本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種HPV分型檢測(cè)的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒。

背景技術(shù)：

宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，已有研究表明，高危型人乳頭瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)持續(xù)感染及多重感染是導(dǎo)致宮頸癌變的重要原因之一，全球范圍的研究結(jié)果顯示，在99.7％的宮頸癌患者體內(nèi)檢測(cè)到高危型HPV DNA的存在。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HPV有200多種型別，主要包括低危型和高危型兩大類。其中，HPV 16、HPV 18兩種亞型是臨床最常見的該兩類型病毒在宮頸癌患者出現(xiàn)的概率最大。不同型別與不同疾病的相關(guān)性也不一樣，低危型HPV感染可能會(huì)引起生殖道濕疣病變，高危型HPV感染則與宮頸癌、陰道癌相關(guān)。

目前，還缺乏針對(duì)HPV公認(rèn)的有效治療手段，因此宮頸HPV早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防是阻斷癌變的關(guān)鍵，但是，現(xiàn)有的針對(duì)HPV分型檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)(包括傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光定量檢測(cè)技術(shù)、TCT技術(shù)、HC2檢測(cè)技術(shù)等)存在操作方法繁瑣，靈敏度或特異性低等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種HPV分型檢測(cè)的核酸組合，該核酸組合能夠常見的HPV 16和HPV 18兩種亞型病毒進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、操作便捷、耗時(shí)短等特點(diǎn)。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合在制備用于HPV分型檢測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒含有上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合，其能夠?qū)ΤＲ姷腍PV 16和HPV 18兩種亞型病毒進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、操作便捷、耗時(shí)短等特點(diǎn)。

本發(fā)明的第四目的在于提供上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合在HPV分型檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種HPV分型檢測(cè)的核酸組合，其包括用于檢測(cè)HPV 16亞型的第一核酸組合和/或用于檢測(cè)HPV 18亞型的第二核酸組合；

第一核酸組合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物對(duì)和SEQ ID NO.3所示的第一捕獲探針，第一引物對(duì)的上游引物的5’端或下游引物的5’端標(biāo)記有用于結(jié)合第一催化酶的第一親和物；

第二核酸組合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物對(duì)和SEQ ID NO.6所示的第二捕獲探針，第二引物對(duì)的上游引物的5’端或下游引物的5’端標(biāo)記有用于結(jié)合第二催化酶的第二親和物。

上述的的HPV分型檢測(cè)的核酸組合在制備用于HPV分型檢測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用。

一種試劑盒，其包括上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合。

上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合在HPV分型檢測(cè)中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒的有益效果是：

本發(fā)明的提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合包括用于檢測(cè)HPV 16亞型的第一核酸組合和/或用于檢測(cè)HPV 18亞型的第二核酸組合。第一核酸組合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物對(duì)，用于進(jìn)行PCR反應(yīng)，將樣本中的微量的靶核酸片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的靶核酸片段，大大地增加了在后續(xù)EFIRM技術(shù)平臺(tái)上的待測(cè)模板的數(shù)量，進(jìn)而大大地提高了檢測(cè)靈敏度。再將PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物(含靶核酸片段)用到EFIRM技術(shù)平臺(tái)上，通過第一捕獲探針與靶核酸片段的雜交、進(jìn)行特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)HPV 16亞型目的。用于檢測(cè)HPV 18亞型的第二引物對(duì)和第二捕獲探針的檢測(cè)原理和效果同第一引物對(duì)和第一捕獲探針。

由于雜交效率受錯(cuò)配堿基的影響明顯，只有靶核酸片段與兩條引物、捕獲探針同時(shí)準(zhǔn)確配對(duì)后才能有檢測(cè)信號(hào)，即需要兩次特異性識(shí)別結(jié)合(而現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)通常只有一次特異性識(shí)別)，這大大提高了檢測(cè)的特異性。所以，本發(fā)明的提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合通過特異性的引物和捕獲探針的設(shè)計(jì)，結(jié)合PCR技術(shù)的擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)和EFIRM技術(shù)的特異性捕獲特點(diǎn)，提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，且具有操作便捷、耗時(shí)短等特點(diǎn)，其為檢測(cè)HPV基因分析檢測(cè)和制備相關(guān)檢測(cè)試劑盒提供了一種新的思路和策略，還具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例5中的16亞型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例5中的18亞型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5中的檢測(cè)三份樣本的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的HPV分型檢測(cè)的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒，進(jìn)行具體說明。

