專利名稱：一種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定性和定量評(píng)估方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物物質(zhì)功能的測(cè)試方法，具體涉及神經(jīng)細(xì)胞感受刺激和傳導(dǎo)興奮功 能的評(píng)估方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能是信號(hào)傳導(dǎo)或信息傳遞，其基本單位是神經(jīng)細(xì)胞，即神經(jīng)元。 神經(jīng)元(Neuron)是一種高度特化的細(xì)胞，是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位之一，它具有 感受刺激和傳導(dǎo)興奮的功能，所以對(duì)其的觀察和評(píng)估具有重要意義。例如對(duì)一些神經(jīng)元樣 細(xì)胞功能的觀察和評(píng)估可以協(xié)助判斷這些細(xì)胞是僅僅結(jié)構(gòu)類似神經(jīng)元還是功能上具備神 經(jīng)元的功能；對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能的觀察還可以評(píng)價(jià)不同的病理?xiàng)l件或藥物等干預(yù)條件對(duì)神經(jīng) 細(xì)胞功能活動(dòng)的影響；研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞分化過程也都涉及到對(duì)其功能的觀察 評(píng)估。目前，神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)或信息傳遞功能的檢測(cè)主要依賴細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，該 技術(shù)通過玻璃微電極的尖端與單個(gè)細(xì)胞膜接觸，以觀測(cè)細(xì)胞膜離子通道的微小電流。然而 在測(cè)定某種神經(jīng)細(xì)胞膜離子通道電流時(shí)尚存在一些技術(shù)上的難題。首先，在體外培養(yǎng)的細(xì) 胞群體中并非每個(gè)細(xì)胞都具備活性，具備空間上的隨機(jī)性，從數(shù)以百萬計(jì)的體外培養(yǎng)細(xì)胞 群體中選擇可能發(fā)生膜電流變化的某個(gè)細(xì)胞以用來觀察十分困難；其次，即使選中作為觀 察對(duì)象的這個(gè)細(xì)胞具備產(chǎn)生離子通道電流的能力，這種電流改變往往是瞬時(shí)發(fā)生和消失 的，具備時(shí)間上的隨機(jī)性，如何捕獲這種瞬時(shí)的電流在觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)的選擇上更是難上加難； 另外，即使觀測(cè)時(shí)該細(xì)胞發(fā)生了離子通道電流改變，在電流程度非常微弱的情況下很難捕 捉到信號(hào)。因此，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能作出準(zhǔn)確的評(píng)估，需要另辟蹊徑，尋求新的評(píng)估方法。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種不受神經(jīng)細(xì)胞功能 活動(dòng)隨機(jī)性影響的神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)或信息傳遞功能的評(píng)估方法。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案一如下一種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定性評(píng)估方法，該方法由以下步驟組成先分別制備含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠，再分別 進(jìn)行磁共振功能成像，然后將二者的磁共振圖像進(jìn)行對(duì)照，如果含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝 膠的磁共振圖像較含未造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的磁共振圖像增強(qiáng)，則表明這種神經(jīng)細(xì)胞 具有傳遞信息的功能；其中，所述的含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的制備方法由以下步驟組成(1)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10 %的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng) 細(xì)胞接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增 至神經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、C02濃度為5%的條件下 培養(yǎng)24小時(shí)后，往所述的培養(yǎng)瓶中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/L的NGF誘導(dǎo)5天； (2)加入NGF誘導(dǎo)5天后，往培養(yǎng)瓶中加入氯化錳，使其在所述含血清培養(yǎng)基 中濃度為0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度為 ΙΟμπιοΙ/L 并作用 24h ； (3)然后傾倒去除培養(yǎng)基，加入DPBS緩沖液沖洗3遍，再加入ImL濃度為2. 