專利名稱：一種紫芝擔孢子萌發(fā)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫芝擔孢子萌發(fā)的方法。
技術(shù)背景紫芝，學(xué)名為Ganoderma sinense (Zhao, Xu et ) Zhang,屬于真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬。紫芝也稱“中國靈芝”，野生主要分布在兩廣、福建和臺灣等地區(qū)。子實體木栓質(zhì)，多呈半圓形至腎形，少數(shù)近圓形，大型個體長寬可達20cm，一般個體4. 7 X 4cm，小型個體2 X1. 4cm，表面紫黑色，具漆樣光澤，菌肉銹褐色。菌管管口與菌肉同色，管口圓形，每毫米5個。菌柄側(cè)生，長可達15cm，直徑約2cm，黑色，有光澤。擔孢子頂端呈臍突形，或稍平截，雙層壁，外壁透明內(nèi)壁平滑，內(nèi)壁呈淡褐色有明顯小刺。掃描電鏡下觀察孢子表面有縱向的溝脊，脊上側(cè)邊可見整齊的孔洞結(jié)構(gòu)，成熟孢子大小約為10-12. 5 X 7-8. 5 μ m0紫芝作為一種傳統(tǒng)藥用菌被《中華人民共和國藥典》所收錄，其含有多種化學(xué)成分，主要為多糖，生物堿，留醇，有機酸及三萜類化合物。紫芝氣味甘、性溫、無毒，具有治耳聾、利關(guān)節(jié)、保神、益精氣、久服輕身不老延年的功效。
隨著紫芝的保健功效不斷為人所知，紫芝需求量不斷加大。對與紫芝的種植栽培要求不斷提高，然而紫芝生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量低，給紫芝的生產(chǎn)栽培帶來很大的困難。另外由于紫芝抗病蟲害能力弱，導(dǎo)致紫芝農(nóng)藥殘留現(xiàn)象時有發(fā)生，嚴重制約了紫芝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此選育生產(chǎn)周期短，高產(chǎn)，抗病蟲害的紫芝菌株勢在必行。現(xiàn)代蕈菌育種主要方式主要有一下幾種野生馴化、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種和雜交育種等。野生馴化，主要從野外采集經(jīng)過組織分離而來，由于沒有發(fā)生遺傳變異所以不能獲得新的種性。誘變育種和原生質(zhì)體融合不僅需要篩選眾多的變異體和融合體，而且由于遺傳穩(wěn)定性較差，并未得到廣泛的應(yīng)用。雜交育種是一種有效的品種改良技術(shù)，并在香菇、雙孢蘑菇和金針菇等得到廣泛的應(yīng)用。其主要流程為(1)親本選擇；(2)親本單核菌株的獲得；(3)單核菌株配對雜交；[4]雜合子鑒定；(5)雜合子篩選，小試、大試和推廣。研究表明紫芝擔孢子為雙層細胞壁， 同紫芝一樣擔孢子不易萌發(fā)，也未見有關(guān)紫芝擔孢子萌發(fā)的研究。
紫芝擔孢子為雙層細胞壁，同紫芝一樣擔孢子不易萌發(fā)，無法進行擔孢雜交育種，目前生產(chǎn)上使用的紫芝品種主要是通過野生菌株馴化而來。本方法解決了紫芝擔孢子萌發(fā)難的問題，在紫芝雜交育種上具有重大意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫芝擔孢子萌發(fā)的方法，解決紫芝擔孢子不易萌發(fā)的難題， 為紫芝的雜交育種打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明的一種紫芝擔孢子萌發(fā)的方法，包括以下步驟(I)紫芝擔孢子收集用于萌發(fā)的紫芝擔孢子應(yīng)選擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待紫芝菌蓋分化形成， 菌蓋未完全呈紫色、邊緣O. 3-0. 8cm呈白色生長圈時收集擔孢子；采用套袋收集的方法，套袋時選用滅菌的信封內(nèi)墊一張無菌的硫酸紙，用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，再用封條將信封固定在菌蓋上；擔孢子收集期間控制環(huán)境相對濕度80%-90%，溫度24°C _28°C，套袋收集的時間為20h_24h ；(3)紫芝擔孢子保存收集的紫芝擔孢子放在滅菌的信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度18°C _28°C、相對濕度50%-75%， 或放置在4 °C冰箱，但放置時間不超過24h ；(4)擔孢子萌發(fā)處理取收集的紫芝擔孢子，在無菌操作下用無菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有15-30個孢子即可涂布紫芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在25V _27°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔孢子萌發(fā)；使用的紫芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過濾取浸潰液，將殘渣同樣再浸潰、過濾一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水定容至IL ；所述靈芝提取液取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入IL水煮沸30min，過濾去除殘渣并加水定容至1L。
