本發(fā)明涉及一種骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法，屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)是成熟血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，是Asahara等在1997年首次證明造血系統(tǒng)中存在的具有新生血管潛能的細胞。由于在前期的大量研究中，內(nèi)皮祖細胞在在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，可以有效促進缺血心肌內(nèi)血管形成，改善肢體缺血，對損傷后血管內(nèi)皮進行修復(fù)，因此有關(guān)EPC的分離、純化、擴增及其功能和應(yīng)用的研究越來越受到關(guān)注。然而體內(nèi)存在的內(nèi)皮祖細胞數(shù)量極少，在骨髓中僅為0.1％，目前獲得和擴增EPC的方法操作過程復(fù)雜，細胞得率低，價格較為昂貴，極大地限制了其在研究和臨床應(yīng)用方面的發(fā)展，因此，本領(lǐng)域急需一種高效的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法，以獲得骨髓中穩(wěn)定來源的內(nèi)皮祖細胞來滿足進一步實驗研究和臨床應(yīng)用的需求。

在內(nèi)皮祖細胞分離提取的過程中，目前的技術(shù)手段主要是骨髓經(jīng)過密度梯度分離，接種于纖維粘連蛋白(fibronectin)鋪層的培養(yǎng)皿，或者利用磁珠分選或流式細胞儀分選的方式，利用一些細胞表面粘附分子如CD34、KDR、CD133等進行分選后，獲得細胞再利用上述培養(yǎng)液進行培養(yǎng)擴增。然而由于血小板表面表達的粘附分子能夠被單核細胞吞噬假表達于某些不能向內(nèi)皮細胞分化的單核細胞上，從而使利用這些粘附分子進行分選的細胞不能向內(nèi)皮細胞分化，而通過淋巴細胞密度梯度分離的方法也過于復(fù)雜，成本相對較高。

在內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的選擇十分重要，目前的培養(yǎng)基有以下幾種：

M199+10％FBS+VEGF+bFGF+CSF；

DMEM+20％FBS+bFGF；

DMEM-HG+10％FBS+VEGF+bFGF；

DMEM+CSF+FGF+10％FBS；

1640培養(yǎng)基+bFGF+VEGF+10％FBS；

EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF；

但是這幾種培養(yǎng)基分別有各自的缺陷，例如基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇的不合理、血清比例不合適、刺激因子的選擇及加入比例的不恰當(dāng)，這些缺陷導(dǎo)致內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)時狀態(tài)差，獲得細胞量少，傳代次數(shù)低，復(fù)蘇后細胞活率低等特點。因此，在科學(xué)研究及臨床應(yīng)用中，急需一種高效穩(wěn)定的培養(yǎng)基提高內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)過程中傳代代次偏低、培養(yǎng)成本偏高、培養(yǎng)效率低的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)方法，所采取的技術(shù)方案如下：

一種骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法，該方法是將已提取的骨髓用紅細胞裂解液進行處理后分離獲得骨髓單個核細胞，清洗后將所得的骨髓單個核細胞接種到預(yù)包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中利用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，利用胰蛋白酶消化細胞后，接種到培養(yǎng)瓶中進行差速貼壁培養(yǎng)和差速消化培養(yǎng)；

所述完全培養(yǎng)基，是在無血清培養(yǎng)基EGM2中添加胎牛血清、血管內(nèi)皮生長因子、糖皮質(zhì)激素、維生素C、上表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子，集落刺激因子和血小板源性生長因子后制成。

優(yōu)選地，所述完全培養(yǎng)基是在無血清培養(yǎng)基中添加10％(V/V)胎牛血清FBS，8～12ng/mL血管內(nèi)皮生長因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮質(zhì)激素，1‰(V/V)維生素C，1‰(V/V)上表皮生長因子EGF，5ng/mL堿性成纖維細胞成長因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子CSF，1‰(V/V)血小板源性生長因子PDGF。

所述內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法的步驟如下：

1)在無菌條件下提取小鼠股骨后，利用緩沖溶液將骨髓沖洗下來，獲得骨髓原液；

2)按照體積比為骨髓原液：紅細胞裂解液＝1:5的比例向步驟1)所得的骨髓原液中加入紅細胞裂解液進行處理，處理后獲得骨髓單個核細胞溶液；

3)利用緩沖溶液清洗步驟2)所得骨髓單個核細胞溶液三次后，再將所得骨髓單個核細胞接種到預(yù)包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)皿中利用完全培養(yǎng)基進行37℃恒溫培養(yǎng)；

4)待細胞增長至1×10⁶/孔時，用胰蛋白酶消化細胞，重新接種至25cm的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；