5g/L 胰酶的水溶液消化神經(jīng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞回縮后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng) 基終止消化，然后移至試管中，離心分離，去除上清液；接著，加入DPBS緩沖液重懸后移至 另一試管中離心分離，去除上清液后再加入DPBS緩沖液重懸并移至一新的試管中，離心分 離，去除上清液，如此重復(fù)3次之后，于40°C下加入濃度為60g/L 80g/L的瓊脂糖凝膠水 溶液重懸至神經(jīng)細(xì)胞濃度為1 X IO6個(gè)/mL迅速插入冰浴凝固；所述的含未造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的制備方法是，依次執(zhí)行所述的含造影的神 經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的制備方法的步驟(1)和步驟(3)即可。本發(fā)明所述的定性評(píng)估方法，其中所述的含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的制備方法 的步驟(2)中所述的氯化錳和谷氨酸是分別用去離子水溶解后再加入培養(yǎng)瓶中的。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案二如下一種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定量評(píng)估方法，該方法由以下步驟組成先分別制備含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水 重懸液，再分別置于超聲破碎儀中，超聲作用5s，停5s，持續(xù)5min破碎細(xì)胞膜后，使用等離 子體質(zhì)譜儀分別檢測(cè)含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水 重懸液中的錳含量，然后計(jì)算出二者錳含量的比值，此值越大則表明這種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信 息的功能越強(qiáng)；其中，所述的含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液的制備方法由以下步驟組成(I)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10 %的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng) 細(xì)胞接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增 至神經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、C02濃度為5%的條件下 培養(yǎng)24小時(shí)后，往所述的培養(yǎng)瓶中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/L的NGF誘 導(dǎo)5天；(II)加入NGF誘導(dǎo)5天后，往培養(yǎng)瓶中加入氯化錳，使其在所述含血清培養(yǎng)基 中濃度為0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度為 lOymol/L 并作用24h ；(III)然后傾倒去除培養(yǎng)基，加入DPBS緩沖液沖洗3遍，再加入ImL濃度為2. 5g/ L胰酶的水溶液消化神經(jīng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞回縮后加入含10 %的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng) 基終止消化，然后移至試管中，離心分離，去除上清液；接著，加入DPBS緩沖液重懸后移至 另一試管中離心分離，去除上清液后再加入DPBS緩沖液重懸并移至一新的試管中，離心分 離，去除上清液，如此重復(fù)3次之后，加入去離子水重懸至神經(jīng)細(xì)胞濃度為1 X IO6個(gè)/mL ；所述的含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液的制備方法是，依次執(zhí)行所述的含造 影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液的制備方法的步驟(I)和步驟(III)即可。本發(fā)明所述的定量評(píng)估方法，其中所述的含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液的制
