本發(fā)明涉及生物檢測鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于鑒定米象和玉米象的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

米象和玉米象同屬鞘翅目象甲科米象屬，是該屬中分布最廣、為害最嚴(yán)重、經(jīng)濟(jì)意義最大的兩種倉儲(chǔ)害蟲?，F(xiàn)有研究表明，米象和玉米象在我國各地均有分布，其幼蟲和成蟲可危害谷物、豆類、油料等多種農(nóng)產(chǎn)品與其加工產(chǎn)品，大量發(fā)生時(shí)能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是毀滅性儲(chǔ)糧害蟲。近年來研究發(fā)現(xiàn)，米象和玉米象在生活習(xí)性上有很多區(qū)別。例如，玉米象的耐寒力顯著強(qiáng)于米象，表明低溫殺蟲技術(shù)對米象的防治效果好，而對玉米象無效。此外，在生殖力、野外生存能力、對藥劑抗性遺傳等方面也存在著顯著差異。因此，快速識別害蟲種類，對于合理選擇防治措施具有重要的意義。然而，米象和玉米象的外部形態(tài)非常相似，目前還沒有公認(rèn)的外部形態(tài)特征對兩種害蟲進(jìn)行分類鑒定，只能依靠解剖成蟲的外生殖器進(jìn)行鑒別，這就對鑒定人員的技術(shù)提出了較高的要求，不能滿足快速、準(zhǔn)確鑒定的需求。

目前未見有關(guān)米象和玉米象的分子鑒定方法研究，而通過傳統(tǒng)的分子檢測方法，利用DNA測序技術(shù)雖然能夠準(zhǔn)確鑒定，但一方面測序成本比較高，另一方面測序過程所需時(shí)間周期比較長，達(dá)不到快速的要求。因此目前需要盡快建立一套快速靈敏的鑒定檢測方法，以便對米象和玉米象作出準(zhǔn)確、快速的鑒定，從而為害蟲防治技術(shù)的合理選擇提供依據(jù)，確保我國儲(chǔ)糧安全。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種用于鑒定米象和玉米象的試劑盒，所述試劑盒包括以下兩對引物對中的至少一對：引物對1由序列1和序列2兩條單鏈脫氧核糖核酸組成，序列1：5’-TTGATTACTTCCACCCTCC-3’，序列2：5’-AAGTATAGTGATTGCTCCT-3’；引物對2由序列3和序列4兩條單鏈脫氧核糖核酸組成,序列3：5’-TTATTAGTTACGAAAGAGGA-3’序列4：5’-ATCAAAGGGATGTAGGAGAA-3’；所述序列1由20個(gè)核苷酸組成，序列2由20個(gè)核苷酸組成，序列3由19個(gè)核苷酸組成；序列4由19個(gè)核苷酸組成。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、脫氧核糖核酸聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸。

進(jìn)一步地，所述引物對1和引物對2中的兩條單鏈脫氧核糖核酸的摩爾數(shù)相等。

進(jìn)一步地，所述引物對1特異于米象，引物對2特異于玉米象。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒應(yīng)用于鑒定米象和玉米象的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)提取米象或玉米象的基因組脫氧核糖核酸，將提取的脫氧核糖核酸置于-20℃下，備用；

(2)以步驟(1)中備用的脫氧核糖核酸為模板，分別對引物對1和引物對2進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即可得到相應(yīng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像分析。

進(jìn)一步地，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系由2.5μL的濃度為2.5mmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸，0.2μL的濃度為2.5U/μL的脫氧核糖核酸聚合酶，1μL的基因組脫氧核糖核酸，16.8μL的雙蒸水，1μL的濃度為10μmol/L的引物對，2.5μL含鎂離子的緩沖液組成。

進(jìn)一步地，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s；引物對1在60℃的條件下退火30s，引物對2在58℃的條件下退火30s；72℃延伸1min；將此過程進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所達(dá)到的有益效果：

(1)本發(fā)明中針對米象和玉米象這2種外觀特征極為相似的常見害蟲，基于mtDNA COⅠ基因序列分別設(shè)計(jì)了特異引物，可直接鑒別以上2種倉儲(chǔ)害蟲，從而為害蟲防治技術(shù)的合理選擇提供依據(jù)，確保我國儲(chǔ)糧安全。

(2)本發(fā)明中的鑒定方法與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法相比，該方法不需要形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)且實(shí)現(xiàn)了對非成蟲態(tài)的鑒定；該技術(shù)通用性強(qiáng)，對儀器設(shè)備要求不高，因此在實(shí)際工作中容易推廣和應(yīng)用；