5)將步驟3)所得的細胞進行差速貼壁培養(yǎng)和差速消化培養(yǎng)。

優(yōu)選地，步驟3)骨髓單個核細胞接種的密度是5×10⁵/孔；所述培養(yǎng)皿的直徑為60mm。

優(yōu)選地，步驟3)所述完全培養(yǎng)基是在無血清培養(yǎng)基中添加10％(V/V)胎牛血清FBS，10ng/mL血管內(nèi)皮生長因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮質(zhì)激素，1‰(V/V)維生素C，1‰(V/V)上表皮生長因子EGF，5ng/mL堿性成纖維細胞成長因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子CSF，1‰(V/V)血小板源性生長因子PDGF。

優(yōu)選地，接種在培養(yǎng)皿后的骨髓單個核細胞在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞密度為1×10⁶/孔后，用胰蛋白酶消化細胞，重新接種至25cm的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

更優(yōu)選地，所述胰蛋白酶的濃度為0.25％，消化時間為3min。

所述方法的具體步驟如下：

1)將小鼠麻醉后，在無菌條件下取小鼠股骨，利用磷酸鹽緩沖溶液將骨髓沖洗下來，獲得骨髓原液；

2)按照體積比為骨髓原液：紅細胞裂解液＝1:5的比例加入紅細胞裂解液，室溫靜置5min后，在1000rpm下離心5min后棄掉上清液獲得骨髓單個核細胞；

3)利用磷酸鹽緩沖溶液清洗步驟2)所得骨髓單個核細胞溶液三次后，再將所得骨髓單個核細胞按照5×10⁵/孔的接種密度接種到預(yù)包被纖維連接蛋白的完全培養(yǎng)皿中在37℃下進行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞單個核細胞密度為1×10⁶/孔后，在每個孔中加入1ml的0.25％胰酶消化處理3min，獲得胰酶消化細胞；

4)將步驟3)所得的胰酶消化后的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進行差速貼壁培養(yǎng)和差速消化培養(yǎng)。

以上所述任一方法可在制備治療心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤等疾病和創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明獲得的有益效果：

本發(fā)明所提供的方法可以簡單快速低成本的分離出骨髓中的單個核細胞而不影響內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)效率，使用新型完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后的內(nèi)皮祖細胞從細胞數(shù)量、細胞活率、細胞傳代代次，凍存細胞復(fù)蘇后的活率上都有顯著提高。本發(fā)明降低了內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)成本，極大程度上提高了內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)效率，解決了獲得和擴增EPC的方法操作過程復(fù)雜，細胞得率低，價格較為昂貴的問題。

本發(fā)明為解決獲取骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)效率較低、成本較高、內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法低效不穩(wěn)定等技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種能夠高效穩(wěn)定培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞的完全培養(yǎng)基及細胞獲取方法。本發(fā)明在從小鼠骨髓中分離單個核細胞時采取了紅細胞裂解法而非傳統(tǒng)的淋巴細胞分離法，該方法操作步驟較簡單、花費時間短，一次分離較多數(shù)量的單個核細胞。在內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方面，本發(fā)明提供了新的培養(yǎng)基配方，使培養(yǎng)效率顯著提高，細胞數(shù)量及活性增強，傳代代次提高。

紅細胞裂解液為一種比較溫和的紅細胞去除試劑，主要是用來裂解組織或提取液中的紅細胞。發(fā)明人在研究過程中偶然發(fā)現(xiàn)利用紅細胞裂解液提取骨髓組織中骨髓單個核細胞在提取效果上比并不弱于現(xiàn)有常用的淋巴細胞分離液，但卻可以大大減少實驗成本上以及操作時間。采用紅細胞裂解液進行提取只需一步離心即可，不需要提取白膜層細胞，對細胞的損傷非常小。

同時，發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)經(jīng)將血小板源性生長因子PDGF添加培養(yǎng)基中能夠有效提高骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞的傳代代次。而在本申請之前，血小板源性生長因子PDGF不是用于培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞的細胞細胞培養(yǎng)因子。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞P10代培養(yǎng)效果圖。

圖2為P5代細胞在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的細胞數(shù)量的對比圖；

(a，為現(xiàn)有公認效果最好的EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF培養(yǎng)基；b，為本發(fā)明所用培養(yǎng)基)。

圖3為P5代細胞在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下內(nèi)皮祖細胞表達CD34含量對比圖；

(a，為現(xiàn)有公認效果最好的EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF；b，為本發(fā)明所用培養(yǎng)基)。

圖4為P5代細胞在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下內(nèi)皮祖細胞表達VEGF-2含量對比圖；