5備方法的步驟(II)中所述的氯化錳和谷氨酸都是先用去離子水溶解后再加入培養(yǎng)瓶中 的。本發(fā)明所述的兩種評(píng)估方法，其中，所述的定性評(píng)估方法是將神經(jīng)細(xì)胞擴(kuò)增、誘導(dǎo) 后加入氯化錳和谷氨酸，使神經(jīng)細(xì)胞在谷氨酸的下刺激而開放鈣離子通道，讓含氯化錳溶 液中的錳離子進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，冰浴凝固后進(jìn)行磁共振圖像，并將所得到的圖像與未加造 影劑的神經(jīng)細(xì)胞的磁共振圖像進(jìn)行對(duì)照，如果圖像得到增強(qiáng)便說明這種具有傳遞信息的功 能，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定且直觀。所述的定量評(píng)估方法是將神經(jīng)細(xì)胞擴(kuò)增、誘導(dǎo)后加入氯化錳和谷 氨酸，使神經(jīng)細(xì)胞在谷氨酸的下刺激而開放鈣離子通道，讓含氯化錳溶液中的錳離子進(jìn)入 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，然后再超聲破碎細(xì)胞膜，使用等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)錳含量，并將所測(cè)得的錳含 量與未加造影劑的神經(jīng)細(xì)胞的錳含量進(jìn)行比較，當(dāng)二者錳含量的差值越大則表明這種神經(jīng) 細(xì)胞傳遞信息的功能越強(qiáng)，不僅可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能進(jìn)行數(shù)字化定量評(píng)估，而且結(jié) 果穩(wěn)定、精確。


圖1為在相差顯微鏡下觀察到的經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)圖。圖2為在熒光顯微鏡下觀察到的經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的免疫組化染色圖。圖3為不同濃度氯化錳造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的磁共振成像，按照左右上下順 序分別為空白凝膠、無錳干預(yù)神經(jīng)元、0. 05mmol/L氯化錳標(biāo)記、0. lmmol/L氯化錳標(biāo)記、 0. 2mmol/L氯化錳標(biāo)記、0. lmmol/L氯化錳復(fù)管、0. 5mmol/L氯化錳標(biāo)記、0. 5mmol/L氯化錳 標(biāo)記復(fù)管。
具體實(shí)施例方式神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞株是目前廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞功能研究的 一種具有代表性的神經(jīng)細(xì)胞模型，因此下述實(shí)施例均使用NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。例 1PC12細(xì)胞株培養(yǎng)及誘導(dǎo)鑒定1、材料(1)PC12細(xì)胞株購自廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫；(2)試劑NGF及細(xì)胞鑒定所用抗體均購自美國Sigma公司；2、步驟(1)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng)細(xì)胞 接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增至 神經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至96孔培養(yǎng)板中，在溫度為37°C、CO2濃度為5%的條 件下培養(yǎng)24小時(shí)后，往所述的96孔培養(yǎng)板中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/ L的NGF誘導(dǎo)5天。(2)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察加入NGF誘導(dǎo)5天后，將上述96孔培養(yǎng)板置于相差顯微鏡下觀察，其結(jié)果如圖1
6所示，PC12細(xì)胞的折光性良好，具備細(xì)胞突起，說明其生長(zhǎng)狀態(tài)良好。(3)鑒定PC12細(xì)胞誘導(dǎo)效果采用免疫組化染色神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原微管相關(guān)蛋白2(MAP_2)的方法來鑒定 PC12細(xì)胞的誘導(dǎo)結(jié)果。觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，在上述96孔培養(yǎng)板中加入PBS沖洗2 次；將多聚甲醛溶于PBS，制備成多聚甲醛濃度為40g/L的PBS溶液，將此PBS溶液加入到 所述96孔培養(yǎng)板中固定細(xì)胞30min ；加入PBS沖洗3次，每次5min ；將Triton X-100溶于 PBS,制備Triton X-100濃度為3g/L的PBS溶液，將此PBS溶液加入所述96孔培養(yǎng)板中， 在溫度為37°C條件下處理30min ；加入PBS沖洗3次，每次5min ；將正常山羊血清溶于PBS， 制備成正常山羊血清的體積濃度為10%的PBS溶液，將此PBS溶液加入所述96孔培養(yǎng)板 中，在溫度為37°C條件下封閉15min ；將所述96孔培養(yǎng)板中的正常山羊血清溶液吸出；將 MAP-2 一抗用抗體稀釋液稀釋100倍，加入所述96孔培養(yǎng)板中；將該96孔培養(yǎng)板置于濕盒 中，在溫度為4°C條件下過夜，然后在溫度為37°C條件下放置2h ；加入PBS沖洗3次，每次 5min ；將綠色熒光二抗488用抗體稀釋液稀釋100倍，然后加入所述96孔培養(yǎng)板中；將該 96孔培養(yǎng)板置于濕盒中，在溫度為37°C下避光孵育60min ；將上述含綠色熒光二抗488的 抗體稀釋液吸出；將帶藍(lán)色熒光的Hochest33342溶于抗體稀釋液，然后加入所述96孔培養(yǎng) 板中；將該96孔培養(yǎng)板置于濕盒中，在溫度為37°C下避光孵育IOmin ；加入PBS沖洗3次， 每次5min ；然后將96孔培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下觀察。