專利名稱：一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法。
技術(shù)背景赤芝，學(xué)名為Ganoderma lucidum (Leyss. Fr) Karst,屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬。我國最早的藥學(xué)著作(神農(nóng)本草經(jīng))中記載有赤芝“苦、平、 無毒”，主治“胸中結(jié)”，“益心氣，補中，增智慧，不忘”，此外還強調(diào)靈芝可“久食親身不老，延年神仙”?？梢婌`芝的使用早在公元一世紀左右便為人所知。上世紀70年代，林志彬等在對靈芝藥理和臨床的研究過程中提出來了靈芝“扶正固本”的作用機制的工作假說。并在長期的研究中證明并完善這一假說。靈芝的藥理作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面1、抗腫瘤作用；2、免疫調(diào)節(jié)作用；3、抗放射作用；4、對神經(jīng)系統(tǒng)作用；5、對心血管的作用；6、對呼吸系統(tǒng)的作用；7、對消化系統(tǒng)的作用；8、對內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)的作用。
食用菌常用育種方法主要有單孢雜交育種，原生質(zhì)體融合育種，誘變育種以及野生菌株馴化等，但靈芝擔孢子細胞壁厚，長期以來被認為不能萌發(fā)，限制了靈芝的新品種選育。據(jù)統(tǒng)計我國已通過省級以上審定的赤芝品種共計18個，其中國家級審定品種4個，省級審定品種14個。18個品種中引進品種I個，野生馴化品種13個，原生質(zhì)體融合育成的品種2個，通過原生質(zhì)體單核化育種品種2個。相較于其他食藥菌品種，雜交育種所在的比例很少，而通過單孢雜交選育而成的品種則沒有。目前國內(nèi)栽培的赤芝品種主要是從日本和韓國引進的品種，如從日本引進的日芝、信州、惠州等，韓國引進的韓芝系列等。
野生馴化菌種中高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種較少，且篩選馴化工作繁重。誘變育種由于選育定向性差及遺傳穩(wěn)定性差所以在生產(chǎn)栽培上很少推廣使用。原生質(zhì)體單核化育種雖可以解決由于靈芝擔孢子難萌發(fā)，單核菌株難以獲得的難題，但是原生質(zhì)體單核化獲得的單核菌株未經(jīng)減數(shù)分裂過程，一個菌株只能獲得兩種類型的單核菌株，因此通過原生質(zhì)體技術(shù)很難獲得廣泛變異的新品種。通過擔孢子能獲得具有豐富遺傳多樣性的單核菌株，本發(fā)明解決了赤芝擔孢子難萌發(fā)的問題，為赤芝的單孢雜交育種打下良好的基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法，解決赤芝擔孢子不易萌發(fā)的難題， 為赤芝的單孢雜交育種打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明的一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法，包括以下步驟(I)擔孢子收集用于萌發(fā)的擔孢子應(yīng)選擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待赤芝菌蓋分化形成，菌蓋邊緣l-2cm呈白色生長圈時收集擔孢子；采用套袋收集的方法，套袋材料選用無菌的白色或黃色的信封和硫酸紙，將無菌的硫酸紙光面向上放入信封，再用信封將赤芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，用橡皮筋將信封口固定在菌柄上；擔孢子收集期間控制環(huán)境相對濕度80%-90%，溫度 240C _28°C，套袋收集的時間為20h-24h ；(2)擔孢子保存收集的赤芝擔孢子放在信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度20°C -30°C、相對濕度50%-75%，或放置在4°C冰箱；但放置時間不超過24h ；(3)擔孢子萌發(fā)取收集的赤芝擔孢子，在無菌操作下用無菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有10-20個孢子即可涂布赤芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在28°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔孢子萌發(fā)； 使用的赤芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽赤芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，赤芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過濾取浸潰液，將殘渣同樣再浸潰、過濾一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水定容至IL ；所述赤芝提取液取120-200g切碎的干赤芝，加入IL水煮沸30min，過濾去除殘渣并加水定容至1L。