本發(fā)明選擇菌蓋帶有白邊剛開始彈射孢子的紫芝子實體來收集擔孢子，通過子實體活體套袋收集擔孢子，將孢子涂布于萌發(fā)培養(yǎng)基中，獲得了紫芝單核菌株。解決了實驗室條件下紫芝成熟擔孢子不易萌發(fā)，難以進行紫芝雜交育種的難題。
本發(fā)明簡單易行無需用到特殊的藥品及儀器設(shè)備，普通實驗室即可通過本方法獲得所需的單核菌株用于雜交育種或紫芝的遺傳分析。擔孢子是擔子菌減數(shù)分裂的產(chǎn)物，存在廣泛的遺傳變異。由擔孢子萌發(fā)所獲得的單核菌株具有遺傳多樣性的特點，單核菌株雜交后，有利于獲得超親性狀，解決了紫芝不能單孢雜交的問題。


圖1為紫芝擔孢在培養(yǎng)基中萌發(fā)形態(tài)。具體實施例
本發(fā)明的一種赤芝擔孢子萌發(fā)的方法，包括以下步驟1.紫芝擔孢子收集時期選擇用于萌發(fā)的紫芝擔孢子應(yīng)選 擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待紫芝菌蓋分化形成， 菌蓋未完全呈紫色、邊緣O. 3-0. 8cm呈白色生長圈時收集擔孢子；2.紫芝擔孢子收集方法采用套袋收集的方法，套袋材料選用透氣性、透光性好的信封，套袋時選用滅菌信封內(nèi)墊一張無菌的硫酸紙，用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，再用封條將信封固定在菌蓋上；擔孢子收集期間控制環(huán)境相對濕度80%-90%，溫度 240C _28°C，套袋收集的時間為20h-24h。
3.紫芝擔孢子保存收集的紫芝擔孢子放在無菌的信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度18°C _28°C、相對濕度50%-75%， 或放置在4°C冰箱；但放置時間不超過24h。
4.擔孢子萌發(fā)處理取收集的紫芝擔孢子，在無菌操作下用無菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有15-30個孢子即可涂布紫芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在25°C _27°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔孢子萌發(fā)；使用的紫芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過濾取浸潰液，將殘渣同樣再浸潰、過濾一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水定容至IL ；所述靈芝提取液取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入IL水煮沸30min，過濾去除殘渣并加水定容至1L。
為了充分公開本發(fā)明的赤芝擔孢子萌發(fā)的方法，以下結(jié)合實施例加以說明。
實施例1 :一種紫芝擔孢子萌發(fā)的方法選擇福建紫芝栽培品種紫芝S2作為親本，在PDA斜面進行活化，長滿斜面后轉(zhuǎn)接到木屑菌袋中。具體種植方法參見文獻鐘禮義，邱福平，陳體強.闊葉樹邊材栽培紫芝示范試驗[J].食用菌，2005，1:26-27。
2.擔孢子采集時期選擇紫芝孢子釋放周期大約30天，用于萌發(fā)的擔孢子應(yīng)選擇前10天釋放的。即待紫芝菌蓋分化形成，選擇選取朵型完整，長勢健壯，菌管發(fā)育正常，子實體生長至3-5cm、菌蓋邊緣 O. 3-0. 6cm呈白色生長圈時收集擔孢子。
3.紫芝擔孢子收集方法用無菌的信封和硫酸紙采用紫芝活子實體套袋法收集孢子，將無菌的硫酸紙光面向上放入信封，再用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，用封條將信封固定在菌蓋上。孢子收集期間控制空間相對濕度85%-90%，溫度25°C -27°C，套袋收集的時間22h便可在硫酸紙收集到赤芝擔孢子。收集時間過短則收集的孢子量少，若時間過長收集的擔孢子則不易萌發(fā)或不萌發(fā)。
4.紫芝擔孢子保存將收集的紫芝擔孢子裝入無菌的信封內(nèi)，于室溫下、相對濕度60%放置2h后進行涂單孢。
5.擔孢子萌發(fā)處理取收集保存2h的紫芝孢子印，在無菌操作下用無菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有 10-20個孢子即可涂布平板，涂好的平板在28°C生化 培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)54h，可觀察到萌發(fā)的紫芝擔孢子，見圖1。使用的紫芝擔孢子萌發(fā)的平板培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為 麥芽汁200ml，紫芝提取液100 ml，瓊脂20g，水700ml，121°C滅菌30 min ；麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60— 70°C浸潰60min，濾取浸潰液，將殘渣同樣再浸潰一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水定容至IL ；紫芝提取液取150-250g切碎的干紫芝，加入IL水煮沸30min，過濾去除殘渣并加水定容至1L。
