專利名稱：小孢子成熟胚直接萌發(fā)成植株的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種小孢子成熟胚直接萌發(fā)成植株的制備方法。
背景技術(shù)：
植物小孢子又叫幼嫩花粉是一種單倍性，單細(xì)胞的群體。在體外通過組織培養(yǎng)可誘導(dǎo)小孢子脫分化，啟動(dòng)胚性分裂形成胚。目前，小孢子(花粉)胚胎發(fā)生已在25個(gè)科，50個(gè)屬，近200個(gè)種中取得了成功(Ferrie AMR，Palmer CE，KellerWA.，Haploid embryogenesis.InThorpe TA(ed)In vitro embryogenesis.In plants.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht.，1995.309-344.)。與其它體外胚胎發(fā)生體系相比，由小孢子發(fā)育而來的胚狀體具有個(gè)體形態(tài)更為一致，發(fā)生量大，結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點(diǎn)，而且其具單倍體的遺傳背景，經(jīng)自發(fā)或人工加倍后，即可獲得純合的二倍體，因而在無(wú)性系快速繁殖，植物遺傳工程和品種改良等方面的應(yīng)用價(jià)值都受到高度重視(Ragharan V.，Embryogenenic Development of Pollen Grains.InRagharan V(ed)Molecular embryology of flowering plants.New YorkCambridgeUniversity Press，1997.500-524.)。然而其應(yīng)用潛力在很大程度上要受到花粉胚狀體直接萌發(fā)困難，或者萌發(fā)率不夠高的限制。這主要是由于胚狀體萌發(fā)過程中存在一個(gè)問題，即接種的胚狀體直接萌發(fā)受到抑制，通常需要二次成胚或愈傷化后通過器官發(fā)生再生小植株。按照常規(guī)的方法，將油菜小孢子胚狀體接種于B5培養(yǎng)基上，只有極少數(shù)(5-7.8％)從分生組織處正常萌發(fā)，直接再生小植株，大多數(shù)胚狀體在培養(yǎng)基上先愈傷化，再二次成胚，或通過器官發(fā)生形成小植株(Chuong PV，Beversdorf WD.High frequency embryogenesis through isolatedmicrospore culture in Brassica napus L.and B.carinata Braun.Plant Sci，1985，39219-226；Swanson EB，Coumans MP，Wu SC，Barsby TL，Beversdorf WD.Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryosfrom Brassica napus.Plant Cell Rep，1987，694-97；Cao MQ，Li Y，Liu F，Dore C.Embryogenesis and plant regeneration of pakchio(Brassica rapa L.ssp.Chinensis)via in vitro isolated microspore culture.Plant Cell Rep，1994，13447-450)。同時(shí)，在其萌發(fā)和生長(zhǎng)中，常出現(xiàn)分生組織缺乏，早期壞死，多子葉等不正?，F(xiàn)象(CaoMQ，Li Y，Liu F，Dore C.Embryogenesis and plant regeneration of pakchio(Brassicarapa L.ssp.Chinensis)via in vitro isolated microspore culture.Plant Cell Rep，1994，13447-450)。Senaratna T等(1991)將油菜(B.napus.L)子葉期的小孢子胚先在50mM的ABA處理7天后，再于低于15％的濕度下干化處理至少7天，獲得了較好的萌發(fā)效果，直接萌發(fā)頻率可達(dá)50％(Senaratna T，Kott L，BeversdorfWD，Mckersie BD.Desiccation of microspore derived embryos of oilseed rapa(Brassica rapa L.).Plant Cell Rep，1991，10342-344.)。但此法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，且萌發(fā)頻率仍不能滿足要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種小孢子成熟胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，該方法解決小孢子胚難以直接萌發(fā)成苗的技術(shù)難題，可使80％以上的小孢子胚直接萌發(fā)成植株。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法并使用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可實(shí)現(xiàn)上述目的。