一方面，本發(fā)明提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合，其包括：用于檢測(cè)HPV16亞型的第一核酸組合和用于檢測(cè)HPV 18亞型的第二核酸組合。

其中，第一核酸組合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物對(duì)(SEQ ID NO.1為上游引物，SEQ ID NO.2為下游引物)和SEQ ID NO.3所示的第一捕獲探針。第一引物對(duì)的上游引物的5’端或下游引物的5’端標(biāo)記有用于結(jié)合第一催化酶的第一親和物。

需要說明的是，第一引物對(duì)和第一捕獲探針均根據(jù)HPV 16亞型基因的保守區(qū)域E7區(qū)(不同亞型的HPV的E7區(qū)差異較大)進(jìn)行設(shè)計(jì)，第一捕獲探針的堿基序列選自于第一引物對(duì)所擴(kuò)增的區(qū)域，確保了第一捕獲探針能夠與第一引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。第一引物對(duì)和第一捕獲探針配套使用。

進(jìn)一步地，另外，第二核酸組合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物對(duì)(SEQ ID NO.4為上游引物，SEQ ID NO.5為下游引物)和SEQ ID NO.6所示的第二捕獲探針。第二引物對(duì)的上游引物的5’端或下游引物的5’端標(biāo)記有用于結(jié)合第二催化酶的第二親和物。

需要說明的是，第二引物對(duì)和第二捕獲探針均根據(jù)HPV 18亞型基因的保守區(qū)域E7區(qū)進(jìn)行設(shè)計(jì)，第二捕獲探針的堿基序列選自于第二引物對(duì)所擴(kuò)增的區(qū)域，確保了第二捕獲探針能夠與第二引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。第二引物對(duì)和第二捕獲探針配套使用。

還需要說明的是，在其他的實(shí)施例中，本發(fā)明提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合可以僅包括第一核酸組合或第二核酸組合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)HPV 16或HPV 18的分型檢測(cè)。

進(jìn)一步地，第一親和物為地高辛、異硫氰酸熒光素和生物素中的一種；第二親和物為地高辛、異硫氰酸熒光素和生物素中的一種。需要說明的是，第一親和物和第二親和物的類別可以相同，也可以不同。

生物素的作用在于與鏈霉親和素標(biāo)記的催化酶結(jié)合，地高辛可與地高辛抗體標(biāo)記的催化酶結(jié)合，異硫氰酸熒光素可與異硫氰酸熒光素抗體標(biāo)記的催化酶結(jié)合。在EFIRM技術(shù)平臺(tái)上，再通過催化酶催化底物產(chǎn)生的電流釋放檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。

優(yōu)選地，第一引物對(duì)的下游引物的5’端和第二引物對(duì)的下游引物的5’端均標(biāo)記生物素。

本發(fā)明提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合檢測(cè)HPV基因型的原理如下。

使用EFRIM與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法檢測(cè)樣本中的HPV16、HPV 18亞型病毒。根據(jù)HPV 16或HPV 18亞型基因(E7區(qū))各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(第一引物對(duì)和第二引物對(duì))和一條捕獲探針(第一捕獲探針和第二捕獲探針)。其中，每個(gè)引物對(duì)中的一條引物的5’端使用生物素(用地高辛或異硫氰酸熒光素也可以)修飾，且生物素修飾的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生的擴(kuò)增鏈即靶核酸片段上有部分區(qū)域與配套的捕獲探針反向互補(bǔ)。通過結(jié)合EFIRM技術(shù)，靶核酸片段被捕獲探針捕獲，然后加入經(jīng)親和素(與引物5’端的修飾標(biāo)記對(duì)應(yīng))修飾的催化酶，催化酶通過生物素-親和素系統(tǒng)結(jié)合到靶核酸片段上，然后加入催化酶的底物，進(jìn)行催化反應(yīng)，產(chǎn)生電流信號(hào)，在EFIRM精準(zhǔn)基因檢測(cè)儀上檢測(cè)出電流信號(hào)，根據(jù)電流信后的大小判斷待測(cè)樣本中的HPV的具體亞型即可。