3、結(jié)果鑒定PC12細(xì)胞誘導(dǎo)效果將步驟(3)所得的在熒光顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果如圖2所示。圖中可見經(jīng)過步驟 (1)培養(yǎng)和誘導(dǎo)后，PC12細(xì)胞可以被Hochest33342抗體染上藍(lán)色熒光，同時(shí)可以被MAP-2 抗體染上綠色熒光。說明誘導(dǎo)后的PC12細(xì)胞可以表達(dá)神經(jīng)元特異性的MAP-2抗原，誘導(dǎo)后 的PC12細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞。例 2氯化錳安全應(yīng)用濃度范圍的測(cè)定1、材料(1)PC12細(xì)胞株購自廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫；(2)試劑=MnCl2, NGF均購自美國sigma公司；2、步驟(1)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng)細(xì)胞 接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增至神 經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至96孔培養(yǎng)板上，接種30孔。在溫度為37°C、C02濃度為 5%的條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，往所述的96孔培養(yǎng)板中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為 10 μ g/L的NGF誘導(dǎo)5天。(2)上述96孔培養(yǎng)板上接種了細(xì)胞的有30孔，每6孔分為一組，共5組。其中 4組添加氯化錳和谷氨酸，另1組不添加氯化錳和谷氨酸作為對(duì)照。首先向該4組的孔中 分別添加不同量的去離子水溶解的氯化錳，使氯化錳在4組含血清培養(yǎng)基中濃度分別為 0. 05mmol/L、0. Immol/L、0. 2mmol/L、0. 5mmol/L，然后向該4組含血清培養(yǎng)基中分別加入谷
7氨酸，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度均為ΙΟμπιοΙ/L，作用24h ；(3)MTT法檢測(cè)不同濃度氯化錳對(duì)PC12細(xì)胞存活的影響將上述96孔培養(yǎng)板中的所述含血清培養(yǎng)基除去，每孔加入新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基 200 μ L ；將MTT溶于PBS，制備成MTT濃度為5mg/mL的溶液，將該P(yáng)BS溶液加入所述96孔 培養(yǎng)板中，每孔添加20 μ L，在溫度為37°C條件下培養(yǎng)4h ；吸去96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)上清液； 加入二甲基亞砜(DMSO)，每孔加150 μ L，振蕩IOmin至反應(yīng)產(chǎn)生的晶體完全溶解；將96孔 培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度，記錄結(jié)果。(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將記錄結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組均數(shù)的 比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、結(jié)果不同濃度氯化錳對(duì)PC12細(xì)胞存活影響將步驟(4)所得的不同濃度氯化錳干預(yù)的PC12細(xì)胞存活量用MTT法檢測(cè)的統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)記錄于下述表1中。由表中數(shù)據(jù)可看出方差齊性檢驗(yàn)顯示對(duì)照組及4個(gè)濃度錳標(biāo)記組 細(xì)胞存活測(cè)定方差齊性(Levene statistic = 0. 169，P = 0. 952)，5組細(xì)胞存活量差異具有 顯著性(F = 11. 693，P = O. 000)，應(yīng)用LSD法兩兩比較顯示0. 05mmol/L、0. lmmol/L錳標(biāo)記 組與對(duì)照組比較細(xì)胞存活量無明顯差異(Pab = 0. 363 ；Pac = 0. 793),0. 2mmol/L、0. 5mmol/L 氯化錳標(biāo)記組與對(duì)照組比較細(xì)胞存活量差異具有顯著性(Pad = 0. 000 ；Pae = 0. 000)，說明 占含血清培養(yǎng)基的濃度為0. lmmol/L以下的氯化錳適合于進(jìn)行PC12細(xì)胞功能測(cè)定。表 1不同濃度氯化錳干預(yù)的PC12細(xì)胞存活用MTT法檢測(cè)的結(jié)果