一種小孢子胚萌發(fā)成植株的方法，該方法包括以下步驟1、小孢子的制備選取小孢子處于單核晚期的新鮮花蕾，消毒，無(wú)菌水洗去消毒液，在B5培養(yǎng)基中輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養(yǎng)基中，過篩除花蕾組織殘?jiān)x心收集小孢子；2、小孢子胚的誘導(dǎo)用NLN-13培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度至1-2×105/mL，分裝小孢子于培養(yǎng)皿中， 28-35℃恒溫暗培養(yǎng)12-16天，移至25-28℃，在光照為2-10μmol·s-1·m-2時(shí)，培養(yǎng)8-12天，再用NLN-0培養(yǎng)基稀釋至300-400胚狀體/3.5cm培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)10-15天，形成小孢子胚；3、小孢子胚的萌發(fā)將具有明顯的根和子葉，長(zhǎng)度為6-8mm已分化完全的胚的根插入含氯化鈣的MS固體培養(yǎng)基中，在28-35℃恒溫，光照為2-10μmol·s-1·m-2時(shí)培養(yǎng)12-16天形成植株，其中培養(yǎng)基的組成是(以下簡(jiǎn)稱WH-1培養(yǎng)基)(以1000毫升計(jì))MS常用培養(yǎng)基 500毫升水500毫升氯化鈣 700-1000毫克蔗糖 20-30毫克瓊脂 6-10毫克調(diào)PH至5.3-6.0在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，由小孢子萌發(fā)成植株的方法包括以下步驟1、孢子的制備選取小孢子處于單核晚期的新鮮花蕾，消毒，無(wú)菌水洗去消毒液，在B5培養(yǎng)基中輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養(yǎng)基中，過篩除花蕾組織殘?jiān)x心收集小孢子；2、小孢子胚的誘導(dǎo)用NLN-13培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度至1-2×105/mL，分裝小孢子于培養(yǎng)皿中，32℃恒溫暗培養(yǎng)14天，移至25℃光照為2-10μmol·s-1·m1時(shí)培養(yǎng)10天，再用NLN-0培養(yǎng)基稀釋至300-400胚狀體/3.5cm培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)15天，形成小孢子胚；3、小孢子胚的萌發(fā)將已分化完全的胚的根插入含氯化鈣的MS固體培養(yǎng)基中，在32℃恒溫2-10μmol·s-1·m-2培養(yǎng)30天形成植株，其中培養(yǎng)基的組成是(WH-1)(以1000毫升計(jì))MS常用培養(yǎng)基 500毫升水500毫升氯化鈣900毫克蔗糖 30毫克瓊脂 8毫克調(diào)PH至5.8本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1、萌發(fā)頻率高，達(dá)80％以上。傳統(tǒng)方法最高僅達(dá)50％。
2、操作簡(jiǎn)單，只需使用特制的培養(yǎng)基，按傳統(tǒng)方法接種即可。
3、無(wú)須進(jìn)行低溫、干化及激素處理。傳統(tǒng)方法必須經(jīng)過各種預(yù)處理才能使胚直接萌發(fā)。
4、降低了染色體變異的可能性。如經(jīng)愈傷組織化再生苗，或經(jīng)二次胚胎發(fā)生形成苗，染色體變異的機(jī)會(huì)將大大增加，不利于保持物種的特性。
5、提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)入外源基因的幼胚如經(jīng)愈傷組織化再生苗，或經(jīng)二次胚胎發(fā)生形成苗，會(huì)明顯降低轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成苗的機(jī)會(huì)，從而降低了轉(zhuǎn)化效率。
為了敘述方便，在本發(fā)明中小孢子是指單核晚期花粉；小孢子胚是指由小孢子經(jīng)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚；小孢子胚的直接萌發(fā)是指由小孢子胚經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育直接形成植株；植株是指有完整根、莖、葉成熟結(jié)構(gòu)的植物個(gè)體。本發(fā)明中的氯化鈣是可溶性的，其它可溶性的鈣鹽也可應(yīng)用于本發(fā)明領(lǐng)域。有效鈣離子濃度達(dá)800-1000毫克/升即可。MS培養(yǎng)基是指Murashige T和Skoog F1962年發(fā)明的培養(yǎng)基(Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bio-assayswith tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15473-497.)，B5培養(yǎng)基是指SattoT，Nishio T，和Hirai M.1989發(fā)明的培養(yǎng)基(Satto T，Nishio T，Hirai M.Plantregeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage(Brassicacampestris ssp.Dekinensis).Plant Cell Rep，1989，8486-488.)。


圖1分化成熟的小孢子胚圖2插入固體培養(yǎng)基的小孢子胚圖3小孢子胚高頻率直接萌發(fā)群體圖4由小孢子胚直接萌發(fā)成苗
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，氯化鈣是可溶性的，其它可溶性的鈣鹽滿足800-1000毫克/升鈣離子濃度也可應(yīng)用于本發(fā)明領(lǐng)域。
作為能夠應(yīng)用本發(fā)明方法的植物的實(shí)例，可以列舉屬于下列目的植物大白菜，芥菜等，青菜，蘿卜，紅菜薹等作為這些植物的具體實(shí)例，可以列舉的有油菜。
