本發(fā)明涉及食用菌種質(zhì)鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種赤靈芝菌株鑒定方法。
背景技術(shù)：
靈芝在分類系統(tǒng)上隸屬于真菌門(Eumycota)，擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層擔(dān)子菌綱(Hymenomycetes)，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)、非褶菌目(Aphyllophorales)、靈芝菌科(Ganodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma)。赤靈芝學(xué)名為(Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst)。
對(duì)于赤靈芝菌種的鑒定，傳統(tǒng)的鑒定方法主要是依賴于形態(tài)學(xué)觀察，包括對(duì)靈芝子實(shí)體的形、色、氣、味、質(zhì)地等外觀形狀觀察等。該方法簡(jiǎn)便易行，但主觀性強(qiáng)，準(zhǔn)確性完全依賴于檢測(cè)者的經(jīng)驗(yàn)判斷。
從分子遺傳學(xué)角度來(lái)看，物種表現(xiàn)型的差異歸根結(jié)底應(yīng)追溯到基因型的差異，即在DNA序列上的差異。后來(lái)出現(xiàn)了基于DNA序列的分子標(biāo)記技術(shù)，常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)包括RFLP、RADP、SSR、ISSR、AFLP等。DNA的分子標(biāo)記技術(shù)可以彌補(bǔ)和克服傳統(tǒng)鑒定方法的一些缺陷，在赤靈芝菌種的鑒定中也取得了良好的應(yīng)用效果。
但是，現(xiàn)有的分子標(biāo)記技術(shù)主要集中對(duì)特征序列的擴(kuò)增及測(cè)序，而利用特征序列僅可以確定靈芝的種屬。然而由于屬于同一物種，當(dāng)面對(duì)需要對(duì)赤靈芝的不同菌種進(jìn)行鑒定時(shí)，現(xiàn)有的分子標(biāo)記技術(shù)并不能滿足需求。因此，進(jìn)一步開發(fā)能夠用于赤靈芝不同菌株的鑒定方法十分必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種赤靈芝菌株鑒定方法。利用存在于ITS1序列中的SNP位點(diǎn)，本發(fā)明提供的方法能夠?qū)⒊囔`芝菌種203與其他菌種區(qū)分，準(zhǔn)確率可達(dá)100％。
本發(fā)明提供了ITS1序列的SNP位點(diǎn)在赤靈芝菌株鑒定中的應(yīng)用；
ITS1序列的SNP位點(diǎn)位于ITS1序列5’端的第180位核苷酸。
本發(fā)明中，赤靈芝菌株為赤靈芝203。
本發(fā)明中，ITS1序列5’端的第180位核苷酸為T則所述赤靈芝菌株為赤靈芝203。
本發(fā)明中，利用ITS1序列SNP位點(diǎn)能夠區(qū)分的赤靈芝菌株為赤靈芝203(Ganoderma lucidum 203)，東北赤靈芝(Ganoderma lucidum DB)，金寨喬康赤靈芝(Ganoderma lucidum JQ)，日本赤靈芝(Ganoderma lucidum RB)。
ITS序列是內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internally Transcribed Spacer)，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之間，分別為ITS 1和ITS 2。本發(fā)明的通過(guò)提取赤靈芝菌種及其制品的DNA，對(duì)ITS全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，將測(cè)序得到的ITS序列依據(jù)隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Models)使用HMMER suite軟件進(jìn)行比對(duì)注釋，得到ITS1序列全長(zhǎng)。將注釋得到的ITS1序列在本地用DNAMAN軟件比對(duì)。如果該ITS1序列從5’端開始的第180位為T則為赤靈芝菌種203，如果為C則不是該菌株。經(jīng)分析，赤靈芝203菌種ITS1序列如SEQ ID NO:3所示。
本發(fā)明還提供了由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組。
本發(fā)明提供的引物組能夠?qū)TS序列進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增。然后通過(guò)分析其中ITS1序列中的SNP位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)赤靈芝203菌種的鑒定。
所述引物組的退火溫度為54℃。
本發(fā)明提供的引物組在制備鑒定赤靈芝菌株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種鑒定赤靈芝菌株的試劑盒，包括由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組。
本發(fā)明提供的試劑盒還包括PCR反應(yīng)試劑。
所述PCR反應(yīng)試劑包括Taq酶，dNTP，Mg2+、擴(kuò)增緩沖液、ddH2O。