分組 對(duì)照組0.05mmol/L 0. lmmol/L 0.2mmol/L 0.5mmol/LMnCI2 組 MnCI2 組 MnCI2 組 MnCI2 組
MTT 0.754±0.106a 0.698土 0.101b 0.770±0.116c 0.492±0.102d 0.466±0.097e例 3PC12細(xì)胞功能的定性評(píng)估1、材料(1)PC12細(xì)胞株購自廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫；(2)試劑=MnCl2, NGF均購自美國sigma公司；(3)儀器磁共振儀(Philips, 3. 0T，荷蘭)；2、步驟(1)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng)細(xì)胞 接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增至神 經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至25cm2培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、CO2濃度為5 %的條件 下培養(yǎng)24小時(shí)后，往所述的培養(yǎng)瓶中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/L的NGF誘導(dǎo)5天。(2)再重復(fù)步驟(1)6次，共制備7個(gè)培養(yǎng)瓶的PC12細(xì)胞。其中6瓶添加氯化錳 和谷氨酸，另1瓶不添加氯化錳和谷氨酸作為對(duì)照。首先向該6個(gè)培養(yǎng)瓶中分別添加不同 量的去離子水溶解的氯化錳，使氯化錳在該6個(gè)培養(yǎng)瓶所述含血清培養(yǎng)基中濃度分別為 0. 05mmol/L>0. Immol/L>0. 2mmol/L>0. Immol/L>0. 5mmol/L>0. 5mmol/L,然后向該 6 個(gè)培養(yǎng) 瓶所述含血清培養(yǎng)基中分別加入谷氨酸，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度均為10 μ mol/L, 作用24h ；(3)將上述7個(gè)培養(yǎng)瓶PC12細(xì)胞分別進(jìn)行以下處理制備成7試管神經(jīng)細(xì)胞冷凍 凝膠傾倒去除培養(yǎng)基，加入DPBS緩沖液沖洗3遍，再加入ImL濃度為2. 5g/L胰酶的水溶 液消化神經(jīng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞回縮后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化， 然后移至0. 5cm直徑的試管中，離心分離，去除上清液；接著，加入DPBS緩沖液重懸后移至 另一試管中離心分離，去除上清液后再加入DPBS緩沖液重懸并移至一新的試管中，離心分 離，去除上清液，如此重復(fù)3次之后，于40°C下加入濃度為70g/L的瓊脂糖凝膠水溶液重懸 至神經(jīng)細(xì)胞濃度為1 X IO6個(gè)/mL迅速插入冰浴凝固(在40°C下重懸細(xì)胞時(shí)，因60g/L以下 的凝膠水溶液難以迅速在冰浴中凝固，而80g/L以上的凝膠水溶液過于粘稠，難以完成吹 打重懸細(xì)胞的操作，所以60g/L 80g/L的凝膠水溶液最合適)。(4)另取0. 5cm直徑的試管，于40°C下加入濃度為70g/L的瓊脂糖凝膠水溶液，迅 速插入冰浴凝固以制備不含神經(jīng)細(xì)胞的凝膠對(duì)照；(5)將步驟(3)所獲的7管神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠及步驟(4)所獲的不含神經(jīng)細(xì)胞的 冷凍凝膠送磁共振檢測(cè)，獲取Tl加權(quán)序列圖像。磁共振檢測(cè)的具體參數(shù)為重復(fù)時(shí)間(TR) 330ms，回波時(shí)間(TE) 16. 6ms，matrix size :512X512，視野(FOV) :6X6cm2，層厚1· 5mm。3、氯化錳及谷氨酸干預(yù)的PC12細(xì)胞磁共振成像步驟(5)所得的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的磁共振成像如圖3所示。圖中可見，將占含 血清培養(yǎng)基的濃度為0. Immol/L、0. 2mmol/L及0. 5mmol/L的氯化錳處理的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝 膠與未經(jīng)氯化錳處理的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠比較，氯化錳處理的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠磁共振信 號(hào)強(qiáng)度明顯增高，而且隨標(biāo)記錳濃度增高，磁共振Tl加權(quán)序列信號(hào)強(qiáng)度增加，說明PC12神 經(jīng)細(xì)胞具有傳遞信息的功能。例 4細(xì)胞功能的定量評(píng)估1、材料(1)PC12細(xì)胞株購自廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫；(2)試劑=MnCl2、鹽酸維拉帕米、NGF均購自美國sigma公司；(3)儀器電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(X SERIES 2，ThermoFischer, Bremen，德 國)；2、步驟一、PC12細(xì)胞功能的定量評(píng)估(1)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng)細(xì)胞 接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增至神