其中，EFIRM的基本原理是利用超高靈敏度電化學(xué)檢測(cè)方法特異捕獲病毒基因片段，結(jié)合PCR擴(kuò)增的樣本前處理過程，可以以更高靈敏度檢測(cè)樣本中的病毒DNA信息。該檢測(cè)方法使用的材料由核酸純化試劑、PCR擴(kuò)增試劑，96孔E-plate和雜交檢測(cè)試劑組成，雜交檢測(cè)試劑包括捕獲探針反應(yīng)試劑、樣本雜交液、報(bào)告試劑、顯色溶液、和洗滌溶液等試劑組成。檢測(cè)時(shí)配合普通PCR儀和EFIRM精準(zhǔn)基因檢測(cè)儀完成。

再一方面，本發(fā)明提供了上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合在制備用于HPV分型檢測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用。該試劑盒包括上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合。需要說明的是，核酸組合中的第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第一捕獲探針和第二捕獲探針可獨(dú)立地以粉狀形式存在，也可是以溶液的形式存在，或者其它形式存在，均可根據(jù)實(shí)際情況選擇。

另一方面，本發(fā)明提供的一種試劑盒，其包括上述的HPV分型檢測(cè)的核酸組合。需要說明的是，核酸組合中的第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第一捕獲探針和第二捕獲探針可獨(dú)立地以粉狀形式存在，也可是以溶液的形式存在，或者其它形式存在，均可根據(jù)實(shí)際情況選擇。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還包括將上述的捕獲探針(第一捕獲探針或第二捕獲探針)固定至檢測(cè)孔板的固定物。固定物包括導(dǎo)電聚合物和離子化合物。導(dǎo)電聚合物選自吡咯、苯胺和噻吩中的一種，當(dāng)然，導(dǎo)電聚合物也可以是其他的導(dǎo)電聚合物材料。離子化合物選自氯化鈉和氯化鉀中的任意一種。導(dǎo)電聚合物帶正電，其在電場(chǎng)的作用下形成網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，被沉積在反應(yīng)孔的底部，網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定地將捕獲探針固定在底部，有助于提高捕獲探針的穩(wěn)定性和捕獲能力。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還包括催化酶，催化酶是帶有標(biāo)記物的辣根過氧化物酶，優(yōu)選地，催化酶是帶有鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶。標(biāo)記物用于與所述第一親和物或所述第二親和物結(jié)合。

當(dāng)然，催化酶也可以是帶有標(biāo)記物的堿性磷酸酶，標(biāo)記物為地高辛抗體、異硫氰酸熒光素抗體或鏈霉親和素中的任意一種，標(biāo)記物與親和物相對(duì)應(yīng)，其可根據(jù)引物上的親和物的類別進(jìn)行選擇。

當(dāng)親和物是生物素時(shí)，標(biāo)記物為鏈霉親和素；當(dāng)親和物是地高辛?xí)r，標(biāo)記物為地高辛抗體；當(dāng)親和物是異硫氰酸熒光素時(shí)，標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素抗體。只要親和物與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)，可相互結(jié)合即可。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還包括底物，底物的類別根據(jù)催化酶的類別選擇。

當(dāng)催化酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基聯(lián)苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)和OPD(o-Phenylenediamine、鄰苯二胺)中的任意一種。TMB、ABTS和OPD均是辣根過氧化物酶的底物，在辣根過氧化物酶的催化作用下發(fā)生顯色反應(yīng)并伴隨電流產(chǎn)生，有助于提高檢測(cè)信號(hào)的釋放。

當(dāng)催化酶為堿性磷酸酶時(shí)，底物是對(duì)BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽)和NBT(Nitrotetrazolium Blue chloride、四唑硝基藍(lán))的組合物、硝基苯磷酸鹽、4-硝基苯磷酸二鈉、萘酚AS-BI磷酸鹽、萘酚-AS-MX-磷酸鹽中的任意一種。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還包括清洗液，清洗液包括洗液A和洗液B，洗液A是含SDS的SSC緩沖液，洗液B是含Tween20的PBS緩沖液。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺中的一種或多種。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括檢測(cè)孔板，檢測(cè)孔板的反應(yīng)孔內(nèi)固定有上述捕獲探針。需要說明的是，在其他的實(shí)施例中，捕獲探針也可不用固定在檢測(cè)孔板的反應(yīng)孔內(nèi)，在使用時(shí)采用相應(yīng)方法將捕獲探針固定至檢測(cè)孔板也是可以的。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合包括用于檢測(cè)HPV 16亞型的第一核酸組合和用于檢測(cè)HPV 18亞型的第二核酸組合。。