所述PCR反應(yīng)試劑可混合，也可為混合試劑。優(yōu)選為混合試劑。更優(yōu)選，混合試劑中還包括DNA染色劑。優(yōu)選的，DNA染色劑為L(zhǎng)oading Dye。
本發(fā)明還提供了一種鑒定赤靈芝菌株的方法，以由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成的引物組對(duì)待測(cè)樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增所得片段的SNP位點(diǎn)判斷赤靈芝的菌株種類；
擴(kuò)增所得片段的SNP位點(diǎn)位于其5’端的第180位核苷酸。
本發(fā)明中判斷具體為：所述擴(kuò)增所得片段5’段第180位為T則待測(cè)樣品來(lái)自赤靈芝203。
本發(fā)明提供的方法中對(duì)SNP位點(diǎn)基因型的鑒定可通過(guò)測(cè)序完成，也可通過(guò)采用特定酶切位點(diǎn)的酶切，然后觀察所得片段對(duì)不同SNP位點(diǎn)基因型進(jìn)行分辨。在本發(fā)明實(shí)施例中，采用測(cè)序?qū)NP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明中提供方法能夠區(qū)分的赤靈芝菌株為赤靈芝203(Ganoderma lucidum 203)，東北赤靈芝(Ganoderma lucidum DB)，金寨喬康赤靈芝(Ganoderma lucidum JQ)，日本赤靈芝(Ganoderma lucidum RB)。
如果該ITS1序列從5’端開始的第180位為T則樣品含有赤靈芝203，如果為C則樣品不含有赤靈芝203。
本發(fā)明所述待測(cè)樣品包含赤靈芝菌絲體、赤靈芝孢子粉和/或赤靈芝子實(shí)體。
所述赤靈芝菌絲體、赤靈芝孢子粉和/或赤靈芝子實(shí)體可為新鮮樣品也可經(jīng)干燥或炮制。所述待測(cè)樣品可僅為赤靈芝菌絲體、赤靈芝孢子粉和/或赤靈芝子實(shí)體；也可為包含赤靈芝菌絲體、赤靈芝孢子粉和/或赤靈芝子實(shí)體成分的物質(zhì)。
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物的工作濃度為10μmol/L。
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物的工作濃度為10μmol/L。
所述擴(kuò)增的體系包括：
所述擴(kuò)增的程序?yàn)?/p>
待測(cè)樣品的DNA的提取方法采用CTAB法。
具體的，對(duì)樣品DNA提取的方法包括：
步驟1：樣品以液氮研磨后，與CTAB溶液混合，室溫25℃下處理60min后，冷卻至室溫；
步驟2：加入氯仿與異戊醇混合液(體積比24:1)，混勻后12000rpm/min離心10min；
步驟3：取上清液加入等體積無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min，12000rpm/min離心10min，取沉淀；
步驟4：沉淀以體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇水溶液洗滌后，晾干，以ddH2O溶解。
本發(fā)明提供了ITS1序列上SNP位點(diǎn)在在赤靈芝菌株鑒定中的應(yīng)用，并提供了相應(yīng)的引物、試劑盒和鑒定方法。本發(fā)明提供的鑒定方法簡(jiǎn)單，僅需一對(duì)引物對(duì)ITS序列進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增后片段的SNP位點(diǎn)進(jìn)行鑒定即可有效鑒定赤靈芝203菌種及其相關(guān)制品，準(zhǔn)確率可達(dá)100％。
附圖說(shuō)明
圖1示不同赤靈芝菌種的ITS1序列比對(duì)圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種赤靈芝菌株鑒定方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
本發(fā)明采用的材料、儀器皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
實(shí)施例1
取赤靈芝飲片，能夠明確其中赤靈芝203 1份、東北赤靈芝1份、金寨喬康赤靈芝1份、日本赤靈芝1份。
1、分別提取DNA，并對(duì)各份DNA標(biāo)記原始來(lái)源后，進(jìn)行鑒定，每份樣
品重復(fù)10次。具體方法為：
用去離子水沖洗樣品三次，倒入液氮后研磨，磨碎后將樣品轉(zhuǎn)入含有CTAB溶液的離心管中，加熱處理60min。冷卻到室溫后，加入氯仿/異戊醇(24:1)溶液，顛倒混勻后，12000rpm/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，按照體積比1:1加入無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min，12000rpm/min離心10min。倒掉無(wú)水乙醇，加入0.5mL 70％的乙醇溶液，上下顛倒幾次后將乙醇倒掉，室溫晾干30min以上。加入50μL ddH2O，吸打混勻。
2、ITS序列的擴(kuò)增、注釋和比對(duì)
PCR反應(yīng)體系的組成：
2.5μL模板DNA(含30ng DNA)，
25μL2×PCR MasterMix(含電泳Loading Dye，天根公司)