9經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至25cm2培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、CO2濃度為5 %的條件 下培養(yǎng)24小時(shí)后，往所述的培養(yǎng)瓶中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/L的NGF 誘導(dǎo)5天。(2)重復(fù)步驟⑴1次，得到兩瓶PC12細(xì)胞，將2個(gè)培養(yǎng)瓶分別標(biāo)記為Al和A2。(3)往標(biāo)記有Al的培養(yǎng)瓶中先加入去離子水溶解的氯化錳，使氯化錳在該培養(yǎng)瓶 所述含血清培養(yǎng)基中濃度為0. lmmol/L，再加入谷氨酸，使谷氨酸在所述含血清培養(yǎng)基中濃 度為10 μ mol/L并作用24h ；將標(biāo)記有A2的培養(yǎng)瓶放置24h ；(4)將標(biāo)記有Al和A2的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞分別進(jìn)行下述處理，并將所得去離子水重 懸的試管分別標(biāo)記為A' 1和A' 2:傾倒去除培養(yǎng)基，加入DPBS緩沖液沖洗3遍，再加入 ImL濃度為2. 5g/L胰酶的水溶液消化神經(jīng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞回縮后加入含10%的胎牛血清 的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，然后移至試管中，離心分離，去除上清液；接著，加入DPBS緩 沖液重懸后移至另一試管中離心分離，去除上清液后再加入DPBS緩沖液重懸并移至一新 的試管中，離心分離，去除上清液，如此重復(fù)3次之后，加入去離子水重懸至神經(jīng)細(xì)胞濃度 為 1 X IO6 個(gè) /mL ；(5)將標(biāo)記有A' 1和A' 2的兩試管分別置于超聲破碎儀中，超聲作用5s，停5s， 持續(xù)5min破碎細(xì)胞膜后，使用等離子體質(zhì)譜儀分別檢測(cè)兩試管內(nèi)去離子水重懸液中的錳 含量，然后計(jì)算出二者錳含量的比值，并記錄于下述表2中。二、功能抑制的PC12細(xì)胞功能的定量評(píng)估(1)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng)細(xì)胞 接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增至神 經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至25cm2培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、CO2濃度為5 %的條件 下培養(yǎng)24小時(shí)后，往所述的培養(yǎng)瓶中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/L的NGF 誘導(dǎo)5天。(2)重復(fù)步驟(1) 1次，得到兩瓶PC12細(xì)胞，將2個(gè)培養(yǎng)瓶分別標(biāo)記為Bl和B2。維拉帕米處理的PC12細(xì)胞樣本制備及處理再重復(fù)步驟(1) 2次，制備2個(gè)培養(yǎng)瓶 的PC12細(xì)胞，將2個(gè)培養(yǎng)瓶分別標(biāo)記為B1、B2瓶。首先在這2個(gè)培養(yǎng)瓶中添加鹽酸維拉帕 米，使鹽酸維拉帕米在培養(yǎng)瓶所述含血清培養(yǎng)基中濃度為30 μ mol/L以制備維拉帕米處理 的PC12細(xì)胞。然后應(yīng)用與步驟(2)相同的方法和劑量給予氯化錳和谷氨酸；加藥完成后作 用 24h;(3)首先分別往標(biāo)記有Bl和B2的兩培養(yǎng)瓶中添加鹽酸維拉帕米，使鹽酸維拉帕米 在培養(yǎng)瓶所述含血清培養(yǎng)基中濃度為30 μ mol/L ；然后，往標(biāo)記有Bl的培養(yǎng)瓶中先加入去 離子水溶解的氯化錳，使氯化錳在該培養(yǎng)瓶所述含血清培養(yǎng)基中濃度為0. lmmol/L，再加入 谷氨酸，使谷氨酸在所述含血清培養(yǎng)基中濃度為10 μ mol/L并作用24h ；將標(biāo)記有B2的培 養(yǎng)瓶放置24h ；(4)將標(biāo)記有Bl和B2的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞分別進(jìn)行下述處理，并將所得去離子水重 懸的試管分別標(biāo)記為B' 1和B' 2:傾倒去除培養(yǎng)基，加入DPBS緩沖液沖洗3遍，再加入 ImL濃度為2. 5g/L胰酶的水溶液消化神經(jīng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞回縮后加入含10%的胎牛血清 的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，然后移至試管中，離心分離，去除上清液；接著，加入DPBS緩