(a，為現(xiàn)有公認效果最好的EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF；b，為本發(fā)明所用培養(yǎng)基)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。

以下實施例所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可通過商業(yè)渠道獲得。

實施例1

1.完全培養(yǎng)基的配置

完全培養(yǎng)基是在血清培養(yǎng)基EGM2中加入：10％(V/V)胎牛血清(FBS)，10ng/mL血管內(nèi)皮生長因子VEGF，0.4‰(V/V)糖皮質(zhì)激素，1‰(V/V)維生素C，1‰(V/V)上表皮生長因素EGF，5ng/mL堿性成纖維細胞生長因子bFGF，2ng/mL集落刺激因子(CSF)，1‰(V/V)血小板源性生長因子PDGF。

2.小鼠骨髓單個核細胞的分離與培養(yǎng)

將實驗動物用10％水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉。無菌條件下取小鼠股骨，使用PBS迅速將骨髓完全沖洗到離心管中，吹打均勻后按照1∶5比例緩慢加入紅細胞裂解液。在1000rpm下離心5min后分離得到骨髓單個核細胞。用PBS洗3次后將單個核細胞以5×10⁵/孔的密度，接種于預(yù)包被纖維連接蛋白的6孔培養(yǎng)皿中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞增長至約1×10⁶/孔時，用胰蛋白酶消化細胞，重新接種至25cm²培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

3.內(nèi)皮祖細胞的差速貼壁培養(yǎng)

培養(yǎng)24h后，輕輕沖洗整個培養(yǎng)皿，將未貼壁細胞重新接種于另一塊預(yù)包被纖維連接蛋白的6孔板中。3天后換液，棄去未貼壁細胞，以后每兩天換液。待集落廣泛形成后進行消化，傳代。每天觀察細胞的形態(tài)。

4.差速消化培養(yǎng)

準備好待消化的細胞，棄去培養(yǎng)液。用PBS洗一遍后，加入0.25％胰蛋白酶，輕輕震蕩，3min后終止消化，更換新的培養(yǎng)液。

經(jīng)觀察，培養(yǎng)獲得的細胞可傳10代，且傳過10代的細胞數(shù)量較多(見圖1)。

實施例2

本實施例提供了一種骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法，該方法與實施例1的區(qū)別在于：所用培養(yǎng)基中的組成為：EGM2+5％FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF。具體是在EGM2培養(yǎng)基中添加5％(v/v)胎牛血清FBS、10ng/mL的Hydrocortisone(即糖皮質(zhì)激素)、0.4‰(V/V)的Ascorbic Acid、2‰的EGF、2ng/mL的VEGF、5ng/mL的IGF、1‰(V/V)的FGF。利用該培養(yǎng)方法培養(yǎng)，所得內(nèi)皮祖細胞共傳6代，6代后細胞狀態(tài)較差，細胞生長十分緩慢。

實施例3

本實施例提供了一種骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法，該方法與實施例1的區(qū)別在于：所用培養(yǎng)基中沒有添加集落刺激因子CSF。利用該培養(yǎng)方法培養(yǎng)，所得內(nèi)皮祖細胞共傳6代代，6代后細胞狀態(tài)較差，傳代速度緩慢，漂浮死細胞較多。

實施例4

本實施例提供了一種骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法，該方法與實施例1的區(qū)別在于：沒有使用1‰(V/V)血小板源性生長因子PDGF。利用該培養(yǎng)方法培養(yǎng)，所得的內(nèi)皮祖細胞共傳代7代。

實施例5

本實施例提供了一種骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)方法，該方法與實施例1的區(qū)別在于：

使用常規(guī)的淋巴細胞分離液代替紅細胞裂解液進行骨髓單個核細胞的分離，具體操作過程是：

(1)將ACD抗凝骨髓液用0.01mol/LPBS液等體積稀釋、混勻。

(2)取10ml無菌的離心管，加入比重為1.077mol/ml的淋巴細胞分離液3～4ml，將稀釋后的骨髓在離液面約1cm處緩慢滴加，使形成一明顯分界面，上下液面勿混合。

(3)在水平離心機中以2000轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速，離心40分鐘。

(4)小心吸取中間的白膜層，用7～10倍體積的0.01mol/L PBS液稀釋，1000轉(zhuǎn)/min，離心10分鐘，洗滌2～3次。

經(jīng)統(tǒng)計，用淋巴細胞分離液提取耗時2小時左右，而使用紅細胞裂解液耗時僅需30min，操作時間減少75％以上。同時，在提取薄膜曾細胞及分離室對細胞的損失較大，且淋巴細胞分離液價格要遠比紅細胞裂解液昂貴，試驗成本更高。

雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。