采用PDA培養(yǎng)基(配方200g馬鈴薯、20g葡萄糖、20g瓊脂、pH自然加水至IOOOmL) 或水瓊脂培養(yǎng)基(配方瓊脂20g，水1000ml)，紫芝擔孢子均不萌發(fā)，本發(fā)明經(jīng)麥芽靈芝培養(yǎng)基萌發(fā)處理54h后孢子萌發(fā)率為O. 91%。
6.單核菌株獲得及檢測選取觀察到有擔孢子萌發(fā)的平板，在100倍顯微鏡下觀察尋找萌發(fā)出芽管的擔孢子，用接種針無菌條件下連同培養(yǎng)基挑出萌發(fā)的擔孢子于斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當菌落長到Icm左右時即可在顯微鏡下鏡檢觀察是否有鎖狀聯(lián)合，無鎖狀聯(lián)合即為單核菌株。通過鏡檢純化后，共獲得了 31根紫芝單核菌株。
7.單孢菌株交配型測定以紫芝S2的一個單孢菌株記為T1，作為交配型測定的基準菌株，其交配型定為AxBx。將余下30根紫芝S2單核菌株與T1在PDA培養(yǎng)基上進行配對，待兩個單孢菌株的菌絲接觸3d 后，觀察鎖狀聯(lián)合，出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合的表示與T1發(fā)生親和反應(yīng)，選出能與T1發(fā)生親和反應(yīng)的單孢菌株，將其定為測交菌株T2,其交配型定為AyBy。
將所有不與T1親和的單孢分離菌株與T2交配，能與T2發(fā)生親和反應(yīng)的單孢分離菌株的交配型則為AXBX。
將既不與T1發(fā)生親和，又不與T2發(fā)生親和的某一單孢菌株定為測交菌株T3，其交配型定為AxBy。將既不與T1發(fā)生親和，又不與T2發(fā)生親和的所有其他單孢菌株均與T3交配，交配中發(fā)生親和的菌株的交配型為AyBx，而不親和的菌株交配型為AxBy。
通過三輪交配反應(yīng)，可知31根紫芝S2單核菌株的交配型， 交配型為AxBx有11個單孢菌株，交配型為AyBy有7個單孢菌株，交配型為AxBy有8個單孢菌株，交配型為AyBx有 5個單孢菌株。獲得四種交配的單孢菌株。
擔孢子是減數(shù)分裂的產(chǎn)物，存在廣泛的變異，紫芝單孢菌株的獲得為紫芝的雜交育種提供了育種材料，同時也為紫芝的遺傳學(xué)分析打下基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種紫芝擔孢子萌發(fā)的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)紫芝擔孢子收集用于萌發(fā)的紫芝擔孢子應(yīng)選擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待紫芝菌蓋分化形成， 菌蓋未完全呈紫色、邊緣O. 3-0. 8cm呈白色生長圈時收集擔孢子；采用套袋收集的方法，套袋時選用滅菌的信封內(nèi)墊一張無菌的硫酸紙，用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對著菌蓋背面，再用封條將信封固定在菌蓋上；擔孢子收集期間控制環(huán)境相對濕度80%-90%，溫度24°C _28°C，套袋收集的時間為20h_24h ；(2)紫芝擔孢子保存收集的紫芝擔孢子放在滅菌的信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度18°C _28°C、相對濕度50%-75%， 或放置在4 °C冰箱，但放置時間不超過24h ；(3)擔孢子萌發(fā)處理取收集的紫芝擔孢子，在無菌操作下用無菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有15-30個孢子即可涂布紫芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在25V _27°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔孢子萌發(fā)；使用的紫芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過濾取浸潰液，將殘渣同樣再浸潰、過濾一次，將兩次浸潰液混合，過濾去除殘渣并加水定容至IL ；所述靈芝提取液取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入IL水煮沸30min，過濾去除殘渣并加水定容至1L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紫芝擔孢子萌發(fā)的方法。本發(fā)明選擇菌蓋帶有白邊剛開始彈射孢子的紫芝子實體來收集擔孢子，通過子實體活體套袋收集擔孢子，將孢子涂布于萌發(fā)培養(yǎng)基(配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液100ml，瓊脂20g，水700ml，121℃滅菌30min)中，獲得了紫芝單核菌株。解決了實驗室條件下紫芝成熟擔孢子不易萌發(fā)，難以進行紫芝雜交育種的難題。本發(fā)明簡單易行無需用到特殊的藥品及儀器設(shè)備，普通實驗室即可通過本方法獲得所需的單核菌株用于雜交育種或紫芝的遺傳分析。
文檔編號A01G1/04GK103026902SQ201210580138
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者吳小平, 柯斌榕, 劉新銳 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)