2.5μL引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3’,10μmol/L)，
2.5μL引物ITS4B(5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCA-3’,10μmol/L)，
用ddH2O將總體積補(bǔ)至50μL。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：
94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。
PCR產(chǎn)物直接送華大公司測(cè)序。
使用HMMER suite軟件對(duì)公司測(cè)序得到的ITS序列全長(zhǎng)進(jìn)行ITS 1注釋。將注釋得到的ITS1序列在本地用DNAMAN軟件注釋。如果該ITS1序列從5’端開始的第180位為T則為赤靈芝203菌種，如果為C則不是該菌種(圖1)。
10次重復(fù)鑒定結(jié)果皆顯示，四種飲片均為赤靈芝，其中赤靈芝203 1份、東北赤靈芝1份、金寨喬康赤靈芝1份、日本赤靈芝1份，203能與其它靈芝有效區(qū)分。檢測(cè)結(jié)果與樣品實(shí)際情況完全相符，準(zhǔn)確率為100％。
實(shí)施例2
取赤靈芝孢子粉，能夠明確其中赤靈芝203 1份、東北赤靈芝1份、金寨喬康赤靈芝1份、日本赤靈芝1份。
1、分別提取DNA，并對(duì)各份DNA標(biāo)記原始來(lái)源后，進(jìn)行鑒定，每份樣品重復(fù)10次。DNA的提取方法與實(shí)施例1相同。
2、ITS序列的擴(kuò)增、注釋和比對(duì)
PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序也與實(shí)施例1相同。
PCR產(chǎn)物直接送華大公司測(cè)序。
使用HMMER suite軟件對(duì)公司測(cè)序得到的ITS序列全長(zhǎng)進(jìn)行ITS 1注釋。將注釋得到的ITS1序列在本地用DNAMAN軟件注釋。如果該ITS1序列從5’端開始的第180位為T則為赤靈芝203菌種，如果為C則不是該菌種。
10次重復(fù)鑒定結(jié)果皆顯示，赤靈芝孢子粉中赤靈芝203 1份、東北赤靈芝1份、金寨喬康赤靈芝1份、日本赤靈芝1份。檢測(cè)結(jié)果與樣品實(shí)際情況完全相符，準(zhǔn)確率為100％。
實(shí)施例3
取赤靈芝菌絲體，能夠明確其中赤靈芝203 1份、東北赤靈芝1份、金寨喬康赤靈芝1份、日本赤靈芝1份。
1、赤靈芝菌絲體的分離方法為
采收生長(zhǎng)至八月份新鮮的不同品種赤靈芝子實(shí)體，于超凈臺(tái)中分離菌絲，將分離菌絲放置在已滅菌的PDA平板上，28℃培養(yǎng)15天。挑選菌絲生長(zhǎng)良好的PDA平板，將菌種轉(zhuǎn)至PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)15天，挑選生長(zhǎng)良好的試管，放置在4℃冰箱保藏，每4～6個(gè)月活化傳代一次。另取菌絲生長(zhǎng)良好的PDA平板，用1cm直徑的打孔器打孔，將菌塊轉(zhuǎn)至PDA液體培養(yǎng)基中，28℃150μrpm/min，震蕩培養(yǎng)15天。將培養(yǎng)好的菌絲體抽濾，并用去離子水沖洗三次。
2、分別提取各菌絲體的DNA，并對(duì)各份DNA標(biāo)記原始來(lái)源后，，進(jìn)行鑒定，每份樣品重復(fù)10次。DNA的提取方法與實(shí)施例1相同。
3、ITS序列的擴(kuò)增、注釋和比對(duì)
PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序也與實(shí)施例1相同。
PCR產(chǎn)物直接送華大公司測(cè)序。
使用HMMER suite軟件對(duì)公司測(cè)序得到的ITS序列全長(zhǎng)進(jìn)行ITS 1注釋。將注釋得到的ITS1序列在本地用DNAMAN軟件注釋。如果該ITS1序列從5’端開始的第180位為T則為赤靈芝203菌種，如果為C則不是該菌種。
10次重復(fù)鑒定結(jié)果皆顯示，赤靈芝菌絲體中赤靈芝203 1份、東北赤靈芝1份、金寨喬康赤靈芝1份、日本赤靈芝1份。檢測(cè)結(jié)果與樣品實(shí)際情況完全相符，準(zhǔn)確率為100％。
以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 無(wú)限極（中國(guó)）有限公司
<120> 一種赤靈芝菌株鑒定方法
<130> MP1619195
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttggtcatt ttagaggaag taa 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caggagactt gtacacggtc ca 22
<210> 3
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgagttttg accgggttgt agctggcctt ccgaggcatg tgcacgccct gctcatccac 60
tctacacctg tgcacttact gtgggcttca gattgcgagg cacgctcttt accgggcttg 120
cggagcatat ctgtgcctgc gtttatcaca aactctataa agtaacagaa tgtgtattgt 180
gatgtaacac atctatata 199