本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及2種海參(象牙參、糙海參)的DNA條形碼分子鑒定方法。
背景技術(shù)：
海參為棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothrioider)動(dòng)物的總稱，是傳統(tǒng)的海樣食物和藥物資源，具有抗腫瘤、降血脂、促進(jìn)造血功能、提高免疫力、抗凝血等多種生物功效。不同海參品種價(jià)格差異較大，然而許多海參經(jīng)濟(jì)種類在貿(mào)易過程中缺乏清晰的種類鑒定。象牙參(Holothuria fuscopunctata)通常長6～30cm，寬0.8～10cm，全體表面灰白或黃白色，皺縮或具橫紋，有的橫向皺縮較深成槽溝狀，溝處呈黃色或棕褐色。背中部色澤較深，兩邊較淺，腹面則逐漸變?yōu)榘咨?；沿著腹面中央線常有一條明顯的縱溝，腹面具有眾多灰黑色點(diǎn)狀疣足。其骨片多為扣狀體，另有少量桌狀體、穿孔板和桿狀體等。糙海參(Holothuria scabra)體長30-40cm，寬8-10cm?？谛。诟姑?，具小形觸手20個(gè)。肛門端位，周圍有5組細(xì)疣。背面疣足小，而且數(shù)目不多；腹面管足呈疣足狀，少而稀疏。背面和腹面交界處常有一行邊緣腹側(cè)疣。沿著腹面中央線常有一條明顯的縱溝，加工后，這條溝仍很明顯。體壁厚，骨片豐富，包括桌形體和扣狀體。目前，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法非常容易受到物種本身在生長過程中環(huán)境、遺傳等諸多因素的影響；且在加工炮制過程中形態(tài)被嚴(yán)重破壞或特征消失。因此，運(yùn)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法來鑒定海參品種變得非常困難，急需建立其他行之有效的方法來對(duì)市場海參品種進(jìn)行快速鑒定。
DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶1號(hào)基因(COI)是線粒體上一段蛋白質(zhì)的編碼基因，因其變異性大，易擴(kuò)增是目前最常用的動(dòng)物DNA Barcoding。研究表明DNA條形碼可以廣泛應(yīng)用于生物的分類和鑒定，是一種簡便、高效、準(zhǔn)確的物種鑒定技術(shù)，不僅可彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的缺陷，還因其更客觀、準(zhǔn)確，突破對(duì)以往經(jīng)驗(yàn)的依賴，能夠鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種等。運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)，可以很好的對(duì)海參的品種進(jìn)行快速、有效的鑒定。
本發(fā)明提供一種快速鑒定象牙參與糙海參的方法，有利于實(shí)現(xiàn)象牙參與糙海參的快速準(zhǔn)確鑒定，縮短鑒定時(shí)間。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明克服目前以形態(tài)學(xué)鑒定海參方法存在的缺陷，提高象牙參與糙海參鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度，是一種易于操作、靈敏度高的鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
首先從采集的各種海參提取總DNA，利用一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增一段COI基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，然后進(jìn)行序列分析比對(duì)，建立各種海參的序列標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫DNA的基礎(chǔ)上，通過分析在特定條件下的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物結(jié)果，從而達(dá)到快速，準(zhǔn)確鑒定象牙參的目的。對(duì)需要鑒定的海參樣品，提取其總DNA，在給定的條件下，用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果，然后測序，根據(jù)序列比對(duì)可以鑒別出象牙參與糙海參。本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于鑒別象牙參與糙海參的分子鑒定方法，采用如下步驟：
1、提取海參總DNA按海洋動(dòng)物DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到50ng/μl。
2、擴(kuò)增DNA片段，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即用特異的引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物對(duì)序列為
COIef2：5’-ATGATAGGAGCCCCAGAC-3’；
COIer2：5’-TGGTTTACGCAATGGTAG-3’；
擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2分鐘94℃預(yù)變性30秒，48℃退火35秒，72℃延伸45秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。
3、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA marker檢測PCR片段大小。
4、鑒定結(jié)果的判斷：若出現(xiàn)明顯清晰的580bp大小的條帶，且無雜帶，則可送生物公司測序。
5、將測序結(jié)果進(jìn)行手工校對(duì)、序列拼接，如果與所述基因序列SEQ ID NO.1同源性在99％以上，即可判斷所述的待測組織即為象牙參；如果與所述基因序列SEQ ID NO.2的同源性在99％以上，即可判斷所述的待測組織即為糙海參。
其中，所述的海參DNA條形碼分子鑒定方法采用的是天根海洋動(dòng)物DNA提取試劑盒。
所述引物：
正向引物為COIef2：5’-ATGATAGGAGCCCCAGAC-3’；
反向引物為COIer2：5’-TGGTTTACGCAATGGTAG-3’
所使用的DNA聚合酶為TAKARA Taq酶。
所述的電泳為1％-2％的瓊脂糖凝膠電泳。
所述的條帶大小需要用DNA maker檢測。
所述的DNA序列拼接軟件包括CodonCode Aligner、Sequencher、Genious、DNA star等軟件。
與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列有利于實(shí)現(xiàn)象牙參與糙海參的分子鑒定。
附圖說明
圖1瓊脂糖凝膠電泳，是用COI引物擴(kuò)增海參的電泳檢測圖譜，其中泳道M為DNA Marker，泳道N1為陰性對(duì)照，泳道M1～M3為依次為樣品M1，M2，M3。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1：
1、海參標(biāo)本的采集：M1-象牙參干品；M2-糙海參干品；M3-隨機(jī)市場收集海參樣品
2、試驗(yàn)樣品的前處理：第一步，先將海參酒精保存樣品中的酒精置換和干海參樣品浸發(fā)，使用溶液均為PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，pH 7.2)第二步，取50-80mg經(jīng)上步處理的樣品，在800-1000μl高鹽緩沖液(200mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，0.2％β-巰基乙醇，pH 8.0)中剪碎樣品，10000-12000g/min離心1-2min，棄上清液；重復(fù)操作2次。蛋白酶K 65℃溫浴1小時(shí)，至組織完全溶解。加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1)混勻，15，000×g室溫離心10分鐘，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。
3、DNA模板制備：采用天根生物公司的海洋動(dòng)物DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到50ng/μl。
4、引物合成：本實(shí)施例所用引物如下：
正向引物COIef2：5’-ATGATAGGAGCCCCAGAC-3’；
反向引物COIer2：5’-TGGTTTACGCAATGGTAG-3’
5、PCR擴(kuò)增本實(shí)施例的PCR反應(yīng)體系如下
PCR反應(yīng)體系為50μl：
ddH2O 37.6uL，10×PCR Buffer 5uL，dNTP 4uL，Taq酶0.4uL，正向引物/反向引物(10uM)各1uL，DNA模板1uL(50ng)
擴(kuò)增程序：為94℃預(yù)變性2分鐘94℃預(yù)變性30秒，48℃退火35秒，72℃延伸45秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。
6、瓊脂糖電泳驗(yàn)證PCR結(jié)果瓊脂糖電泳顯示M1，M2，M3樣品擴(kuò)增良好，條帶清晰無雜質(zhì)，可直接送測序公司進(jìn)行測序。
7、測序結(jié)果序列拼接將測序結(jié)果用CodonCode Aligner生物軟件，將序列導(dǎo)入，將引物剪切后將序列組裝，然后跟SEQ ID NO.1進(jìn)行比對(duì)，M1與跟SEQ ID NO.1同源率100％，為象牙參。M2與跟SEQ ID NO.2同源率100％，為糙海參；M3序列與SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2均差異顯著，與NCBI網(wǎng)站進(jìn)行(網(wǎng)址https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)為馬刺參。
本發(fā)明所闡述的實(shí)施例并不是對(duì)本發(fā)明的限定，上述實(shí)施例和說明書中描述的僅為本發(fā)明的優(yōu)選例，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段可以預(yù)見或者微調(diào)的變化和改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。