其中，第一核酸組合包括第一引物對(duì)和第一捕獲探針。

第一引物對(duì)包括：

上游引物，其堿基序列為：5’-GAGCCCATTACAATATTGTA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物，其5’端帶有生物素標(biāo)記，堿基序列為：Biotin-5’-GTCTTCCAAAGTACGAATGTCTACGTGTGTGCT-3’(SEQ ID NO.2)。

第一捕獲探針的堿基序列為：

5’-CGCTTCGGTTGTGCGTACAA-3’(SEQ ID NO.3)

第一捕獲探針與第一引物對(duì)所擴(kuò)增出的第一靶核酸片段(SEQ ID NO.7)的互補(bǔ)鏈靶區(qū)域(5’-TTGTACGCACAACCGAAGCG-3’)反向互補(bǔ)。

另外，第二核酸組合包括第二引物對(duì)和第二捕獲探針。

第二引物對(duì)包括：

上游引物，其堿基序列為：5’-AACATTTACCAGCCCGACGA-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物，其5’端帶有生物素(Biotin)標(biāo)記，其堿基序列為：

Biotin-5’-GGAACTGTCTGCTGAGCTTTCTACTACTAGCTCAATTCT-3’(SEQ ID NO.5)。

第二捕獲探針的堿基序列為：

5’-TGTGTTGTAAGTGTGAAGCC-3’(SEQ ID NO.6)。

第二捕獲探針與第二引物對(duì)所擴(kuò)增出的第二靶核酸片段(SEQ ID NO.8)的靶區(qū)域(5’-GGCTTCACACTTACAACACA-3’)反向互補(bǔ)。

本實(shí)施例提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合可用于檢測(cè)出待測(cè)樣本的HPV 16和HPV 18兩種亞型的病毒。其具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等特點(diǎn)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了試劑盒，該試劑盒包括上述實(shí)施例1提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合。

本實(shí)施例提供的試劑盒可用于檢測(cè)出待測(cè)樣本的HPV 16和HPV 18兩種亞型的病毒。其具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等特點(diǎn)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了試劑盒，該試劑盒包括上述實(shí)施例1提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合，此外，還包括：PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺溶液。

本實(shí)施例提供的試劑盒可用于檢測(cè)出待測(cè)樣本的HPV 16和HPV 18兩種亞型的病毒。其具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等特點(diǎn)。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了試劑盒，該試劑盒包括上述實(shí)施例1提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合，此外，還包括：PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺溶液、鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC緩沖液以及含Tween20的PBS緩沖液、吡咯溶液、氯化鉀溶液、雜交buffer。

本實(shí)施例提供的試劑盒可用于檢測(cè)出待測(cè)樣本的HPV 16和HPV 18兩種亞型的病毒。其具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等特點(diǎn)。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了采用實(shí)施例1提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合檢測(cè)待測(cè)樣本中HPV亞型的具體方法，步驟如下。

1核酸提?。菏褂檬惺鄣牟《綝NA提取試劑盒提取來自3個(gè)不同個(gè)體的HPV宮頸拭子樣本，按說明書的步驟進(jìn)行核酸提取，分別得到樣本1、樣本2和樣本3的核酸模板。

2 PCR擴(kuò)增

用實(shí)施例1提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合中的第一引物對(duì)和第二引物對(duì)分別擴(kuò)增樣本1、樣本2和樣本3。

2.1 PCR反應(yīng)體系(25μl)按表1中所列成分和用量進(jìn)行配制，同時(shí)用含有第一靶核酸片段的16亞型質(zhì)粒(質(zhì)粒名稱IG16100-2pGSI-16-500，大小3351bp,抗性為Amp，為高拷貝載體。其由含有第一靶核酸片段的基因片段正向克隆于pGSI載體的SmaI位點(diǎn)得到，如圖1所示)和含有第二靶核酸片段的18亞型質(zhì)粒(質(zhì)粒名稱IG16100-4pGSI-18-500，大小3351bp,抗性為Amp，為高拷貝載體。其由含有第二靶核酸片段的基因片段正向克隆于pGSI載體的SmaI位點(diǎn)得到，結(jié)構(gòu)如圖2所示)作為陽性對(duì)照。