10沖液重懸后移至另一試管中離心分離，去除上清液后再加入DPBS緩沖液重懸并移至一新 的試管中，離心分離，去除上清液，如此重復(fù)3次之后，加入去離子水重懸至神經(jīng)細(xì)胞濃度 為 1 X IO6 個(gè) /mL ；(5)將標(biāo)記有B' 1和B' 2的兩試管分別置于超聲破碎儀中，超聲作用5s，停5s， 持續(xù)5min破碎細(xì)胞膜后，使用等離子體質(zhì)譜儀分別檢測(cè)兩試管內(nèi)去離子水重懸液中的錳 含量，然后計(jì)算出二者錳含量的比值，并記錄于下述表2中。三、評(píng)估結(jié)果的比較與分析鹽酸維拉帕米是本領(lǐng)域公認(rèn)的一種細(xì)胞鈣通道阻滯劑，因此，本例中采用維拉帕 米對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行功能抑制后再按本發(fā)明所述定量評(píng)估方法進(jìn)行錳含量的測(cè)定，以期說 明細(xì)胞內(nèi)的錳含量與神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的強(qiáng)弱正相關(guān)。由表2可見，添加過錳標(biāo)記的A' 1管中PC12細(xì)胞較未添加過錳標(biāo)記的A' 2管 中PC12細(xì)胞內(nèi)錳含量高，說明正常PC12細(xì)胞有傳遞信息功能。添加過錳標(biāo)記的B' 1管中 PC12細(xì)胞較未添加過錳標(biāo)記的B' 2管中PC12細(xì)胞內(nèi)錳含量高，說明經(jīng)過鹽酸維拉帕米處 理的PC12細(xì)胞也有傳遞信息功能。但是，A' l/k' 2的值是B' 1/B' 2值的六倍，該結(jié) 果既說明過鹽酸維拉帕米對(duì)PC12細(xì)胞傳遞信息功能有明顯抑制作用，也說明本發(fā)明所述 的定量評(píng)估方法可用于神經(jīng)細(xì)胞功能的定量評(píng)估。表2評(píng)估結(jié)果的比較
分組Α·1 管 Α’2 管 Α’1/Α·2 B'l 管 B’2 管 B’l/B’2
錳含量 120ppm IOppm 1220ppm IOppm 權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定性評(píng)估方法，該方法由以下步驟組成先分別制備含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠，再分別進(jìn)行 磁共振功能成像，然后將二者的磁共振圖像進(jìn)行對(duì)照，如果含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的 磁共振圖像較含未造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的磁共振圖像增強(qiáng)，則表明該神經(jīng)細(xì)胞具有傳 遞信息的功能；其中，所述的含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的制備方法由以下步驟組成(1)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng)細(xì)胞 接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為371^0)2,1度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增至神 經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、C02濃度為5%的條件下培養(yǎng) 24小時(shí)后，往所述的培養(yǎng)瓶中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10μ g/L的NGF誘導(dǎo)5 天；(2)加入NGF誘導(dǎo)5天后，往培養(yǎng)瓶中加入氯化錳，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度為 0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度為10 μ mol/L并 作用24h ；(3)然后傾倒去除培養(yǎng)基，加入DPBS緩沖液沖洗3遍，再加入ImL濃度為2.5g/L胰酶 的水溶液消化神經(jīng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞回縮后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終 止消化，然后移至試管中，離心分離，去除上清液；接著，加入DPBS緩沖液重懸后移至另一 試管中離心分離，去除上清液后再加入DPBS緩沖液重懸并移至一新的試管中，離心分離， 去除上清液，如此重復(fù)3次之后，于40°C下加入濃度為60g/L 80g/L的瓊脂糖凝膠水溶液 重懸至神經(jīng)細(xì)胞濃度為1 X IO6個(gè)/mL迅速插入冰浴凝固；所述的含未造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的制備方法是，依次執(zhí)行所述的含造影的神經(jīng)細(xì) 胞冷凍凝膠的制備方法的步驟(1)和步驟(3)即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定性評(píng)估方法，其特征在于， 所述的氯化錳和谷氨酸是分別用去離子水溶解，再加入培養(yǎng)瓶中。
