從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫細(xì)胞，在臨床應(yīng)用過程中，常見的問題是很難保證提供足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞。目前主要是利用低溫凍存技術(shù)保存免疫細(xì)胞，在需要時(shí)復(fù)蘇并誘導(dǎo)培養(yǎng)為各種免疫細(xì)胞。但在分離、凍存過程中，會(huì)對(duì)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，甚至毒性，尤其是凍存過程中會(huì)顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，同時(shí)伴隨生物性損傷的危險(xiǎn)。
[0003]另一方面，骨髓中含有較多的脂肪，影響分離效果，不能獲得足夠的免疫細(xì)胞，再加上凍存過程中對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損傷，使免疫細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率不高。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率通常在70%-90%之間。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率可能會(huì)受到細(xì)胞采集、分離、凍存等過程的影響。因此，為提供足夠量的淋巴細(xì)胞，現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率仍需進(jìn)一步提高，同時(shí)也應(yīng)避免回輸給患者時(shí)出現(xiàn)惡心、嘔吐或過敏等不良反應(yīng)，提高安全性?，F(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)的FicolI 400分離液對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，不利于臨床應(yīng)用。
[0004]因此，有必要提供一種能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率、提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性的提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率、提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性的從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，提供一種從骨髓中提取免疫細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0008]I)采集人骨髓，用含15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液5倍稀釋，400g，5min離心，棄上清及脂肪層，獲骨髓細(xì)胞；
[0009]2)將外周血移入離心管中，750g，10min離心，吸取上層血漿備用，下層細(xì)胞用于分離外周血淋巴細(xì)胞;所述骨髓細(xì)胞中加入含15%上述上層血漿的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；
[0010]3)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和泛影酸鈉的分離液加入到離心管中；
[0011]4)將所述細(xì)胞懸液平鋪到所述離心液上，在8-25°(3，50(^-80(^，10?301^11條件下離心，吸取白膜層細(xì)胞獲得免疫細(xì)胞；
[0012]5)將所述免疫細(xì)胞等體積加入到凍存液中混勻，分裝于細(xì)胞凍存管中，將所述細(xì)胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于_80°C冷凍，然后轉(zhuǎn)入液氮中凍存。
[0013]本發(fā)明可以使用外周血的自體血漿用于骨髓免疫細(xì)胞的分離、凍存，外周血的下層細(xì)胞也可以用來分離淋巴細(xì)胞用于提高患者免疫力;本發(fā)明從預(yù)處理到分離再到凍存均選用符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)的原料，原料不確定性小，安全性高;本發(fā)明使用外周血的上層血漿用于骨髓細(xì)胞的懸浮液制備，并作為凍存液的一部分，有效減少回輸過程的免疫排斥反應(yīng);本發(fā)明的分離液對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行離心處理后，免疫細(xì)胞在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶;本發(fā)明采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品；海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于免疫細(xì)胞的分離;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)有助于免疫細(xì)胞的分咼。
[0014]進(jìn)一步地，所述步驟5)中凍存液的配方為10%DMS0+5%右旋糖酐+5%海藻糖+18%所述上層血漿+62%注射用生理鹽水的混合溶液。
[0015]進(jìn)一步地，所述步驟2)細(xì)胞懸液的濃度為I?6X 16細(xì)胞/ml。
[0016]進(jìn)一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐3?5重量份，海藻糖2?4重量份，超低粘度海藻酸鈉0.3?0.8重量份，泛影葡胺I?3重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.1?0.15重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0017]本發(fā)明采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品;海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于免疫細(xì)胞的分離；聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)有助于免疫細(xì)胞的分離;本發(fā)明的分離液中的各組分配比合理從而起到良好的分離效果。
[0018]進(jìn)一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐3.5?4.5重量份，海藻糖2.5?3.5重量份，超低粘度海藻酸鈉0.4?0.8重量份，泛影葡胺1.5?2.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.12?0.15重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0019]優(yōu)選地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸鈉0.7重量份，泛影葡胺2重量份和聚二烯丙基二甲基氯化銨0.13重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0020]進(jìn)一步地，所述分離液的密度為1.070?1.09(^/0113，滲透壓為275?300811101/1^，pH為6?9，粘度為3.0?5.0cp。
[0021 ] 進(jìn)一步地，所述右旋糖酐為Dextran70。
[0022]綜上所述，本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為:
[0023]本發(fā)明可以使用外周血的自體血漿用于骨髓免疫細(xì)胞的分離、凍存，外周血的下層細(xì)胞也可以用來分離淋巴細(xì)胞用于提高患者免疫力;本發(fā)明從預(yù)處理到分離再到凍存均選用符合靜注級(jí)原料藥標(biāo)準(zhǔn)的原料，原料不確定性小，安全性高;本發(fā)明使用外周血的上層血漿用于骨髓細(xì)胞的懸浮液制備，并作為凍存液的一部分，有效減少回輸過程的免疫排斥反應(yīng);本發(fā)明的分離液對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行離心處理后，免疫細(xì)胞在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶;本發(fā)明采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品；海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個(gè)葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于免疫細(xì)胞的分離;聚二烯丙基二甲基氯化銨為強(qiáng)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)有助于免疫細(xì)胞的分離。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為使本發(fā)明的實(shí)施例要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。但本發(fā)明絕非限于這些例子。以下所述僅為本發(fā)明較好的實(shí)施例，僅僅用以解釋本發(fā)明，并不能因此而理解為本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所