表1.PCR反應(yīng)體系的配制表

2.2將配制好的反應(yīng)體系渦旋震蕩混勻，離心，在PCR儀器(伯樂PCR儀T100)上擴(kuò)增，擴(kuò)增程序見表2。

表2.PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序

將得到的各樣本對(duì)應(yīng)第一引物對(duì)和第二引物對(duì)的PCR產(chǎn)物立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或4℃暫存。

3捕獲探針(CP)固定

3.1配制吡咯(pyrrole)與捕獲探針的混合液：取1個(gè)1.5mL離心管，依次加入超純水885μl，100μl 3M KCl，渦旋震蕩混勻，離心；加入5μl pyrrole，渦旋震蕩混勻，離心；加入10μl 100μM CP(第一捕獲探針或第二捕獲探針)；渦旋震蕩混勻后離心，分別得到第一捕獲探針的混合液和第二捕獲探針的混合液，備用。

3.2固定捕獲探針

在6孔的檢測(cè)孔板(E-plate，其結(jié)構(gòu)和工作原理可見參考文獻(xiàn)201620769829.2)上，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)置2個(gè)檢測(cè)組，分別是16亞型組和18亞型組，每個(gè)檢測(cè)組設(shè)置5個(gè)反應(yīng)孔，其中一個(gè)反應(yīng)孔作為陰性對(duì)照孔(重復(fù)4次)，一個(gè)作為陽性對(duì)照孔，另三個(gè)分別作為樣本1、樣本2和樣本3的檢測(cè)孔。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)孔加入30μl的已配制好的pyrrole與捕獲探針的混合液。16亞型組加入第一捕獲探針的混合液，18亞型組加入第二捕獲探針的混合液。

3.3 EFIRM電場(chǎng)處理

在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：350mV，1s；電壓B:950mV，1s；進(jìn)行9個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。

3.4 E-plate板清洗

在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行下一步，樣本上樣操作。其中，洗液A為含0.05％(質(zhì)量百分比)SDS的2×SSC緩沖液。

4 PCR產(chǎn)物雜交

4.1雜交buffer預(yù)處理

取雜交buffer(購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，)平衡至室溫。

4.2 PCR產(chǎn)物預(yù)處理

將由本實(shí)施例步驟2.2得到各PCR產(chǎn)物分別與雜交buffer按體積比1:10混合，渦旋振蕩后離心，得到PCR產(chǎn)物預(yù)處理混合液。

4.3加樣

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在E-plate上，在各檢測(cè)組的反應(yīng)孔里加入30μl的PCR產(chǎn)物預(yù)處理混合液。具體如下。

16亞型組：樣本1、樣本2和樣本3的檢測(cè)孔加入相應(yīng)的由第一引物對(duì)擴(kuò)增樣本1、樣本2和樣本3得到的PCR產(chǎn)物預(yù)處理混合液，陽性對(duì)照孔中加入由第一引物對(duì)擴(kuò)增16亞型質(zhì)粒得到的PCR產(chǎn)物預(yù)處理混合液，陰性對(duì)照孔僅加入雜交buffer。

18亞型組：樣本1、樣本2和樣本3的檢測(cè)孔加入相應(yīng)的由第二引物對(duì)擴(kuò)增樣本1、樣本2和樣本3得到的PCR產(chǎn)物預(yù)處理混合液，陽性對(duì)照孔中加入由第二引物對(duì)擴(kuò)增18亞型質(zhì)粒得到的PCR產(chǎn)物預(yù)處理混合液，陰性對(duì)照孔僅加入雜交buffer。

加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。

4.4 EFIRM電場(chǎng)處理

在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：300mV，1s；電壓B:500mV，1s；進(jìn)行150個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。

4.5室溫孵育

蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。

4.6 E-plate板清洗

在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。

5鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Poly-HRP)與生物素結(jié)合

5.1 Poly-HRP溶液配制

從4℃冰箱取出稀釋液(含酪蛋白的PBS緩沖液)，取1個(gè)1.5mL離心管，加入999μl的稀釋液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，濃度為0.5mg/ml，購(gòu)自thermo fisher,產(chǎn)品名稱為Pierce^TM Streptavidin Poly-HRP，貨號(hào)為21140，單位規(guī)格為0.5mL)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。

5.2加酶液

在對(duì)應(yīng)的各孔加入上述稀釋液和酶液混合后的混合液30μl，Poly-HRP通過其標(biāo)記的鏈霉親和素與PCR產(chǎn)物上的生物素識(shí)別并結(jié)合。

