本發(fā)明涉及生物細(xì)胞領(lǐng)域，涉及一種克隆細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞克隆是生物繁殖一種類(lèi)型，無(wú)性繁殖。是一種把單個(gè)細(xì)胞從群體內(nèi)分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。克隆能夠保持親本的絕大部分性狀。生物體通過(guò)無(wú)性繁殖所生成的群體或個(gè)體稱(chēng)為克隆體，由動(dòng)物體內(nèi)一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)性生殖過(guò)程進(jìn)而發(fā)育形成的動(dòng)物個(gè)體為克隆動(dòng)物?？寺〖?xì)胞的培養(yǎng)至關(guān)重要，因此需要研究一種新的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種解決或部分解決上述問(wèn)題的一種克隆細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

為達(dá)到上述技術(shù)方案的效果，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種克隆細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包含以下步驟：

取48份克隆細(xì)胞用ELISA試劑盒檢測(cè)p27抗原，將其中p27抗原檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性提取出來(lái)，從p27抗原檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的克隆細(xì)胞隨機(jī)抽選6份，并且1500rpm離心5分鐘，接著接于長(zhǎng)成60％單層CEF的24孔板中，培養(yǎng)8d后將細(xì)胞傳入含飛片的六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)3d，無(wú)菌取出六孔板中的飛片，用固定液固定，所述固定液為丙酮與已醇以3：2的比例混合，并且加入青霉素100ul/ml、鏈霉素80ul/ml進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益成果是：本發(fā)明通過(guò)科學(xué)的方法對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，首先對(duì)樣本進(jìn)行抽樣，采用隨機(jī)抽取的方式從其中抽取p27抗原檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的克隆細(xì)胞，嚴(yán)格地指定步驟，具有科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膬?yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明，能實(shí)現(xiàn)同樣功能的產(chǎn)品屬于等同替換和改進(jìn)，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。具體方法如下：

實(shí)施例1：體外培養(yǎng)的生物成分無(wú)外乎兩種結(jié)構(gòu)形式：其一是小塊組織或稱(chēng)為組織塊(tissue block)，一般稱(chēng)為外植塊；其二是將生物組織分散后制成的單個(gè)細(xì)胞，一般稱(chēng)為分離的細(xì)胞(isolated cell)或者分散的細(xì)胞(dissociated cell)。

分散的過(guò)程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進(jìn)行，分散的細(xì)胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中。單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱(chēng)為細(xì)胞懸液(cell suspension)。

狹義的細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)主要是指分離(散)細(xì)胞培養(yǎng)，廣義的細(xì)胞培養(yǎng)的概念還包括單(個(gè))細(xì)胞培養(yǎng)(single cell culture)。一種是群體培養(yǎng)(mass culture)，將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合(confluence)后形成均勻的單細(xì)胞層；另一種是克隆培養(yǎng)(clonal culture)，將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱(chēng)為克隆(clone)。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來(lái)源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。

現(xiàn)今，用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基本有3類(lèi)，即原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株及傳代細(xì)胞系。經(jīng)過(guò)幾十年的研究和發(fā)展，目前我國(guó)已經(jīng)擁有了可以進(jìn)行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的動(dòng)物原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和Vero細(xì)胞等生產(chǎn)技術(shù)，用于生產(chǎn)多種人用、動(dòng)物疫苗。其中二倍體細(xì)胞(如我國(guó)70年代建立的人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB17和2BS)對(duì)多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細(xì)胞時(shí)在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險(xiǎn)，是當(dāng)前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細(xì)胞基質(zhì)。Vero細(xì)胞是1962年由日本Chiba大學(xué)的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴(lài)性成纖維細(xì)胞，核型為2n 60，高倍體率約為1.7％，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)，不含任何污染因子。通常使用199培養(yǎng)基添加5％胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。該細(xì)胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準(zhǔn)廣泛用于人用、動(dòng)物用疫苗生產(chǎn)。

實(shí)施例2：

體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后，細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程都會(huì)受一定的影響。另外，很多細(xì)胞在體外的生存也不是無(wú)限的，存在著一個(gè)發(fā)展過(guò)程。所有這一切，使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn)。

(一)培養(yǎng)細(xì)胞生命期(Life Span of Culture Cells):所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維待一年左右的生存時(shí)間，最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短；如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞,如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類(lèi)和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過(guò)程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：

1、原代培養(yǎng)(Primary Culture)期：也稱(chēng)初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的(Heterogeneous)，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。

2、傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細(xì)胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱(chēng)二倍體細(xì)胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。

3、衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。

在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)(多發(fā)生在傳代末或衰退期)，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontaneous Transformation)。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細(xì)胞永生性也稱(chēng)不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱(chēng)無(wú)限細(xì)胞系(Infinite CellLine)，也稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系(Continuous Cell Line)。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。

(二)組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下，細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對(duì)要快(實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比稀少時(shí)要快)。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì)縮短傳代時(shí)間。

所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世(Generation)或倍增〔Doubling〕不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。

以上所述僅為本發(fā)明之較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍。同時(shí)以上說(shuō)明，對(duì)于相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)可以理解及實(shí)施，因此其他基于本發(fā)明所揭示內(nèi)容所完成的等同改變，均應(yīng)包含在本權(quán)利要求書(shū)的涵蓋范圍內(nèi)。

本發(fā)明的有益成果是：本發(fā)明通過(guò)科學(xué)的方法對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，首先對(duì)樣本進(jìn)行抽樣，采用隨機(jī)抽取的方式從其中抽取p27抗原檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的克隆細(xì)胞，嚴(yán)格地指定步驟，具有科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膬?yōu)點(diǎn)。