通過選擇赤芝子實體時期，采用套袋方法收集擔孢子并控制收集擔孢子時間，在麥芽赤芝培養(yǎng)基進行萌發(fā)，使赤芝擔孢子的萌發(fā)率在1. 0%以上，從而獲得赤芝單孢菌株。 本方法解決了在實驗室條件下赤芝擔孢子不易萌發(fā)的難題，從而為赤芝的單孢雜交育種打下基礎(chǔ)。
擔孢子是擔子菌細胞核減數(shù)分裂的產(chǎn)物，是進行雜交選育的基本材料。本發(fā)明簡單易行，無需用到特殊的藥品及儀器設(shè)備，普通實驗室即可通過本發(fā)明獲得所需的單孢菌株用于赤芝的雜交育種或用于赤芝的遺傳分析。由于通過擔孢子萌發(fā)所獲得的單核菌株多樣性豐富，用于雜交育種其后代遺傳性狀穩(wěn)定，且有利于獲得新的遺傳性狀，克服了野生馴化遺傳變異小，誘變育種不穩(wěn)定的問題，為赤芝的品種改良和新品種選育打下基礎(chǔ)。


圖1赤芝擔孢子在培養(yǎng)基萌發(fā)形態(tài)。
圖2赤芝子實體生長中期，此時收集的擔孢子易萌發(fā)。
圖3赤芝子實體生長后期，此時收集的擔孢子不易萌發(fā)或不萌發(fā)。
圖4赤芝子實全生長成熟期，此時收集的擔孢子不萌發(fā)。具體實施例
本發(fā)明的一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法，包括以下步驟1.擔孢子收集時期及方法赤芝孢子釋放周期大約30天，用于萌發(fā)的擔孢子應(yīng)選擇前10天釋放的。即待赤芝菌蓋分化形成，菌蓋邊緣l-2cm呈白色生長圈時收集擔孢子，見圖2。若菌蓋邊緣的白色生長圈小于Icm或消失時收集的擔孢子不易萌發(fā)或不萌發(fā)，見圖3和圖4。
孢子采集采用套袋收集的方法，套袋材料選用無菌的白色信封和硫酸紙。將無菌的硫酸紙光面向上放入信封，再用信封將赤芝菌蓋套住至菌柄 ，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，用橡皮筋將信封口固定在菌柄上。孢子收集期間控制空間相對濕度在80%-90%， 溫度24°C _28°C，套袋收集的時間在20h-24h便可在硫酸紙收集到赤芝擔孢子。收集時間過短則收集的孢子量少，若時間過長收集的擔孢子則不易萌發(fā)或不萌發(fā)。
2.擔孢子保存收集的赤芝擔孢子放在無菌的信封內(nèi)，空間溫度20°C -30°C、相對濕度50%-75%，或放置4°C冰箱，但放置時間不超過24h，若超過24h則不易萌發(fā)或不萌發(fā)。
3.擔孢子萌發(fā)處理取剛收集的赤芝孢子印，在無菌操作下稀釋至100倍顯微鏡視野中有10-20個孢子即可涂布平板，涂好的平板在28°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)48h后開始觀察，至擔孢子開始萌發(fā)。使用的赤芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽赤芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，赤芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min。
麥芽汁取干麥芽粉15-20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過濾取浸潰液，將殘渣同樣再浸潰、過濾一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水至1L。
赤芝提取液取120_200g切碎的干赤芝，加入IL煮沸30min，過濾去除殘渣并加水至IL0
為了充分公開本發(fā)明的赤芝擔孢子萌發(fā)的方法，以下結(jié)合實施例加以說明。
實施例1 :一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法1.親本選擇及出芝選擇生產(chǎn)性狀良好的日本赤芝和赤芝5. 75作為親本，在PDA斜面進行活化，長滿斜面后轉(zhuǎn)接到木屑菌袋中。具體種植方法參見文獻曾振基，古培總，陳東標，凌宏通，何煥清. 雜木屑栽培赤靈芝技術(shù)[J].中國食用菌，2004,23 (3) :41-42.
