞方法。因此，該裝置可以用基于微流體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)傳遞進行直接細胞轉(zhuǎn)化。由于有時，某些轉(zhuǎn)錄因子的哺乳動物表達被激發(fā)，使之更易于使用一個或兩個蛋白質(zhì)因子進行檢驗。然后，有可能使用單個因子(例如，oct4或者sox2)將成纖維細胞轉(zhuǎn)化為另一個細胞歷程，從而分別產(chǎn)生血液或者神經(jīng)前體。這些蛋白質(zhì)在純化的形式更易于應用，用于通過基于微流體的蛋白質(zhì)傳遞進行細胞轉(zhuǎn)化。

圖44是條形圖，使用本發(fā)明微流體裝置和相關方法對活性sirna序列和被攪亂的參照進行處理48小時之后，測定綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)強度，顯示了hesc中的綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)抑制作用。圖45a和圖45b顯示了在傳遞了3kda藍染料之后的染料強度和人胚胎干細胞的存活率。

其他的實施方案也包括在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。例如，由于軟件的性質(zhì)，上述功能可以使用軟件、硬件、操作系統(tǒng)、有線通信系統(tǒng)或者任何這些的結(jié)合來實施。特征實施功能也可以物理上位于各個位置，包括被分配的位置，因此所述功能可以在不同的物理地點實施。

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