(3)本發(fā)明中的鑒定方法在實(shí)際鑒定過程中，耗時(shí)較短，便于操作，并且該方法還具有靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，因此，該鑒定方法適合在生物鑒定領(lǐng)域推廣和應(yīng)用。

附圖說明

以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1是本發(fā)明中引物對1擴(kuò)增米象和玉米象的電泳檢測圖譜；

圖2是本發(fā)明中引物對2擴(kuò)增米象和玉米象的電泳檢測圖譜。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明通過在GenBank中搜索查詢米象和玉米象的mtDNA COⅠ序列，用DNAMAN軟件對目標(biāo)種的mtDNA COⅠ序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則及注意事項(xiàng)，利用Primer Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件在米象和玉米象的mtDNA COⅠ序列內(nèi)設(shè)計(jì)特異引物，并用Oligo6.71軟件對引物進(jìn)行評價(jià)和修改，檢查引物Tm值、GC％、錯(cuò)配、二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，以避免存在引物內(nèi)或引物間二聚體以及引物錯(cuò)配位點(diǎn)的出現(xiàn)等，最終設(shè)計(jì)出2對引物，如表1所示。

表1本研究設(shè)計(jì)的2對引物序列

實(shí)施例1

一種用于鑒定米象和玉米象的試劑盒，所述試劑盒包括由序列1和序列2兩條單鏈DNA組成的引物對1，序列1：5’-TTGATTACTTCCACCCTCC-3’，序列2：5’-AAGTATAGTGATTGCTCCT-3’；所述序列1由20個(gè)核苷酸組成，序列2由20個(gè)核苷酸組成。

在本實(shí)施例中，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸。

在本實(shí)施例中，所述引物對1特異于米象，。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒應(yīng)用于鑒定米象和玉米象的方法，具體步驟如下：

(1)分別提取米象和玉米象的基因組DNA后，將提取的米象和玉米象的基因組DNA置于-20℃下，備用；

(2)分別以步驟(1)中備用的米象和玉米象的基因組DNA為模板，對引物對1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像分析。

在本實(shí)施例中，PCR反應(yīng)體系由2.5μL的濃度為2.5mmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸，0.2μL濃度為2.5U/μL的DNA聚合酶，1μL的基因組DNA，16.8μL的雙蒸水，1μL的濃度為10μmol/L的引物對，2.5μL含鎂離子的緩沖液組成。

在本實(shí)施例中，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；將此過程進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例2

一種用于鑒定米象和玉米象的試劑盒，所述試劑盒包括由序列3和序列4兩條單鏈DNA組成引物對2，序列3：5’-TTATTAGTTACGAAAGAGGA-3’序列4：5’-ATCAAAGGGATGTAGGAGAA-3’；序列3由19個(gè)核苷酸組成；序列4由19個(gè)核苷酸組成。

在本實(shí)施例中，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸。

在本實(shí)施例中，引物對2特異于玉米象。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒應(yīng)用于鑒定米象和玉米象的方法，具體步驟如下：

(1)分別提取米象和玉米象的基因組DNA后，將提取的米象和玉米象的基因組DNA置于-20℃下，備用；

(2)分別以步驟(1)中備用的米象和玉米象的基因組DNA為模板，對引物對2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像分析。

在本實(shí)施例中，PCR反應(yīng)體系由2.5μL的濃度為2.5mmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸，0.2μL的濃度為2.5U/μL的DNA聚合酶，1μL的基因組DNA，16.8μL的雙蒸水，1μL的濃度為10μmol/L的引物對，2.5μL含鎂離子的緩沖液組成。

在本實(shí)施例中，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min；將此過程進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

將實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，其中，泳道1-3號為米象，4-6號為玉米象，7號為陰性對照(ddH₂O)，M為Marker DL 2000。引物對1得到322bp的PCR產(chǎn)物，而引物對2沒有PCR產(chǎn)物，說明引物對1可用于特異鑒定米象。

將實(shí)施例2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，其中，泳道1-3號為米象，4-6號為玉米象，7號為陰性對照(ddH2O)，M為Marker DL 2000。引物對2得到252bp的PCR產(chǎn)物，而引物對1沒有PCR產(chǎn)物，說明引物對2可用于特異鑒定玉米象。

綜上所述，上述實(shí)施方式并非是本發(fā)明的限制性實(shí)施方式，凡本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的基礎(chǔ)上所進(jìn)行的修飾或者等效變形，均在本發(fā)明的技術(shù)范疇。