2.擔孢子采集時期及方法赤芝孢子釋放周期大約30天，用于萌發(fā)的擔孢子應(yīng)選擇前10天釋放的。即待赤芝菌蓋分化形成，選擇子實體生長至3-4cm、菌蓋邊緣l-2cm呈白色生長圈時收集擔孢子 。用無菌的白色信封和硫酸紙采用套袋法收集孢子，將無菌的硫酸紙光面向上放入信封，再用信封將赤芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，用橡皮筋將信封口固定在菌柄上。孢子收集期間控制空間相對濕度在85%-90%，溫度26°C，套袋收集的時間為22h便可在硫酸紙收集到赤芝擔孢子。收集時間過短則收集的孢子量少，若時間過長收集的擔孢子則不易萌發(fā)或不萌發(fā)。
3.擔孢子保存將收集的赤芝擔孢子裝入無菌的信封內(nèi)，于室溫下、相對濕度70%放置4h后進行涂單孢。
4.擔擔孢子萌發(fā)處理取收集保存4h的赤芝孢子印，在無菌操作下用無菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有 10-20個孢子即可涂布平板，涂好的平板在28°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)4854h，可觀察到萌發(fā)的赤芝擔孢子。使用的赤芝擔孢子萌發(fā)的平板培養(yǎng)基為麥芽赤芝汁瓊脂培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，赤芝提取液100 ml，瓊脂20g，水700ml，121°C滅菌30 min。
麥芽汁取干麥芽粉15g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過濾取浸潰液， 將殘渣同樣再浸潰、過濾一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水至1L。
赤芝提取液取120g切碎的干赤芝，加入IL水煮沸30min，過濾去除殘渣并加水至IL0
PDA培養(yǎng)基配方200g馬鈴薯(浸提液)、20g葡萄糖、20g瓊脂、pH自然加水至IOOOmLo
水瓊脂培養(yǎng)基配方瓊脂20g，水1000ml。
表I不同萌發(fā)處理48h赤芝孢子萌發(fā)率
權(quán)利要求
1.一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)擔孢子收集用于萌發(fā)的擔孢子應(yīng)選擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待赤芝菌蓋分化形成，菌蓋邊緣l-2cm呈白色生長圈時收集擔孢子；采用套袋收集的方法，套袋材料選用無菌的白色或黃色的信封和硫酸紙，將無菌的硫酸紙光面向上放入信封，再用信封將赤芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，用橡皮筋將信封口固定在菌柄上；擔孢子收集期間控制環(huán)境相對濕度80%-90%，溫度 240C _28°C，套袋收集的時間為20h-24h ；(2)擔孢子保存收集的赤芝擔孢子放在信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度20°C -30°C、相對濕度50%-75%，或放置在4°C冰箱；但放置時間不超過24h ；(3)擔孢子萌發(fā)取收集的赤芝擔孢子，在無菌操作下用無菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有10-20個孢子即可涂布赤芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在28°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔孢子萌發(fā)； 使用的赤芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽赤芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，赤芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過濾取浸潰液，將殘渣同樣再浸潰、過濾一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水定容至IL ；所述赤芝提取液取120-200g切碎的干赤芝，加入IL水煮沸30min，過濾去除殘渣并加水定容至1L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法。通過選擇赤芝子實體時期，采用套袋方法收集擔孢子并控制收集擔孢子時間，在麥芽赤芝培養(yǎng)基進行萌發(fā)，使赤芝擔孢子的萌發(fā)率在1.0%以上，從而獲得赤芝單孢菌株，所述麥芽赤芝培養(yǎng)基配方為麥芽汁200ml，赤芝提取液100ml，瓊脂20g，水700ml，121℃滅菌30min。本方法解決了在實驗室條件下赤芝擔孢子不易萌發(fā)的難題，從而為赤芝的單孢雜交育種打下基礎(chǔ)。本發(fā)明簡單易行，無需用到特殊的藥品及儀器設(shè)備，普通實驗室即可通過本發(fā)明獲得所需的單孢菌株用于赤芝的雜交育種或用于赤芝的遺傳分析。
文檔編號A01G1/04GK103026901SQ201210580100
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者吳小平, 柯斌榕, 劉芳, 劉新銳 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)