一種小孢子胚萌發(fā)成植株的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為(以1000毫升計(jì))MS常用培養(yǎng)基 500毫升水500毫升氯化鈣700-1000毫克蔗糖 20-30毫克瓊脂 6-10毫克調(diào)PH至5.3-6.0
本發(fā)明的培養(yǎng)基主要是在半量的MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，附加一定數(shù)量的氯化鈣。氯化鈣是可溶性的，其它可溶性的鈣鹽滿足800-1000毫克/升鈣離子濃度也可應(yīng)用于本發(fā)明領(lǐng)域。小孢子胚在此培養(yǎng)基上進(jìn)一步可直接萌發(fā)成植株。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法和特殊培養(yǎng)基，能夠由植物的小孢子直接高頻率地萌發(fā)成植株，這些植株再通過常規(guī)的培養(yǎng)方法進(jìn)一步培養(yǎng)成可供育種和/或生產(chǎn)的種苗，從而使具有相同性狀的小孢子胚大量產(chǎn)生。順便指出，本發(fā)明得到的植株可進(jìn)一步通過普通的栽培方法長(zhǎng)成具有相同性狀的完整成熟植株體。
實(shí)施例2油菜小孢子胚高頻率直接萌發(fā)成植株選取小孢子處于單核晚期、長(zhǎng)約3mm的新鮮花蕾材料，置于4％的次氯酸鈉溶液消毒10min，無(wú)菌水洗3-4次，加入B5培養(yǎng)基4-5ml，用平頭玻棒輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養(yǎng)基中，通過50μm孔徑尼龍篩網(wǎng)除去花蕾組織殘?jiān)?，加?mL新鮮B5培養(yǎng)基沖洗篩網(wǎng)，收集小孢子懸液，用100×g，3min離心，洗滌3次，最后用NLN-13培養(yǎng)基(NLN培養(yǎng)基，附加13％蔗糖，不加外源激素，pH6.0)將小孢子密度調(diào)至1-2×105/mL。將小孢子懸液分裝于3.5cm小培養(yǎng)皿中，每皿1.5mL，32℃恒溫暗培養(yǎng)，約14天，移至25℃弱光培養(yǎng)，10天，用NLN-0(NLN培養(yǎng)基，不加外源激素和滲透壓調(diào)節(jié)劑)稀釋至300-400胚狀體/3.5cm小培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)10-15天，得到小孢子胚，此時(shí)孢子胚已分化完全，具有明顯的根和子葉，長(zhǎng)度6-8mm；將小孢子胚移至WH-1固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。孢子胚的培養(yǎng)基組成與實(shí)施例1相同。
權(quán)利要求
1.一種小孢子成熟胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、孢子的制備選取小孢子處于單核晚期的新鮮花蕾，消毒，無(wú)菌水洗去消毒液，在B5培養(yǎng)基中輕輕擠壓花蕾，使小孢子游離至培養(yǎng)基中，過篩除花蕾組織殘?jiān)?，離心收集小孢子；B、小孢子胚的誘導(dǎo)用NLN-13培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度至1-2×105/mL，分裝小孢子于培養(yǎng)皿中，28-35℃恒溫暗培養(yǎng)12-16天，移至25-30℃，在光照為2-10μmol·s-1·m-2時(shí)，培養(yǎng)8-12天，再用NLN-0培養(yǎng)基稀釋至300-400胚狀體/3.5cm培養(yǎng)皿，弱光培養(yǎng)10-14天，形成小孢子胚；C、小孢子胚的萌發(fā)將根和子葉，長(zhǎng)度為6-8mm已分化完全的胚的根插入含附加氯化鈣的MS固體培養(yǎng)基中，在28-35℃恒溫，在光照為2-10μmol·s-1·m-2時(shí)，培養(yǎng)12-16天形成植株，其中培養(yǎng)基的組成是MS常用培養(yǎng)基 500毫升水500毫升氯化鈣 700-1000毫克蔗糖 20-30毫克瓊脂 6-10毫克調(diào)PH至5.3-6.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小孢子成熟胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基的組成是MS常用培養(yǎng)基 500毫升水 500毫升氯化鈣 700-1000毫克蔗糖 30毫克瓊脂 8毫克調(diào)PH至5.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小孢子成熟胚直接萌發(fā)成植株的制備方法，首先是小孢子的制備，選取小孢子的新鮮花蕾，消毒，無(wú)菌水洗去消毒液，在培養(yǎng)基中擠壓花蕾，過篩、離心收集小孢子；其次是小孢子胚的誘導(dǎo)，用培養(yǎng)基調(diào)小孢子密度，恒溫培養(yǎng)；第三是小孢子胚的萌發(fā)，將根和子葉及一定長(zhǎng)度的已分化完全的胚的根插入固體培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)一定時(shí)間后形成植株。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，萌發(fā)頻率高，可廣泛應(yīng)用于植物育種和科學(xué)研究。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1421125SQ0214789
公開日2003年6月4日 申請(qǐng)日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者孫蒙祥, 田輝 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)