3.—種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定量評(píng)估方法，該方法由以下步驟組成先分別制備含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸 液，再分別置于超聲破碎儀中，超聲作用5s，停5s，持續(xù)5min破碎細(xì)胞膜后，使用等離子體 質(zhì)譜儀分別檢測(cè)含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸 液中的錳含量，然后計(jì)算出二者錳含量的比值，此值越大則表明該神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息的功 能越強(qiáng)；其中，所述的含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液的制備方法由以下步驟組成(I)先往DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，得到含血清培養(yǎng)基，再將神經(jīng)細(xì)胞 接入所述含血清培養(yǎng)基中，然后置于溫度為37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增至神 經(jīng)細(xì)胞濃度為3 X IO5個(gè)/mL后移至培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、C02濃度為5%的條件下培養(yǎng) 24小時(shí)后，往所述的培養(yǎng)瓶中加入在所述含血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/L的NGF誘導(dǎo)5 天；(II)加入NGF誘導(dǎo)5天后，往培養(yǎng)瓶中加入氯化錳，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度為 0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培養(yǎng)基中濃度為10 μ mol/L并 作用24h ；(III)然后傾倒去除培養(yǎng)基，加入DPBS緩沖液沖洗3遍，再加入ImL濃度為2. 5g/L胰酶 的水溶液消化神經(jīng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞回縮后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終 止消化，然后移至試管中，離心分離，去除上清液；接著，加入DPBS緩沖液重懸后移至另一 試管中離心分離，去除上清液后再加入DPBS緩沖液重懸并移至一新的試管中，離心分離， 去除上清液，如此重復(fù)3次之后，加入去離子水重懸至神經(jīng)細(xì)胞濃度為1 X IO6個(gè)/mL ；所述的含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液的制備方法是，依次執(zhí)行所述的含造影的 神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液的制備方法的步驟(I)和步驟(III)即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定量評(píng)估方法，其特征在于， 所述的氯化錳和谷氨酸是分別用去離子水溶解，再加入培養(yǎng)瓶中。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息功能的定性和定量評(píng)估方法，其中，所述的定性評(píng)估方法是，先分別制備含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠，再分別進(jìn)行磁共振功能成像，然后將二者的磁共振圖像進(jìn)行對(duì)照，如果含造影的神經(jīng)細(xì)胞冷凍凝膠的磁共振圖像增強(qiáng)，則表明該神經(jīng)細(xì)胞具有傳遞信息的功能；所述的定量評(píng)估方法是，先分別制備含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液，再分別置于超聲破碎儀中破碎細(xì)胞膜后，使用等離子體質(zhì)譜儀分別檢測(cè)含造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液和含未造影的神經(jīng)細(xì)胞去離子水重懸液中的錳含量，然后計(jì)算出二者錳含量的比值，此值越大則表明該神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息的功能越強(qiáng)。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102004114SQ201010274158
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者姜曉丹, 張潤(rùn), 張鵬, 李鵬, 法志強(qiáng), 王志娟 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)