5.3室溫孵育

蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺(tái)上室溫孵育15min。

5.4 E-plate板清洗

在洗板機(jī)程序上選擇對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，清洗液選擇洗液B。清洗完畢，立刻進(jìn)行TMB加樣操作。其中，洗液B為含0.1％(質(zhì)量百分比)Tween20的PBS緩沖液。

6數(shù)據(jù)讀取

6.1加底物

在對(duì)應(yīng)的各孔加入底物60μl，加樣時(shí)槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進(jìn)行電場(chǎng)操作。其中，底物為含TMB的溶液(購(gòu)自thermo fisher，產(chǎn)品貨號(hào)為34028，名稱為1-Step^TM Ultra TMB-ELISA)。加入酶的底物，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流，檢測(cè)各孔內(nèi)電流值即完成整個(gè)檢測(cè)過程。

6.2 EFIRM電場(chǎng)讀數(shù)

在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對(duì)應(yīng)列，電場(chǎng)參數(shù)設(shè)置為：電壓A：-200mV，60s；電壓B:0mV，0s；進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。電場(chǎng)處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。

儀器將自動(dòng)完成檢測(cè)工作，檢測(cè)數(shù)據(jù)自動(dòng)上傳到云計(jì)算平臺(tái)。根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，橫坐標(biāo)為檢測(cè)組的類別，縱坐標(biāo)為各檢測(cè)組中各檢測(cè)孔的電流值(Current)，單位為納安(-nA)，“-”代表電流方向。本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果如表3和圖3所示。

6.3結(jié)果說明

以陰性對(duì)照孔重復(fù)4次的電流平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差的和作為陽性判定值，陽性判定值＝AVG+3×SD，其中AVG為陰性對(duì)照孔重復(fù)4次的電流平均值，SD為陰性對(duì)照孔重復(fù)4次的標(biāo)準(zhǔn)差。若加入有待測(cè)樣本的檢測(cè)孔的電流值大于或等于該陽性判定值，則判定位陽性結(jié)果，說明待測(cè)樣本中含有相應(yīng)的HPV亞型病毒。反之，則為陰性。

表3.采用實(shí)施例1提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合檢測(cè)三份樣本的檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)可知，樣本1的16亞型檢測(cè)結(jié)果呈陽性，樣本2和樣本3均呈陰性，說明樣本1含有HPV16亞型病毒(陰性對(duì)照電流值為33.29nA、其標(biāo)準(zhǔn)差為2.53，陽性對(duì)照電流值為619.30nA，樣本1的電流值為546.55nA，樣本2的電流值為34.03nA，樣本2的電流值為29.16nA)；樣本2的18亞型檢測(cè)結(jié)果呈陽性，樣本1和樣本3的18亞型檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，說明樣本2含有HPV18亞型病毒(陰性對(duì)照電流值為30.34nA、其標(biāo)準(zhǔn)差為2.85，陽性對(duì)照電流值為485.59nA，樣本1的電流值為39.41nA，樣本2的電流值為776.03nA，樣本2的電流值為31.17nA)。

由此說明，實(shí)施例1提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)待測(cè)樣本中的HPV的分型檢測(cè)，能夠檢測(cè)出樣本中的HPV 16亞型和HPV 18亞型兩種亞型病毒。

綜上，本發(fā)明提供的HPV分型檢測(cè)的核酸組合具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)檢測(cè)靈敏度高

PCR是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性—低溫退火—延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的特定目的基因片段。大大增加了EFIRM待測(cè)模板的數(shù)量，提高了檢測(cè)靈敏度。

傳統(tǒng)的探針固定方法是把探針的一端固定在平面支持物上，此方法由于探針表面的疏水性等原因會(huì)降低探針與待測(cè)靶標(biāo)DNA的雜交效率。而本發(fā)明通過電荷吸附作用將捕獲探針固定在聚吡咯孔內(nèi)，可保證捕獲探針具有超高活性；傳統(tǒng)的核酸雜交過程通過控制雜交溫度、鹽離子、反應(yīng)時(shí)間等提高雜交效率，本發(fā)明增加電場(chǎng)作為第四個(gè)控制條件，在電場(chǎng)的作用下提高了捕獲探針對(duì)靶標(biāo)DNA的捕獲效率；本發(fā)明中通過測(cè)定HRP催化TMB氧化過程中產(chǎn)生的電子信號(hào)作為檢測(cè)結(jié)果，由于酶的催化效率很高，間接地放大了雜交反應(yīng)的結(jié)果，增加了測(cè)定方法的敏感度。瞬間靶標(biāo)分子捕獲、超高活性分子探針固定、捕獲分子信號(hào)特異放大這三大核心技術(shù)保證了EFIRM方法具有超高的靈敏性。EFIRM與PCR技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，其靈敏度遠(yuǎn)高于巴氏涂片、TCT技術(shù)和HC2等技術(shù)，與聚合酶鏈反應(yīng)和基因芯片等技術(shù)相當(dāng)。

(2)檢測(cè)特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為上下游引物與模板DNA特異正確的結(jié)合，而EFIRM技術(shù)則需要捕獲探針與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合，捕獲探針長(zhǎng)度在18-25bp之間，雜交效率受錯(cuò)配堿基的影響明顯，只有待檢測(cè)DNA與兩條引物、捕獲探針同時(shí)準(zhǔn)確配對(duì)后才能有檢測(cè)信號(hào)，大大提高了檢測(cè)的特異性。

(3)操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速

PCR擴(kuò)增過程僅需要普通的PCR儀即可完成，EFIRM技術(shù)中電場(chǎng)的引入降低了雜交過程中對(duì)反應(yīng)時(shí)間的要求，加快了反應(yīng)速率。

(4)成本低

首先，在檢測(cè)設(shè)備方面，HPV較常用的檢測(cè)技術(shù)是基于熒光定量方法，都采用熒光信號(hào)檢測(cè)，檢測(cè)設(shè)備需配備昂貴的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，熒光定量PCR儀市場(chǎng)售價(jià)都在數(shù)十萬元左右。與之相比，PCR擴(kuò)增過程僅需要普通的PCR儀即可完成，EFIRM平臺(tái)采用獨(dú)創(chuàng)的電場(chǎng)引導(dǎo)的釋放與測(cè)量技術(shù)，檢測(cè)過程利用電場(chǎng)作用，反應(yīng)快速，最終結(jié)果以電信號(hào)的形式檢測(cè)，因而設(shè)備的成本大幅降低。

其次，在檢測(cè)試劑方面EFIRM技術(shù)基于核酸雜交的原理，采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的電化學(xué)技術(shù)。本發(fā)明中使用的核酸探針長(zhǎng)度在20bp左右，選擇于HPV亞型之間差異較大的E7區(qū)，采用人工合成寡核苷酸探針，引物中的一條采用較常見的Biotin修飾方法，另一條引物和捕獲探針無需修飾，捕獲探針的制備委托商業(yè)化的DNA化學(xué)合成公司完成，技術(shù)難度低，穩(wěn)定性較好，成本低。以PCR為基礎(chǔ)的熒光定量需要對(duì)探針進(jìn)行兩端修飾，且一端為熒光集團(tuán)，合成成本較高；HC2使用的探針為全長(zhǎng)的RNA探針，長(zhǎng)度為7000-8000個(gè)堿基，制備工藝復(fù)雜，耗時(shí)多，成本很高，而且由于探針非常長(zhǎng)，雜交效率受錯(cuò)配堿基的影響小，可能出現(xiàn)亞型間的交叉。因此檢測(cè)試劑成本與其它技術(shù)相比大幅降低。

總之，本發(fā)明提供的以PCR和EFIRM技術(shù)為基礎(chǔ)的HPV分型檢測(cè)的核酸組合及其試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)耗時(shí)短、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，適用于大量的臨床檢測(cè)和大規(guī)模的流行病學(xué)篩查。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京易活生物科技有限公司

<120> 一種HPV分型檢測(cè)的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagcccatta caatattgta 20

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcttccaaa gtacgaatgt ctacgtgtgt gct 33

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcttcggtt gtgcgtacaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacatttacc agcccgacga 20

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaactgtct gctgagcttt ctactactag ctcaattct 39

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtgttgtaa gtgtgaagcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagcccatta caatattgta accttttgtt gcaagtgtga ctctacgctt cggttgtgcg 60

tacaaagcac acacgtagac attcgtactt tggaagac 98

<210> 8

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacatttacc agcccgacga gccgaaccac aacgtcacac aatgttgtgt atgtgttgta 60

agtgtgaagc cagaattgag ctagtagtag aaagctcagc agac 104